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文档简介

细胞传代培养及细胞计数人癌细胞系传代培养 1. 观察： 培养细胞生长活跃，占瓶底 80%-90%，无污染； 2.弃废液： 倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； 3. 漂洗： 加 1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗 1次 ,弃去消化液； 4. 消化： 再加 1ml消化液漂洗 1次 ,倒掉大部分消化液 , 保留约 0.3ml,室温放置 3 5min； 5. 吹打： 镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 2ml含血清培养液 , 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数： 取样 ,计数 ,调整细胞浓度； 7. 接种及培养： 按 104 细胞 /ml接种 ,37 、 5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。注意事项 细胞生长至覆盖培养瓶底面积 80%左右时,开始传代。 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 细胞混杂生长时 , 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。 血球计数板法 制备细胞悬液： 细胞密度 104/ml, 细胞过多时需适当稀释 ,单个细胞率 95%。 加样： 混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。 计数： 10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。 计算： 细胞数 /ml=（四大格细胞总数 4） 10 4 稀释倍数细胞活力测定台盼蓝染色法 制备单个细胞悬液： 105 106 ml 染色： 0.04%台盼蓝染色 1 min (9滴细胞悬液 1滴 0.4%台盼蓝 )， 3min 内计数 计数： 用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力：活细胞率（）活细胞数（活细胞数死细胞数） 100细胞密度调整 稀释公式： C1V1 C2V2稀释前细胞密度 C1，溶液体积 V1稀释后细胞密度 C2，溶液体积 V2细胞计数106/mlCellsusspension105/ml 104/ml 103/ml0.1ml 0.1ml 0.1mlMedium 0.9ml细胞生长曲线测定计数法DT = t lg2 (lgNt lgNo)培养细胞的纯化方法 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度，Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷细胞培养过程中常见的问题 培养液 pH值快速偏离 ： CO2浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染 培养液出现沉淀 ： 细菌或霉菌污染 细胞不贴壁 ： 胰酶过度消化细胞 ，支原体污染 ，缺乏附着因子 细胞死亡 ： 孵箱中缺 CO2 ， 孵箱温度不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积 细胞生长缓慢 ： 培养液或血清改变 ，基本促生
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