sagetech-上海华冠生物芯片有限公司

SAGE技术在基因表达谱研究中的应用技术在基因表达谱研究中的应用上海华冠生物芯片有限公司(国家人类基因组南方研究中心 )上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.CATG SAGE Tag AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAverage 256 base pairsSAGE技术的理论基础首先，一段来自于任一转录本特定区域的 “标签 ” (Tag)， 即长度仅 10 14bp的短核苷酸序列，就已包含了足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个 10碱基的序列能有 410=1048576种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码 80000种转录本，因此在理论上每一个 10碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。将短片段两两随机配对，形成双标签体 (Ditag)，在标签的种类、数量极大丰富的情况下，完全相同的双标签体出现的概率趋近于零。将这些双标签体相互连接、集中形成长的 DNA分子，对其进行测序将能得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理。这样就可对数以千计的 mRNA转录本进行批量分析。而在数据处理时将重复出现的双标签体剔除，即可避免由于 PCR反应的非均一化扩增而引入的数据偏差；同时，各转录本的表达水平也就可以用特定标签被测得的次数来进行精确定量了。CATGSAGE Tag 3SAGE Tag 4SAGE Tag 1SAGE Tag 2CATGSAGE Tag 5SAGE Tag 6SAGE技术的理论基础上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.CATG上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.CATG AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTGTACAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTCATGAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTCATGBSAGE技术的实验流程SAGE技术的实验流程AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTCATGAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTCATGBCATGA BGTACCATGA BGTACCATGGTACCATGSAGE Tag 3SAGE Tag 4SAGE Tag 1SAGE Tag 2CATGSAGE Tag 5SAGE Tag 6CATG上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.相关技术的比较方法 EST法 芯片 / 微阵列法 SAGE法通量 较低 可高可低 高操作简便性简单易操作，但需大规模测序支持技术难度高，需专门点样、扫描等硬件设备支持技术难度高，需大规模测序支持可定量性 不可定量 可定量 可定量灵敏度精确度 较低 较高 高检测基因是否已知已知、未知均有，可用于发现新基因通常为检测已知基因已知、未知均有，可用于发现新基因上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE技术的应用正常细胞或组织基因表达谱研究疾病相关基因表达研究染色体表达图谱绘制基因功能研究药物作用机制的研究毒理学研究 寻找新的基因上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE技术的应用Owing to the low level of expression, the novel transcripts are difficult to identify using the EST approach but they have been detected as novel SAGE tags using the sensitive SAGE technique. And 65 of them are derived from novel transcripts.Certification:The error rate for SAGE tags is 2% per tag.These novel transcripts are not only present in some rare cell types but also in many common tissues.The majority of genes in the human genome are expressed at low levels.* New opinion (by San Ming Wang, 2003) Number of GenesLevel of ExpressionEST技术检测水平SAGE技术检测水平上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE技术的优点和缺点l 较全面获取生物的基因表达信息，l 对基因序列没有选择性l 所需的样品量极少 (100 ng mRNA)l SAGE技术具有较好的重复性l 发现新基因l 设备简单l 同表达谱芯片技术具有互补性和挑战性l 成本较高，方法较复杂l 10 bp序列表征基因尚有缺陷上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE技术的发展鉴于 SAGE文库中的 Tag序列仅 10个碱基，即使加上 4个碱基的特定锚定酶切位点也就共 14个碱基，在实际研究工作中其特异性尚有欠缺、包含的信息量较少，不便于后续工作，因此其相应的补充性、改良性技术也颇引人注目：GLGI技术：即 Generation of Longer cDNA fragments from SAGE tags for Gene Identification， 通过 PCR技术将 10碱基的 SAGE tag延伸至平均约 250bp长的 3EST序列，用于验证 SAGE结果、以及对未知基因的进一步研究。CATG SAGE Tag AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAverage 256 base pairs General Prime A上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE技术的发展LongSAGE技术：即通过改变限制性内切酶及其相应的 DNA识别位点，将普通 SAGE tag的（ 10 4）长度扩大至（ 17 4），这样其特异性相应提高，且可作为探针直接从 cDNA文库中筛选出带有目标基因的克隆。其不足之处在于：测序量和成本亦相应提高。CATG LongSAGE Tag AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAverage 256 base pairs上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE分析软件上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE结果分析上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE结果分析上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE结果分析上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.SAGE结果分析Bin FrequencyProgressiveFrequency0 189 1890.000001 0 1890.000005 6 1950.00001 11 2060.00005 45 2510.0001 16 2670.0005 64 3310.001 56 3870.005 163 5500.01 95 6450.05 517 11620.1 509 16710.5 5884 75551.0 740 8295More 0 8295Total 8295 上海华冠生物芯片有限公司Shanghai HuaGuan Biochip Co., Ltd.本公司 SAGE技术服务项目现况l 目前，国内首家能够进行成熟而稳定的 SAGE技术服务市场化运作的企业。l 现有的客户主要为中国科学院上海生命科学研究院下属成员单位以及张江高科技园区内的一些科研单位。l 已有 20余个 SAGE及 1个 LongSAGE案例的成功经验，样本涉及下列多个物种的群体、个体、胚胎，器官、组织和细胞等：人（人（ Homo sapiens） 大鼠（大鼠（ Rattus norvegicus）小鼠（小鼠（ Mus musculus） 家蚕（家蚕（ Bombyx mori）水稻（水稻（ Oryza sativa） 棉花（棉花（ Gossypium hir