凝胶过滤层析

凝胶过滤层析凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC定义n 凝胶过滤层析是生化分离常用凝胶过滤层析是生化分离常用 色谱技术色谱技术 的一种。的一种。n 利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的 分子筛分子筛 作用作用 ,根据被分离根据被分离物质的物质的 分子大小不同分子大小不同 来进行分离，也被称为体积排阻来进行分离，也被称为体积排阻层析（层析（ size exclusion chromatography）、分子筛）、分子筛层析（层析（ Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗）、凝胶渗透层析（透层析（ Gel Permeation Chromatography）应用l 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。肽、激素、多糖、核酸类等物质。l 分子大小彼此相差分子大小彼此相差 25%的样品，只要通过单一的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。凝胶床就可以完全将它们分开。l 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行进行 脱盐、去热源和脱色脱盐、去热源和脱色 。原理n 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。个颗粒犹如一个筛子。n 当样品溶液通过凝胶柱时，当样品溶液通过凝胶柱时， 相对分子相对分子质量较大质量较大 的物质沿着凝胶颗粒间的孔的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；n 相对分子质量较小相对分子质量较小 的物质可自由地进的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。动速率慢而最后流出层析柱。n 中等大小的分子中等大小的分子 在大分子物质与小分在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。子物质之间被洗脱。n 这样，经过层析柱，混合物中的各物这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。质按其分子大小不同而被分离。带网孔的葡聚糖珠小 分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出固定相（凝胶）n 三维空间网状结构样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较 快流出分子筛效应分子筛效应 ：按分子大小不同按分子大小不同 ,在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用阻滞作用 有差异有差异 ,从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。胶柱中的迁移速度不同得到分离。基本概念n 外水体积外水体积 (Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。间液体流动相的体积。n 内水体积内水体积 (Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。是指凝胶颗粒中孔穴的体积。n 基质体积基质体积 (Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。是指凝胶颗粒实际骨架体积。n 柱床体积柱床体积 (Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。就是指凝胶柱所能容纳的总体积。n 洗脱体积洗脱体积 (Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（ Kd）Ve=Vo+KdVi(2)Ve = Vo + Vi， Kd = 1n分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部扩散n在两相分配的比值为 1,最后流出(1)Ve = Vo， Kd = 0n分子完全被排阻于凝胶颗粒之外n全部分布于流动相里n最先流出(3) 0 Kd 1， Ve = Vo +ViKdn为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散n 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数特点： 与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关Kd=0 0 Kd1 Kd=1洗脱体积洗脱体积小分子量大分子量典型的凝胶类型n 交联葡聚糖凝胶： Sephadexn 聚丙烯酰胺凝胶： Sephacryl n 琼脂糖凝胶： Sepharose和 Bio-Geln 其它：有机凝胶 Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（ Sephadex）具有）具有良好的化学稳定性，是目前生良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中化产品制备中 最常用最常用 的凝胶。的凝胶。 基本骨架：葡聚糖（基本骨架：葡聚糖（ dextran）;交联剂：交联剂： 3-氯氯 -1 ,2-环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构聚合而成的三维空间网状结构 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大膨胀就越大Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 700 DG15 1,500G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000交联葡聚糖凝胶的化学结构 葡聚糖凝胶1 理化性质n 葡聚糖凝胶的外观为 白色珠状颗粒 。n 它带有大量的 羟基 ， 亲水性好 ，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀 。n 由于 各种型号 的葡聚糖凝胶的 交联度 不同，致使如下 理化性质 在水中的有明显的差异：膨胀度 (床体积 )吸水量 (每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量 ) 筛孔的大小分级范围n 葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样分类n 以 G型 葡聚糖凝胶 (经水溶液膨胀 )作为固定相，以 水溶液作为流动相，对 水溶性 物质 进行分离的层析方法称为 葡聚糖凝胶 过滤 层析 。n 以 LH型 葡聚糖凝胶 (经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或 N、 N-二甲基甲酰胺等 有机溶剂膨胀 )作为固定相，以 有机溶剂 为流动相，对 脂溶性 物质 进行分离的层析方法称为 葡聚糖凝胶 渗透 层析 。 2 稳定性 n 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是 稳定 的、 不溶解 的，而且 很少产生化学 降解 。n 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置 高温 (120) 消毒 0.5h， 其性质并不改变。n 在 0.1mol L HCl溶液中浸泡 12h， 甚至在 0.02mol L HCI溶液中浸泡 6个月以上，对分离效果无明显的影响。n 当暴露于 强酸或氧化剂 溶液时，则容易使 糖苷键水解断裂 ，因此，要避免与其接触。n 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的 防腐剂 如氯仿、 0.05 NaN3或 20乙醇等，不然微生物将生长。3 吸附性 n 葡聚糖凝胶系葡聚糖凝胶系 弱酸性弱酸性 物质，这是由于其每克干胶中含物质，这是由于其每克干胶中含10-20g 当量的当量的 羧基基团羧基基团 所致。所致。n 羧基基团羧基基团 能与分离物中能与分离物中 电荷基团电荷基团 (尤其是尤其是 碱性碱性 蛋白质蛋白质)发生发生 吸附吸附 作用作用 。n 这种吸附作用可以借助这种吸附作用可以借助 提高提高 洗脱液的洗脱液的 离子强度离子强度 得以克得以克服。服。当离子强度大于当离子强度大于 0.05时时 ，一般对弱碱性蛋白质就，一般对弱碱性蛋白质就 无无吸附力吸附力 了。了。因此，常用含有因此，常用含有 NaCl的缓冲液的缓冲液 作作 洗脱液洗脱液 。 琼脂糖凝胶（商品名为 Sepharose)n 琼脂糖是从琼脂糖是从 琼脂琼脂 中分离出来的。中分离出来的。n 在制备过程要将其中含在制备过程要将其中含 硫酸根硫酸根 和和 羧基基团羧基基团 的的 琼脂胶琼脂胶 除除去，得到不带电荷基团的去，得到不带电荷基团的 琼脂糖琼脂糖 。n 琼脂糖是由琼脂糖是由 D-半乳糖半乳糖 和和 3、 6脱水的脱水的 L-半乳糖半乳糖 连接构成连接构成的的 多糖链多糖链 。n 这种多糖链在这种多糖链在 100 左右时呈液态，当温度下降到左右时呈液态，当温度下降到45 以下以下 时呈固态。时呈固态。n 它们之间以它们之间以 氢键氢键 方式相互连接就成了方式相互连接就成了 线性的双链单环线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即的琼脂糖，经凝聚即 呈束状呈束状 的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。 n 该物质对该物质对 尿素和盐酸胍尿素和盐酸胍 等破坏氢键的试剂有较强的抵等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在抗力，在 pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。的缓冲液中是稳定的。n 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。胺和葡聚糖凝胶。n 琼脂糖凝胶在琼脂糖凝胶在 干燥状态干燥状态 下保存时下保存时 易破裂易破裂 ，故一般存放，故一般存放在在 含防腐剂的水溶液含防腐剂的水溶液 中，同时还要避免剧烈的搅动。中，同时还要避免剧烈的搅动。n 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 按其浓度按其浓度 来分有来分有 Sepharose 2B(2 )、4B(4 )和和 6B(6 )。Sepharose 6B的机械强度大于的机械强度大于 2B， 但是筛孔小于但是筛孔小于2B。n 琼脂糖凝胶的 机械强度 和 筛孔的稳定性 都比葡聚糖凝胶 好 。用琼脂糖凝胶进行柱层析时， 流速可以快些 。n 大孔凝胶， 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限n 可分离 MW40万以上 的物质n 可用来分离核酸及病毒三、聚丙烯酰胺凝胶n 聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为 Bio-gel。n 它是以 甲撑双丙烯酰胺 (双体 )作 交联剂 ，以过硫酸铵 作 催化剂 ，在 N,N,N,N,- 四甲基乙二胺 (TEMED)加速剂 的作用下，将 丙烯酰胺 (单体 )聚合而成的。n 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。 凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择2、凝胶的预处理3、装柱4、样品的准备5、上样6、洗脱和收集7、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择n 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的 分离范围 （渗入限与排阻限）、 理化稳定性、强度、非特异吸附性质 等。n 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开 ，如蛋白质与盐类，称作 类分离或组分离 。另一类则是要将 分子量相差不很大的物质 加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做 分级分离 。后者对实验条件和操作要求都比较高。类分离n 目的是分开样品中分子量悬殊的 “ 较大分子组 ” 和 “ 较小分子组” 两类物质，并不要求分离分子量相近的组分n 选择凝胶时，应使样品中 大分子组的分子量大于其排阻限 ，而 小分子组的分子量小于渗入限 。也就是说大分子的分配系数 Kd=0，小分子的 Kd 1。这样能取得最好的分离效果。例题：从某蛋白质溶液（ MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？B. Sephadex G-25（分级范围， 1000-5000 D）A. Sephadex G-15（分级范围， 1,500 D）C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）凝胶粒度的影响n 凝胶粒度的大小 对分离效果有直接的影响。一般来说， 细粒 凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于 精制分离或分析 等。 粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于 粗制分离，脱盐等。n 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在 70m 左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在 150m 左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的 Sephadex G-25柱的洗脱效果2、凝胶的预处理n 溶胀 ： 称取适量凝胶干粉，用约 10倍蒸馏水浸泡 24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近 100 ，保持数个小时。根据干凝胶的 填充体积 计算所需的干凝胶量n 平衡 ： 用 起始缓冲液 浸泡凝胶，直至凝胶液 pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）3、装柱n 一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高50cm比较合适；分级分离时，比较合适；分级分离时， 100cm较为合适较为合适n 具体步骤为：具体步骤为：l 将层析柱将层析柱 垂直固定垂直固定 ，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约 1/3高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液 排走空排走空气气 ；l 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至 1/4-1/3高时打开高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。l 用用 3-5倍柱床体积的倍柱床体积的 起始缓冲液起始缓冲液 走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分 平衡平衡 ，柱床稳定（，柱床稳定（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。层析柱（ a）自制简易层祈柱（ 1玻璃管； 2.橡皮塞； 3尼龙网）；（ b）普通商品柱；（ c）双底板层析柱（ 1.洗脱液进出口； 2.多孔底板； 3柱床； 4恒温水进口； 5恒温水出口；6可调节的塞子） 4、样品的准备p 样品的 粘度 ：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度 小于0.01Pasp 样品的 浓度 ：样品浓度以 不大于 4 为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱p 样品的 体积 ：分析用量一般应 低于总柱体积的 5%，制备用量一般为15%或更多（ 20-30%） 。样品黏度对洗脱曲线的影响（ 1）加葡萄糖 2 000，使终浓度为 5%，相对粘度11.8;（ 2）加葡萄糖 2 000，使终浓度为 2.5%，相对粘度 4.2; （ 3）加葡萄糖 2 000，使终浓度为 1%. 5、上样p 具体步骤为：p 打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面p 沿柱壁缓慢 加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁p 加样时应尽量 减少凝胶床面的搅动 。 加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制