cp与植物和昆虫互作的研究

RSV CP与植物和昆虫互作的研究赵淑玲2008. 12. 6研究背景研究内容研究方法特色及创新处研究计划及预期成果RSV引起的病症病症： 水稻条纹病毒 (Rice stripe virus, RSV)是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒靠灰飞虱传播。症状： 感病水稻发病初期叶片沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成褪绿大片。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。水稻条纹叶枯病最早于 1897年在日本发现 ,在我国自 1963年在苏南地区始发后 ,已经扩散到18个省市 ,特别是自 2001年来在江苏和河南连续暴发 ,造成了水稻生产上的巨大损失。因此如何防止病害发生和控制病害流行成为研究者迫切希望解决的问题。RSV的危害RSV基因组结构和功能RNA1RdRpRNA2RNA3NS2 NSvc2NS3 CPRNA4SP MPRdRp: RNA聚合酶NSvc2: 推测为糖蛋白NS3： RNA沉默抑制子CP： 外壳蛋白SP： 症状相关蛋白MP: 移动蛋白3506 nts2472 nts2137 nts8970 ntsRSV 研究情况 初步研究的方面基因组序列、某些基因功能转基因的抗病毒植物 还需研究的方面基因功能病毒的致病机理病毒的传播机制深入研究难点 RSV的侵染性克隆难以建立 灰飞虱细胞系还未建立立项依据及研究意义 RSV与宿主互作研究的重要性 研究的创新性 结合实验条件研究内容 CP与水稻的互作 构建水稻 cDNA文库 筛选 cDNA文库中与 CP互作的蛋白 蛋白功能分析cDNA 文库：生物某发育时期所转录的全部 mRNA经反转录形成的 cDNA片段集合。测序、序列比对，分析基因功能。方法：酵母双杂交系统 NSvc2蛋白是否为病毒传播必需 CP、 NSvc2蛋白是否存在相互作用 NSvc2蛋白是否具有膜融合功能酵母双杂交系统验证蛋白间的互作利用杆状病毒表达系统使目的蛋白展示在细胞膜上，然后研究膜融合功能 CP、 NSvc2蛋白与昆虫细胞的互作u 水稻 cDNA 文库构建研究方法总 RNAmRNA的分离AAAATT TTmRNAcDNAcDNA第一链合成AAAATT TTcDNA第二链合成AAAA5AAAATT TT加接头，连接载体构建 cDNA文库Oligo(dT)纤维柱分离逆转录RNaseHDNA polymerase DNA ligase重组载体感染宿主菌u 酵母双杂交系统l 酵母激活因子 GAL4由 N端的 DNA结合域 (BD)和 C端的转录激活域 (AD)组成。 GAL4分子的 DNA结合域可以和上游激活序列结合，而转录激活域则能激活下游的基因进行转录。只有 BD和 AD共同存在形成复合体时才能激活下游基因转录。l 在酵母双杂交系统中，编码这两个结构域的 DNA片段分别被构建在两个独立的表达载体上，一个表达载体含有 BD基因片段与已知蛋白形成的融合基因，另一载体含 AD基因片段与未知 cDNA形成的融合基因。若两种蛋白间互作便会形成复合体，启动报告基因的表达 BD X COOHGal4NH2+cDNA libraryCOOHcDNAADGal4NH2 共 转化ADGal4?BD XPromoter LacZ ReporterPromoter LacZ ReporterBDX? AD酵母双杂交系统原理酵母双杂交基本过程蛋白细胞膜表面表达载体构建NSvc2蛋白前端连接 gp64的信号肽序列，后端连接 VSV G蛋白的跨膜结构域， 这样 NSvc2蛋白表达后便成功展现在了昆虫细胞膜上 gp64 sp cp/NSvc2 VSV G tm目的蛋白信号肽跨膜域杆状病毒表达系统表达蛋白细胞膜融合功能的研究 目的蛋白在细胞膜表面的表达检测抗体标记 TRITC， TRITC是一种荧光素，用激光共聚焦显微镜观察则细胞的表面出现橙红色荧光。 目的蛋白膜融合功能检测细胞低 pH条件下诱导，然后观察细胞融合 的。pH shift time 0 +4h +7h本研究创新点RSV与宿主相互作用的研究还未有报道 首开了 RSV侵染介体昆虫机理的研究利用杆状病毒表达系统，使目的蛋白呈现在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能年度研究计划u 2009.1-2009.12： RSV CP与水稻的互作u 2010.1-2010.6：互作蛋白的功能分析u 2010.7-2011.6： RSV侵染昆虫细胞机制研究预期研究成果构建水