dna重排的检测方法

DNA重排的检测方法马欣荣 高方远 康海歧一、形态学观察二、细胞遗传学如：染色体核型分析、染色体显带等三、分子细胞遗传学如：荧光原位杂交四、分子生物学如： Southern杂交， PCR及相关技术等一、 形态学观察例子： 上个世纪 40年代科学家 B McClintock观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。 肿瘤细胞与正常细胞肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗传结构的改变引起表型的改变。因此从形态学上可以鉴定肿瘤。二、细胞遗传学染色体核型分析、染色体显带一个物种的染色体核型及带型是稳定的1. 染色体核型分析 ：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加 常规核型分析 荧光核型分析 光谱核型分析 (Spectral karyotyping, SKY)光谱核型分析原理 (Spectral karyotyping, SKY)1996 年 Schroch等首次描述了 SKY技术。应用 5种荧光素同时标记 24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用 Fourier光谱仪， CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理， 46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。优势 ： 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它可以检测到 1.5mb 碱基的转位 一次杂交即可分辨人的 24条染色体人染色体光谱核型分析乳腺癌细胞染色体复杂的畸变2.染色体显带技术 ： C-banding 主要染异染色质 R-banding 与 C-banding 相反，主要染常染色质区域 G-banding 是 Giemsa 染色结果，产生深浅不同的条带 Q-banding 是用喹丫因（ quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与 G带相似G-带 c. 正常染色体a. 末端缺失 d. 末端倒位b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位c. G 带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、 10、 11染色体间易位，右为异常染色体三、分子细胞遗传学1. 原位杂交（ In situ hybridisation）2. 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性， 在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。3. 2. 荧光原位杂交4. Fluorescent in situ hybridisation (FISH) 5. 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察 。6. 3. 染色体涂染 (Chromosome painting)又称为多重荧光原位杂交 (multiplex-fluorescence in situ hybridisation, M-FISH) 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检测人的 24条染色体 可检测简单及复杂的染色体重排荧光原位杂交， 据标记物不同可分为： 间接法：用生物素或地高辛标记探针，通过与荧光染料结合的抗生物素或抗地高辛抗体将信号放大而进行检测。 直接法：直接用荧光素标记，如 Vysis公司的 FISH探针。荧光原位杂交原理示意荧光原位杂交过程急性骨髓白血病10、 11号染色体间易位10、 11号染色体易发生断裂的基因 (MLL)位点小麦簇毛麦 F1 代 染色体间易位染色体涂染显示人染色体组荧光标记探针 不对环境构成污染 灵敏度能得到保障 可进行多色观察分析，可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过长和技术障碍。4. 比较基因组杂交Comparative Genomic Hybridization (CGH) 原理： 在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析是由 Kallioniemi等在 1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组 DNA增加或减少的强有力的工具比较基因组杂交原理示意 肿瘤 DNA和对照 DNA在染色体上的相对结合量取决于两种 DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失等比混合比较基因组杂交过程DAPI4,6- 二联脒 -2-吲哚苯FITC异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗丹明人 染色体不同荧光素染色结果数字化图像FITC/TRITC 荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRITC应用： 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 物种间染色体同源性比较优势： 可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道 DNA发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减1. Southern-blotting 应用于基因重排检测是 1981年 Korsmeyer等首先进行的。 淋巴瘤 DNA重排 :将细胞 DNA抽提出来 ,用限制性内切酶进行酶切，胚系 DNA就会产生特征性片段。但发生过基因重排的细胞 DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的 DNA酶切片段。转膜后，与标记的 DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在 (15%），克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。四、分子生物学技术Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control 优势 ： Southern分析已被应用于 IgH、 Igk、 Igl及各种 TCR(T-细胞受体 )克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因重排检测的 “ 金标准 ” 。 局限 ： 需要较大量（ 10mg） 新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若