巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

生科院 杨军 宿主系 统 载 体系 统 转 化系 统 表达 系 统 蛋白 修 饰 与分泌系 统一、 前言二、 毕赤酵母简介三、 毕赤酵母表达系统四、 毕赤酵母表达系统优化 启动子选择 外源基因的特性 基因剂量 mRNA的非翻译区 翻译后修饰 产物的稳定性 发酵 条件五、 前景展望在 过 去的数十年中， 遗传 学家致力于 DNA的 鉴 定和基因重 组 的研究，而重 组 有机体主要 应 用于蛋白 质 的生 产 。由于一些蛋白具有巨大的商业 价 值 ，因此大多数研究致力于 寻 找能 够 高效生 产 有功能蛋白的途径。随着蛋白 质 工程和 DNA重 组 技 术 的 发 展， 诸 多有 应 用潜力的蛋白分子有待开 发 ， 不同在蛋白在不同系 统 中表达水平有 显 著差异，目前 应 用的表达系 统 包括 细 菌、酵母、 昆虫、 哺乳 动 物 细 胞等表达体系。其中酵母表达系 统 相 对 于其他表达系 统 有以下 优 点：不存在原核表达系 统 的内毒素难 以除去的 问题 ，也不存在哺乳 动 物 细 胞表达系 统 的病毒和支原体 污 染等 问题 ；并能 够对 目的蛋白 进 行 类 似高等真核生物的信号 肽 剪切、二硫键 形成、糖基化等 过 程的翻 译 后蛋白加工。在酵母表达系 统 中，巴斯德毕 赤酵母（ Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德 毕 赤酵母表达的特点和研究 进 展作一 简 要 综 述。巴斯德 毕 赤酵母是一种甲基 营 养菌，能 够在 低 廉 的甲醇培养基中生 长 ，甲醇能高效 诱导甲醇代 谢 途径中各 酶 编码 基因的 表达，因此生长 迅速 、乙醇氧化 酶 基因 AOX1所属 强 启 动 子、表达的可 诱导 性是巴斯德 毕 赤酵母表达系 统的三大 优势 。由于巴斯德 毕 赤酵母没有合适的自主复制型 载 体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体 DNA上，因此能 够稳 定遗传 。目前 已 有 500多种外源蛋白 在巴斯德 毕赤酵母系 统 中 获 得成功表达。二、巴斯德毕赤酵母简介Pichia pastoris甲醇代谢途径目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌 宿主系统l营养缺陷型 ：GS115（ his4）最常用 ，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培养基上不能生长，以此作为筛选标记 。 但由于自身合成蛋白酶对外源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题。其中 KM71和 SMD1168最常用， KM71（ his4 arg4 aox1 : : SARG）的 AOX1部分缺失，并且被 S.cerevisiae的 ARG4取代。因此 AOX1（强 启 动 子）基因不能 编码 醇氧化 酶 ，只能依靠 AOX2基因（弱启 动子） 编码 醇氧化 酶 ，因此 KM71为 甲醇利用 缓 慢型（ Muts）。l蛋白酶合成缺陷型SMD1168（ pep4:URA3 his4 ura3）由于 pep4部分缺失，不能合成蛋白 酶 A，而蛋白 酶 B和 羧肽 酶 Y由蛋白 酶 A激活，因此可以有效减少 对 外源蛋白的降解。但生 产缓 慢， 导 致蛋白 产 量上不去。载体系统由于 毕 赤酵母没有 稳 定的游离型 载 体，故 应 用整合型 载 体，通 过 同源重 组 整合到酵母染色体来 实现稳 定表达，整合位点一般是在 AOX1或 HIS4处 ，因此， 载 体上 带 有 HIS4和 AOX1基因的部分序列； 还 包括 MCS和大 肠杆菌复制所必需的元件，如复制起始位点，氨 苄 抗性基因；用于分泌表达的 载 体上 还 包括有信号 肽 序列。General diagram of a p.pastoris expression vector .YFG,Your Favorite Gene; *,sites for cassette amplificationl胞内表达型载体l 分泌表达型载体l转化程序 l重组子在酵母细胞中的命运l用于转化子筛选的基因标记主要有三种方法： 原生 质 体法：早期酵母菌的 转 化都采用在等渗 缓 冲液中稳 定的原生 质 体 转 化法，在 Ca2+和 PEG的存在下， 转 化细 胞可达原生 质 体 总 数的 1-2% ； 离子溶液法 :酵母 的完整 细 胞 经 碱金属离子（如 Li+等）、PEG、 热 休克 处 理后，也可高效吸收 质 粒 DNA。 103104个 转 化子 /g DNA； 电 穿孔法 (electroporation) ： 酵母菌原生 质 体和完整 细 胞均可在 电击 条件下吸收 质 粒 DNA。 105个 转 化子 /g DNA。导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：（ 1） 同源双交 换 ：表达 载 体 线 性化后，两端分 别为 5AOX1和3AOX1序列，与基因 组 的同源序列 发 生双交 换 后， 导 致 毕 赤酵母基因 组 内 AOX1编码 区被表达 单 元所替 换 ，胞内醇氧化 酶 只能来自 AOX2基因， 酶 活性大大降低。因此 转 化子表 现为 甲醇利用缓 慢，表型 为 Muts。（ 2） 特异性的 单 交 换 ：表达 载 体在 5AOX1或 3AOX1处线 性化后，与染色体基因 组 中的相 应 序列 发 生同源重 组 ，整合入 AOX1基因的上游或下游。由于 AOX1基因未被破坏，仍具有活性，所以 转 化子能正常利用甲醇，表型 为 Mut+，在甲醇 为 唯一碳源的培养基中正常生 长 。通常有 5%-10%转 化子出 现 多拷 贝 整合，可用重 组 子上标记 基因（如 G418）来 筛选 多拷 贝转 化子，斑点 杂 交来测 定外源基因拷 贝 数。一般情况下，整合的外源基因表达单 元的拷 贝 数越多，表达效率越高，可直接通 过 SDS-PAGE电 泳来 测 定外源蛋白表达量。此外也可利用同尾 酶体外构建多拷 贝 重 组 子。若整合 发 生在 his4位点 处 ，可能出 现 表达 单 元丢 失 现 象， 这 可能是由于基因 组 中突 变 的 his4与表达 单 元中的 his4基因之 间发 生了基因 转换 （ gene conversion）所致，所以一般 选择 AOX1位点整合。his4l用于转化子筛选的基因标记用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养缺陷型互补基因和显性基因：营养缺陷型互补基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： HIS4, ARG4（精氨酸琥珀酸裂合 酶 ） , URA3 (尿 嘧啶 合成 酶 基因）显 性 标记 基因，如 Zeocin， Blasticidin（ 灭瘟素 ）,G418l 信号肽对分泌表达效率的影响l 毕赤 酵母启动子的可控性常用的启 动 子有 诱导 型和 组 成型。诱导 型启 动 子包括： PAOX1、 PFLD1、 PICL1组 成型启 动 子： PGAP（ 1） PAOX1：是由甲醇 诱导 的 强 启 动 子，也是 毕 赤酵母表达中使用最广泛的启 动 子， AOX1基因是利用的甲醇的第一个 酶 基因，它的表达是在 转录 水平被 调 控的。具有以下 优势 ： 以甲醇作 为 唯一碳源 时 ，才能 诱导 AOX1的表达，因此可 严 密 调 控外源蛋白的表达。 可以高效表达外源蛋白。缺点：甲醇添加时间和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量储存危险性大；甲醇为石油化工原料，因此不适宜生产食用蛋白。（ 2） PFLD1： FLD（ Formaldehyde dehydrogenase）是甲 醛脱 氢 酶 基因，是甲醇代 谢 途径中的另一关 键 酶 ，同 时 参与甲胺代 谢 。 FLD1基因既可受甲醇 诱导 ，又可以受甲胺诱导 。 因此它利用甲醇或甲胺 诱导 PFLD1表达外源蛋白，当用甲胺 诱导时 ，葡萄糖或甘油可代替甲醇做 为碳源。其 严 格 调 控和 转录 效率与 PAOX1相当。Resina等 发现 用甲醇和甲胺共 诱导 PFLD1与 单纯 用甲醇 诱导 相比，外源蛋白 Rhizopus oryzae lipase（稻根霉菌脂肪 酶 ）的表达量有所提高。 （ 3） PICL1： 柠 檬酸裂合 酶 启 动 子是一种能以甲醇为 唯一碳源 诱导 型启 动 子，它能 够 在 毕 赤酵母中高效表达葡聚糖 酶 。但是，关于它能否在 毕 赤酵母中启 动 外源蛋白表达及其 诱导 表达条件， 还 需要进 一步的研究。（ 4） PGAP：是一种 组 成型表达启 动 子，不需甲醇，操作 简单 ， 诱导 外源蛋白的表达量与 PAOX1相当。但不适宜表达 对毕 赤酵母有毒性作用的蛋白。因 毕 赤酵母 只能 识别 很少的外源蛋白信号序列 ,所以更多的是利用酵母的同源信号序列 ,如来 自 毕 赤酵母的 酸性磷酸 酶 信号序列（ PHO1)和 酿 酒酵母的 交配 因子前 导肽 （ -Factor prepropeptide），其中 交配 因子前 导肽应 用最广泛。-Factor prepropeptide: 来自 酿 酒酵母，由 19个氨基酸残基的前体序列和 66个氨基酸的残基的前 导肽 序列 组 成，其中前 导肽 序列中含有三个 N-糖基化位点和一个 Kex2蛋白内切 酶 位点，是目前 应 用最成功的信号 肽 。信号 肽 结 构的改 变 可能会提高分泌 效率Antonio等 发现 ，改造 了的信号 肽 大大提高了外源蛋白表达量。用 经过 修 饰 的 人血清 白蛋白天然信号 肽 可使 HSA在 毕赤酵母中的分泌提高 几倍。Thomas 等将 编码 10个 氨基酸 连 接 肽 的序列插入 到 -Factor与 胰 岛 素前体基因之 间 ，使 胰 岛 素前体在 毕 赤酵母中的表达提高了 3倍 。 作为真核生物，毕赤酵母可以进行类似哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰，如信号肽加工，蛋白折叠，二硫键形成和糖基化修饰等 毕赤酵母中外源糖蛋白的糖基化：酵母菌中的蛋白糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网膜内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。糖基分为两种类型： O-糖基和 N-糖基。 O-寡聚多糖只有甘露糖，但许多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而且糖基化位点也存在差异。 N-寡聚多糖核与高等真核生物完全相同，但外侧链却有明显差异。而这种差异往往会导致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影响。线性化重组载体感受态菌株平板筛选 PCR鉴定与筛选MD和 MM平板筛选筛选多拷贝外源基因转化子 G418表达鉴定与筛选mRNA水平 蛋白表达水平高效表达种子工程菌发酵罐工艺建立Muts和 Mut+技术路线：l 根据启动子的特性选择甲醇 诱导 型启 动 子如 PAOX1 ，但甲醇易燃，也不适用于食品生 产 ， 这时 可 选择 PGAP,但不宜用于表达 对宿主有毒的蛋白。l 强 启 动 子可能 产 生无功能的蛋白由于超 过 宿主自身翻 译 后修 饰 加工的能力，引起蛋白的 错 折叠、不加工或 错 定位。 这 是可 选 用 较 温和的启 动 子如 PPEX8(一种 过 氧化物 酶 体基 质 蛋白启 动 子 )。启动子的选择l 目的基因的碱基 组 成基因富含 A+T，会 导 致 转录 提前 终 止l 种属特异性影响稀有密 码 子制 约 翻 译 速率此 时 需要 进 行全基因的合成，使 编码 序列符合 毕赤酵母密 码 子的偏 爱 性和具有更高的 G+C含量。目的基因特性l 相 对剂 量效 应一般情况下，随着整合拷 贝 数的增加，表达量也会增加，例如， 1-8整合拷 贝 数范 围 内， HBsAg表达量成比例升