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GM试验培训课件市场部 2014年 8月GM试验培训课件市场部 曲霉菌简介及曲霉菌感染现状GM试验的检测原理GM试验的检测步骤GM试验的注意事项及影响因素4GM试验与 G试验的联合检测56 GM试验适用的科室132Lin SJ, et al. J Clin Infect Dis, 2001, 32(3): 358-366烟曲霉 黄曲霉 黑曲霉定义:曲霉菌 (Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌,孢子较小直径 2-3um,可在空气中漂浮,可通过呼吸道进入人体。v多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病,如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等。一、曲霉菌简介(一)曲霉菌感染现状曲霉感染不容忽视Tortorano AM et al. Mycoses. 2011, 55: 7379.p 38个 ICUs of 27个意大利医院p 384 例真菌感染 (318例侵袭性念珠菌感染; 63例霉菌感染; 3例隐球菌感染 )曲霉感染 57例 毛霉菌感染 4例 镰刀菌感染 1例木霉菌感染 1例霉菌感染的比例为 16%(二)曲霉菌感染现状曲霉感染死亡率高死亡率(%)全因死亡率归因死亡率 (曲霉 )时间 (周 )二的检测原理ELISA方法简介 酶联免疫吸附测定技术 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础,将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。 曲霉菌抗原检测采用了间接竞争法。 ELISA试验操作过程由样本处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。(一)的检测原理三实验操作流程GM实验所需的仪器及耗材1. 酶标仪:必须能使用 450nm波长用于检测。2. 高速离心机:必须达到 10000g离心力以上,最好是低温离心机。3. 37 恒温培养箱(或其他可替代的恒温空气浴设备)必须设置温度为 37 ,其他温度(如35 )不可以使用,否则会影响检测值,同时要保证恒温箱的洁净。4. 沸水浴:一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可,但暂不推荐干浴5.漩涡混合仪6. 100L 和 300L 多道移液器(排枪)及配套吸头:可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机,无需用 300L 多道移液器。7. 100L 和 1000L 单道移液器及配套吸头8.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶9.封板膜:需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用10.浮漂:沸水浴使用(一)试剂盒组成v试剂盒组成:v酶标板v标准品v半乳甘露聚糖抗体v半乳甘露聚糖抗体稀释液 v酶标抗体v酶标抗体稀释液v底物溶液v终止液v封板膜v存储条件: 2-8 冷藏保存v试剂规格: 96人份 /盒(一)试剂盒组成(二) GM实验操作流程图孵育加酶标抗体加 50L终止液并读数37 ,40min37 ,20min洗板后加 100L酶标抗体37 ,60min样本检测各取 50L样本和半乳甘露聚糖抗体加入酶标板中预处理混匀, 100 水浴 3min待测样本 (300L)样本处理液 (100L)+4 , 10000g离心 10min取上清检测显色终止洗板后加 100L显色液v样本处理1.向离心管中加入 300l 待测血清。2.向离心管中加入 l00l 样本处理液 R5。3.漩涡震荡 10s以彻底混匀,将离心管放入水浴锅100 加热 3min。4.将离心管从水浴锅内取出,小心放入离心机内 ,10000r离心 10min。5.取上清液 50l 用于检测。(三) GM实验操作流程取 300L血清100L处理液+样本处理示意图沸水浴 3min1.实验前将试剂盒取出置于室温 30min2.配液:( 1)洗涤工作液:浓缩洗液稀释 20 ( l份浓缩洗液 R6加 l9份的无菌去离子水或超纯水)( 2)半乳甘露聚糖抗体工作液:半乳甘露聚糖抗体稀释 100 ( l份半乳甘露聚糖抗体 R3b加 99份的半乳甘露聚糖抗体稀释液 R3a);( 3) 酶标抗体工作液:酶标抗体 50 ( l份酶标抗体 R4b加 49份的酶标抗体稀释液 R4a);(三) GM实验操作流程3.样本混合:( 1)分别设标准曲线组、待测样本组。标准曲线组:各标准品分别取 50l 加入到酶标板孔中。待测样本组:处理后的待测样本各取 50l 分别加入到酶标板孔中。( 2)向酶标板孔中分别加入半乳甘露聚糖抗体 50l。( 3)另设空白对照 1孔,加入样本稀释液 l00l ,封上封板膜, 37 下孵育 601min 。4.洗涤酶标板:揭开封板膜,洗涤酶标板。每孔每次加入 250l的洗液,静置 2min后,将酶标板孔内的液体除去,在吸水纸上反复拍打以去除残留液体,重复上述洗涤操作,共洗涤 3次。5.加入稀释后的酶标抗体:洗涤结束后,每孔加入酶标抗体 100l 。用封板膜封板, 37 下孵育401min 。6.洗涤:同步骤 47.显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液 100l ,不用封板膜封板,在 37 下孵育 20min,避光。8.终止:每孔加入 50l 终止液,加样顺序与加入底物顺序相同,混匀后,在 OD450nm处读数。阳性: GM0.95g/L阴性: GM0.75g/L灰区: 0.75GM0.95g/L,建议连续多次检测并应结合临床资料综合评价结果判读 R2a:试验 OD值控制在 1.00.4; R2e:试验 OD值控制 在 0.40.2; 空白对照:试验 OD值控制在 0.1以下。 标准曲线: r20.96如果没有达到上述指标 , 则影响分析的可靠性,检测结果不予报告,需重新检测。 SampleBlankR2aR2bR2cR2dR2eSample质量控制GM检测曲霉的优势p 特异性高 :检测曲霉p 阴性预测值高 : GM试验阴性排除曲霉病价值高p GM检测阳性结果比临床诊断侵袭性曲霉病 提前约 6 14 天p 此外,还可以 帮助评价治疗 的有效性Singh N, Paterson DL. Clin Microbiol Rev.2005 18: 44-69四 GM试验的注意事项及影响因素(一)注意事项1.样本不能及时检测,应在适当条件下保存,并避免反复冻融。2.处理样品时应沸水浴,否则将影响结果。3.配制洗液时要混合充分,并使用无菌去离子水或超纯水。4.洗涤操作时每孔的加样量应保持一致,拍板时应确保孔内无明显液滴残留。5.保证每孔充分洗涤,避免产生泡沫,不要使用洗瓶洗涤。6.严格按说明书要求控制孵育温度及时间,不能随意变动。7.试剂盒中显色试剂 -TMB底物溶液( R8)易氧化,尽量缩短开盖时间且避免强光照射,若溶液颜色变为浅蓝色时(正常使用时应为无色),应弃用。8.终止液具腐蚀性,易发生灼伤,操作时请注意人身安全。9.各产品同时使用时,除浓缩洗液及终止液外,请勿将同一名称试剂互相替代使用。 (二) GM试验的影响因素造成 GM实验假阳性的因素主要有:1.半合成青霉素,如哌拉西林 /他唑巴坦、阿莫西林 /克拉维酸2.与其他细菌或真菌成分交叉反应3.肠道中定植的曲霉释放 GM进入血液4.谷物食物中存在 GM(如大豆),通过受损肠粘膜进入血液5.接受白蛋白、免疫球蛋白和其他营养液治疗6.血液透析7.接受心肺旁路手术8.自身免疫性肝炎等免疫性疾病9.新生儿和儿童( FP 83%,与双歧杆菌交叉反应)造成 GM实验 假阴性 的因素主要有:1.抗原过多,出现后带现象2.抗原和抗体形成免疫复合物3.释放入血的半乳甘露聚糖不持续,很快被清除4.局部感染,包括慢性肉芽肿5.菌丝少,侵血管性弱6.抗真菌药物使用(如两性霉素 B、三唑类药物),抑制菌丝生长从而减少 GM分泌7.非粒细胞缺乏患者v可能 造成 GM实验 假阴性 的因素1.曲霉菌生长和抗原释放与周围环境的营养条件和pH有关。如果营养充分, pH在 7.5,真菌可持续生长并释放 GM,但是当炎症发展时,真菌生长受到抑制, GM释放会减少。2.GM 抗原与血液中的某些物质结合遮蔽了与抗体相结合的抗原决定簇。Mennink-Kersten MA, Donnelly JP, Verweij PE. Detection of circulating galactomannan for the deagnosis and management of invisive aspergillosis. Lancet Infect,2004,4(6):349-359v可能 造成 GM实验 假阴性 的因素:3.宿主的抗真菌治疗:检测前是否进行抗真菌的治疗是关系到实验灵敏性的重要因素。Marr等对 67位患者的 986份血清进行分析,发现在未接受抗真菌治疗的患者里面 ELISA方法的敏感度可达到 80% ,而经抗真菌治疗患者的敏感度仅为 20%。Marr KA, Balajee SA, Mcl aughlin L, et al. Detection of galactomannan antigenemia by enzyme imminoassay for the diagnosis of invasive aspergillosis:variable that affect
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