基因扩增技术(pcr).

Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应 （ PCR）Polymerase chain reaction又称无细胞分子克隆系统或特异性 DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在 模板 DNA， 引物 （模板两端的已知序列）和 四种脱氧核苷酸 存在的情况下， DNA聚合酶依赖的酶促合成反应 。PCR的定义PCR技术是由 Cetus公司和加利福利亚大学 1985年联合创造的，主要贡献者为 Kary B mulis和 HeneryA、 Erlich。 可将极微量的靶 DNA特异地 扩增上百万倍，能检测每 10万个细胞 中仅含 一个 靶 DNA分子 的样品。因而发明人 Kary B、 mulis获 1993年诺贝尔化学奖。1993年获诺贝尔化学奖PCR的种类n & RT-PCRn & 反向 PCRn & 不对称 PCRn & 多重 PCRn & 巢式 RT-PCR n & 实时定量荧光 PCRPCR温度循环参数n 变性 (denature)温度和时间模板 DNA的变性：模板 DNA双链在 93-96加热 2-10解离；经PCR扩增形成的双链 DNA在 93-96C 加热 30”-1。n 退火 (anneal)温度和时间 : Tm-5C温度降至 55C左右，特异引物与模板 DNA单链配对结合。n 延伸 (extend)温度和时间： 72C 1000碱基 /分钟在 TagDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。 n 循环数在 2530个循环内，扩增的 DNA量增加明显，然后进入平台期。靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。PCR扩增效率（理论）以上三步为一个循环。每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，从理论上讲，每经过一循环，样本中的 DNA量应该增加一倍，扩增 DNA产量是以指数形式上升的，既 n个循环后，产量为 2n，经过 25-30个循环后 DNA可扩增 106-109倍。PCR扩增效率（实际）实际上， PCR扩增效率比理论值要低。对于不同的基因来说，扩增效率也大不相同。 (如图所示 )经过一定循环数之后， PCR产物的量增长缓慢，进入所谓的 “平台期 ”，在 PCR扩增反应达到平台期前，模板扩增产物 (N)与启始模板 (N0) 之间呈下列方程所示关系 :N = N0 (1+E) n其中 E是扩增效率，n是循环数。演示 PCR反应的过程！PCR反应体系组成（ 1） DNA模板（ 2） 引物（ 3） dNTP（ 4） 耐热的 DNA聚合酶（ 5） 10PCR缓冲液 (含 Mg+)模板核酸n PCR可以以 DNA或 RNA为模板进行核酸的体外扩增。n RNA的扩增必须经逆转录成 cDNA后才能进行正常的 PCR循环，称为 RT-PCR。n PCR反应中模板加入量一般为 102-105个拷贝的靶序列。人工合成的寡核苷酸 -引物 PCR扩增产物的 特异性 和扩增 片段的大小 是由引物限定的，因此，引物的设计对 PCR的成功与否有决定性的意义。引物设计原则： 软件 +经验n 引物长度以 15-30个碱基为宜；n 引物碱基尽可能随机分布， G+C含量宜在 4555%左右；n 引物内部不应形成二级结构；n 两个引物之间不应形成二级结构；n 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；n 两个引物的 Tm值要尽可能接近。 一般 PCR反应中引物的终浓度为 0.1-1mol/L， 在此范围内产物量基本相同。引物浓度 低于 0.1mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成 。引物浓度对 PCR反应的影响合适的缓冲体系 目前最常见的缓冲体系为 1050mmol/L Tris-HCl(pH 8.3-8.8, 20 )。 Tris是一种双极性离子缓冲液，其主要作用是维持 碱性 的 Taq酶作用环境。在缓冲液中加入 明胶 或无核酸酶的 BSA， 对酶有一定的保护作用， Tween-20(0.05%-0.1%) 及5mmol/L的二硫苏糖醇（ DTT） 也有类似作用。尤其在扩增长片段（延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对 PCR反应是有利的。 Mg2+ Mg2+是 TaqDNA聚合酶活性所必需的 。 Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、引物的退火、模板与 PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。 因为， PCR反应混合物中的 DNA模板、引物和 dNTPs的磷酸基团均可与 Mg2+结合，降低 Mg2+的实际浓度。 Taq DNA聚合酶需要的是游离的 Mg2+，因此， PCR中的 Mg2+的加入量要比 dNTPs的浓度要高 0.2-2.5mmol/L。最好对每种模板 DNA, 每种引物都进行Mg2+浓度的优化。三磷酸脱氧核苷 （dNTPs）四种三磷酸脱氧核苷（ dATP、 dCTP、 dGTP、dTTP）是 DNA合成的基本原料，工作浓度应为20200mmol/L。 所用的四种 dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。 dNTPs浓度过低则反应速度下降 ， dNTPs浓度过高则扩增特异性降低 ，而且当 dNTP浓度高于 50mM时也会抑制Taq DNA聚合酶的活性。耐热 DNA聚合酶 Taq聚合酶是从耐热菌（ thermus aquatious）中提取出来的耐热酶， 95 仍有活性。该酶的应用浓度一般为 12.5U/100L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。 酶浓度过高时 ， 会出现非特异性扩增 ； 过低时扩增产物量很低 。 试剂 原液浓度 工作浓度 50l体系PCR缓冲液 1015L上游引物50mol/L0.5mol/L 0.5L下游引物50mol/L0.5mol/L 0.5LdNTPs 10mmol/L 200mol/L 4LMgCl2 25mmol/L1.5mmol/L 1.5LTaq酶 5U/L 2.5U/100L体系0.25LDNA模板 102-105拷贝ddH2O 补足 50LPCR混合液PCR产物的分析半定量 RT-PCR原理：n 持家基因 ：在所有类型组织和细胞中普遍表达恒定的基因。如 2微球蛋白、 -肌动蛋白和 GAPDH基因。n 在逆转录过程中， “持家基因 ”的 mRNA与待测模板的 mRNA共同逆转录为 cDNA，因此排除了 cDNA合成效率不同所引起的误差。在此后的 PCR反应过程中， “持家基因 ”的 cDNA与待测模板 cDNA用不同的两对引物在同一 PCR体系内扩增。待测模板扩增产物与该样品 “持家基因 ”扩增产物的比值可以反映待测模板表达量的相对高低。 持家基因选择的原则 在欲分析的组织或样品中该持家基因的表达稳定。 RNA 特异性的检测，注意假基因的干扰。 持家基因的拷贝数和预测基因的拷贝数在同一线性范围内。常用持家基因表达的稳定性常用持家基因在基因组序列中存在假基因情况不同类型细胞中持家基因表达的稳定性Vandesompele, J., K. De Preter, et al. Genome Biol, 2002不同类型组织中持家基因表达的稳定性de Kok, J. B., R. W. Roelofs, et al. Lab Invest,2005在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性Fig. Selection of the most suitable reference genes for normalization in prostate cancer samples using geNorm analysis by calculating the average expression stability measure M, and the least stable gene with the highest M value.Ohl, F., M. Jung, et al. J Mol Med, 2005PCR产物的分析如何调整 PCR产物在直线期：n 一管 PCR法（减少持家基因引物量）n 两管 PCR法（同一混合液，同一 PCR程序）如何调整不同样品间持家基因的差异n RNA水平调整（加大模板量）n cDNA水平调整（加大模板量，最多 2uL)n 电泳水平 (持家基因与欲测基因体积一致）待测模板的相对含量 = 样品荧光强度 /内参照模板的荧光强度RT-PCR实验的策略1、热启动Taq酶在低温下仍有活性，故 PCR混合物在显著低于 Tm值 的温度下， Taq酶可催化引物与模板的非特异复性或引物二聚体的形成。n 在第一个循环的变性温度加入 Taq酶；n 将含有 Mg2+的石蜡珠放在管内，待达到变性温度时，石蜡熔化， Mg2+进入反应液中，起始反应；n 在 PCR反应液中，加入 Taq酶的单克隆抗体，在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体与 Taq酶结合，使其不能发挥作用。RT-PCR实验的策略2、优化 Mg2+浓度应用不包含 Mg2+的 PCR缓冲液，将 10mmol/L MgCl2贮存液逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增（ 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5，3mmol/L），在确定了 Mg2+大概浓度后，再在该浓度上下，以 0.2mmol/L递增和递减几个浓度来精确确定 Mg2+的最合适的浓度。RT-PCR实验的策略3、退火温度和时间n Tm=4(G+C)+2(A+T) 简单计算法n 从退火温度低于 Tm值 5C开始，由低往高优化。n 欲