C-肽测定试剂注册技术审查指导原则

附件5C-肽测定试剂注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对C-肽测定试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对C-肽测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、适用范围C-肽测定试剂是指利用抗原抗体反应的免疫学方法对人血清、血浆或其他体液中的C-肽（C-Peptide）进行体外定量检测的试剂。本指导原则适用于以酶标记、（电）化学发光标记、（时间分辨）荧光标记等标记方法标记抗体，以微孔板、管、磁颗粒、微珠和塑料珠等为载体包被抗体，定量检测C-肽的免疫分析试剂，不适用于以胶体金或其他方法标记的定性或半定量测定的C-肽试剂、用放射性同位素标记的各类放射免疫或免疫放射测定试剂。根据体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）和食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知（食药监械管2013242号），C-肽测定试剂的管理类别为二类，分类代码为6840。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料C-肽（C-Peptide）又称连接肽，是胰岛细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C-肽。正常情况下，人胰岛细胞主要分泌产生并释放到血液中的是胰岛素，在产生胰岛素的一系列的过程中，胰岛细胞首先合成胰岛素原。胰岛素原是一条很长的蛋白质链，胰岛素原在酶的作用下被分解为三段，前后两段又重新联接，成为有A链和B链组成的胰岛素，中间一段独立出来，称为C-肽。C-肽是由31个氨基酸组成的连接肽，分子量约3021道尔顿。C-肽本身无生物活性，由于胰岛素和C-肽是以等摩尔浓度分泌的，进入血液后，大部分胰岛素经肝脏被灭活，而C-肽被肝脏摄取很少，加上C-肽降解速度比胰岛素慢，所以血液中C-肽浓度比胰岛素高，一般在5倍以上，故C-肽更能准确反映胰岛细胞的功能。因此测定血液中C-肽水平可作为胰岛细胞分泌功能的重要指标，特别对用外源性胰岛素治疗的糖尿病人更需要测定其C-肽，因胰岛素制剂中不含C-肽，不影响患者血液中C-肽的水平。C-肽水平测定可应用于糖尿病分型及了解糖尿病患者胰岛细胞的功能。无论1型或2型糖尿病患者，初病时都应通过检测C-肽或胰岛素水平以判断胰岛细胞功能。由于外周血中C-肽被肝细胞摄取少，更能反映胰岛细胞分泌时浓度，加之其基础清除率稳定，不受多种因素影响，故C-肽释放试验曲线下面积优于胰岛素释放试验，更能代表胰岛细胞功能。另外，对于应用外源性胰岛素的测定，由于C-肽与胰岛素抗体无交叉反应，不受胰岛素抗体干扰，外源性胰岛素又不含C-肽，故C-肽测定显得更为重要，对了解胰岛细胞功能情况、指导治疗有积极作用。综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性方面的说明、研究结果的总结评价以及同类产品在国内外上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、临床应用情况、申报注册产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的异同方面进行介绍。应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。（二）主要原材料研究资料（如需提供）1.测定试剂所用抗体的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料。如抗体为申请人自制，则应详述抗体的名称及生物学来源，申请人对该抗体技术指标的要求（如外观、纯度、蛋白浓度、效价等），且其生产工艺必须相对稳定，并对其工艺有相关的验证。同时确定该抗体作为主要原材料的依据和质量标准；如为申请人外购，则应详述其名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书，详述申请人对该抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。2.校准品、质控品（如有）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。3.申请人应根据GB/T 214152008/ISO 17511：2003体外诊断医疗器械生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性提供所用校准品的来源、赋值过程和相应指标、以及不确定度等内容。明确校准品的质量标准并提供校准品的溯源性文件，校准品应溯源至现行的国家标准品或国际标准品。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）生产工艺主要包括：各组分制备工艺的研究，包括试剂的配方及工艺关键参数的确定依据等。反应体系主要包括：反应条件、样本用量、试剂用量等确定的依据。1.主要生产工艺介绍，可以流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。2.产品反应原理介绍。3.抗体包被工艺研究：申请人应考虑如包被缓冲液及添加量、浓度、时间、温度等指标对产品性能的影响，通过试验确定上述指标的最佳组合。4.体系反应条件确定：申请人应考虑反应模式、反应时间、反应温度、洗涤次数等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。5.体系中样本及试剂的加样方式及添加量确定：申请人应考虑样本加样方式、加样量以及试剂添加顺序、添加量对产品检测结果的影响，通过实验确定最佳的样本及试剂的添加方式和添加量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对可用于样本稀释的基质或处理方法进行研究，通过试验确定样本稀释基质或处理方法。确定反应所需其他试剂用量（校准品、标记物、底物等）的研究资料。固相载体、信号放大系统、酶作用底物等的介绍及研究资料。6.样本类型的研究（如适用）如果试剂盒适用样本类型包括血浆样本，应采用各种抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行对比实验研究。方法为对比线性范围内的同一病人的血清和血浆样本，应包含医学决定水平以及低值浓度样本进行检测以验证申报试剂对于血清和血浆样本检测结果的一致性。如同一病人的不同抗凝剂抗凝的低值血浆样本难以获得，可采用高值血清样本分别添加到健康人的不同抗凝剂抗凝的血浆样本中进行验证。（四）分析性能评估资料企业应提交产品研制阶段进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、质控标准、实验数据、统计分析等详细资料。建议选择不少于3批产品对以下分析性能进行研究，包括空白限、线性、准确度、精密度、特异性等指标，具体研究方法建议参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSIEP）或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。对于适用多个机型的产品，应提供产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料（主要性能）。如产品涉及不同包装规格，则需要提供每个包装规格在不同型号仪器上的评估资料；如不同包装规格之间不存在性能上的差异，需要提交包装规格间不存在性能差异的说明。1.准确度对准确度的评价通常采用与参考物质（国家标准品或国际标准品）的偏差分析。将参考物质配制成指定浓度的准确度样品进行检测，计算相对偏差。2.空白限空白限的确定常使用同批号试剂对零浓度校准品（或校准品稀释液）进行至少20次重复检测，计算所得信号值均值和标准差（SD），将（+2SD）带入剂量反应曲线，计算出的浓度值即为空白限。3.线性建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定范围内选择711个浓度水平。例如，将预期测定范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，确定线性范围。剂量反应曲线的线性可使用试剂盒校准品进行验证，用双对数或其他适当的数学模型拟合，计算剂量反应曲线的线性相关系数r。对于未配备校准品的试剂盒，取C-肽国家（或国际）标准品（或其他高浓度样本），按照试剂盒说明书声称的线性范围，配制适当的（一般应不少于5个）浓度点，建立相应的剂量反应曲线，计算线性相关系数r。也可以采用高浓度样本稀释的方法验证线性，将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为至少5个浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。将测定浓度的平均值与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。4.精密度 精密度的评估应使用3个浓度水平的质控品或样本进行测定，浓度包括参考区间附近的浓度值、中浓度值、高浓度值。一般包括批内、批间精密度的评价。（1）批内精密度：同一批次的测定试剂对线性范围内的3个浓度的质控品或样本进行重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（）和标准差（SD），根据公式CV=SD/100%得出变异系数。（2）批间精密度：用不少于3个批次的测定试剂对线性范围内的3个浓度的质控品或样本各重复检测10次，计算3批测量结果的平均值（）和标准差（SD），根据公式CV=SD/100%得出变异系数。5.特异性（1）交叉反应：易产生交叉反应的其他蛋白质激素等的验证情况，应至少验证与人胰岛素原和人胰岛素样本的交叉反应情况。如无法获得单纯高浓度的人胰岛素原或人胰岛素样本，可采用纯品物质分别添加到健康人样本、参考区间附近样本、中浓度值样本中的方式进行验证。（2）干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如高脂、黄疸、类风湿因子、嗜异性抗体等干扰因子对检测结果的影响。如无法获得含有高浓度干扰物质的样本，可采用纯品物质分别添加到健康人样本、参考区间附近样本、中浓度值样本中的方式进行验证。建议将研究结果在说明书中进行说明。6.钩状（Hook）效应（如有）：说明不会产生Hook效应的浓度上限或相关研究，如需稀释，应注明对稀释液的要求、最佳或最大稀释比例。每个浓度重复3份，对钩状效应进行合理的验证。建议在产品说明书上明示对钩状效应的研究结果。7.方法学比对（如有）采用参考方法或国内外普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和对比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。性能指标的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同的试剂特征进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考相关的CLSIEP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。（五）参考区间确定资料参考区间确定所采用的样本来源、确定方法及详细的试验资料。样本来源覆盖年龄、性别等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。建议参考CLSI/NCCLS EP28A3C进行相应研究。（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。试剂稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。C-肽在样本中不稳定，需对样本稳定性进行研究，主要包括样本在室温、冷藏或冷冻保存条件下C-肽含量的稳定性验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行稳定性验证，从而确定不同类型样本的保存条件及使用期限。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行研究。试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中分别进行详细说明。（七）临床评价资料1.临床试验研究方法选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称考核试剂）与之进行比较研究试验，证明本产品与已上市产品等效或优于已上市产品。对比试剂尽量选择方法学相同、线性范围、参考区间及精密度等性能接近的同类产品作为对比试剂。2.临床试验机构的选择（1）应在至少两家经国家食品药品监督管理总局备案的临床试验机构开展临床试验。（2）临床试验机构应有能力提供临床试验所需的各类样本，实验操作人员有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，定期对仪器进行校准，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。3.临床试验方案临床试验实施前，研究人员应从临床医学、检验医学、统计学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。试验方案中应确定严格的样本纳入/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法及样本随机分配以保证试验结果的客观性。临床试验中所涉及的样本类型应与产品说明书一致，且每种样本类型例数的选择应符合基本的统计学要求。各临床试验机构选用的对比试剂应一致，对比试剂的适用机型尽量相同，如不相同需评估不同机型间检测结果的一致性后选用，以便进行合理的统计学分析。4.研究对象选择4.1临床试验样本量的确定：在符合指导原则有关最低样本要求的前提下，还应符合统计学要求。4.1.1对于非同源性的样本类型，每种样本类型临床试验的总样本数至少为200例。对于同源的不同样本类型，其中一种样本类型临床试验的样本数至少为200例，其他样本类型再做不少于100例的可比性验证，并在至少2家（含2家）临床试验机构完成。4.1.2应考虑样本量的分布，各临床试验机构样本量和样本分布应相对均衡。4.2样本浓度应覆盖考核试剂线性范围，尽可能均匀分布。尽可能使不少于30%样本的测定值处于参考区间以外，但在线性范围内。5.统计学分析对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归等。对于对比实验的等效性研究，最常用是对考核试剂和对比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是对比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，r是相关系数，同时应给出b的95%（或99%）置信区间。结合临床试验数据的对比情况，统计学负责人进行统计分析，应可以证明两种方法的检测结果具有较好的相关性。6.临床试验总结报告撰写临床试验总结报告应对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并包括必要的基础数据和统计分析方法。具体撰写内容应符合关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。（八）产品风险分析资料申请人应考虑产品寿命周期的各个环节，从预期用途、可能的使用错误、与安全性有关的特征、已知及可预见的危害等方面的判定以及对患者风险的估计进行风险分析，应符合YY/T 03162016/ISO 14971：2007医疗器械 风险管理对医疗器械的应用及附录H的要求。风险分析资料应包含以下内容：1.概述：简要介绍风险分析资料的编制依据、适用范围、产品描述、风险管理计划及实施情况等。2.风险管理人员及其职责分工：明确风险管理小组成员及职责，制定风险管理流程图，明确风险管理活动的评审要求等。3.风险可接受准则：明确风险可接受的准则。4.预期用途和安全性有关特征的判定：以YY/T 03162016附录H为基础，判定产品预期用途和与安全性有关的特性，判定已知和可预见的危害、对患者风险的评估，并形成问题清单。5.风险评价、风险控制和风险控制措施：对每一判定为危害的不正确结果的风险进行评价，并制定相应的风险控制方案及措施。6.综合剩余风险的可接受性评价：对比采取风险控制措施前后的风险情况，对剩余风险的可接受性进行评价。7.风险控制措施验证：对风险控制措施的有效性进行验证分析。8.生产和生产后监测：对产品生产和生产后的性能进行内部和外部的监测。内部监测包括生产过程控制，外部监测包括用户投诉、不良事件、第三方性能评价等。本项内容由产品上市后补充，产品注册时提供监测信息表格的设计内容。9.风险管理评审结论：风险管理小组下达风险评审结论。（九）产品技术要求产品技术要求应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）和关于发布医疗器械产品技术要求编写指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关规定。 如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则产品技术要求不得低于上述标准要求。作为定量检测试剂，产品技术要求应主要包括以下性能指标：外观、空白限、线性、准确度、精密度、特异性等。（十）产品注册检验报告根据关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的要求，应提供具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构出具的产品注册检验报告和产品技术要求预评价意见。（十一）产品说明书说明书承载了产品预期用途、样本要求、检验方法、检测结果的解释以及注意事项等重要信息，是指导使用者正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的编写应符合关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。根据关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求并结合C-肽本身的特点，对C-肽测定试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。1.【预期用途】产品的预期用途建议描述为：本产品用于定量检测人血清或血浆或其他体液中C-肽的含量。适用的样本类型应结合实际的临床研究情况进行确认。若用于特殊受试人群的检测，应明确说明。简要介绍C-肽及其评价胰岛细胞分泌功能的临床意义。2.【检验原理】详细说明检验原理、方法，必要时可采用图示方法描述。3.【主要组成成分】（1）说明产品包含试剂组分的名称、数量等信息，涉及的英文缩写应全部以中文表述。（2）对于多组分试剂应明确说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。（3）如试剂盒中包含耗材，应列明耗材名称、数量等信息。如塑料滴管、封板膜、自封袋等。（4）对于产品中不包含，但对该试验必需的试剂组分，应列出此类试剂的名称，提供稀释或混合方法及其他相关信息。（5）试剂盒中如包含校准品和/或质控品，应说明其主要组成成分及其生物学来源，应注明校准品的定值及其溯源性，质控品的靶值范围。4.【储存条件及有效期】 根据产品的实时稳定性、开瓶稳定性等稳定性研究结果，对产品的储存条件及有效期做以下说明：（1）说明产品的储存条件及有效期，如：28、-18以下或其他温度条件保存的有效期限。（2）如果打开包装后产品或组分的稳定性不同于原包装产品，则打开包装后产品或组分的储存条件也必须注明。5.【适用仪器】说明可适用的仪器及型号。如适用仪器为酶标仪则只需写明对仪器配置的要求，其他仪器则需写明厂家及型号（对于同一个注册单元的适用仪器可不写明具体型号，用系列表示）。如不同包装规格适用于不同的机型，可写明适用关系。6.【样本要求】重点明确以下内容：（1）明确本产品适用的样本类型，血液样本应当说明对采血管及抗凝剂的要求，其他样本应说明样本采集、处理及保存方式。（2）样本采集：采集时间点是否受临床症状、用药情况等因素的影响，尽量减少由于样本采集或处理不当对实验造成的影响。 （3）样本处理、运送及保存：明确样本处理方法、样本的保存条件及期限（短期、长期）等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温，冻融次数的要求。如有需要应对高于检测范围样本的稀释方法进行规定。7.【检验方法】详细说明实验操作的各个步骤，包括： （1）实验条件：实验环境的温度、湿度等注意事项，检验试剂及样本复温等要求。 （2）试剂准备及配制方法、注意事项。 （3）待测样本的预处理方法、步骤及注意事项。 （4）明确样本检测的操作步骤。（5）校准：校准品的使用方法、注意事项、校准曲线的绘制方法。对适用于具有校准曲线保存功能检测仪器的产品，应注明校准周期。（6）质量控制：质控品的使用方法、对质控结果的必要解释以及推荐的质控周期等；建议在本部分注明以下字样：如果质控结果与预期不符，应分析原因并采取纠正措施。（7）结果计算：说明校准曲线拟合方式及结果计算方法。8.【参考区间】应注明常用样本类型的正常参考区间，简单介绍设定该参考区间所选人群的特征，建议注明以下字样“建议各实验室根据实际条件及接触人群建立自己的参考区间”。9.【检验结果的解释】 对所有可能出现的结果进行合理的解释：（1）本试剂的检测结果仅供临床参考，不得作为患者病情评价的唯一指标，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。（2）分析异常值出现的可能因素，明确说明何种情况下需要进行重复检测，以及在重复检测时对待测样本可能采取的优化条件等进行详述。（3）超出检测范围的样本怎样报告结果，如要得到准确的结果需怎样处理，如需稀释，应注明稀释方法、最佳或最大稀释比例等。（4）由于方法学或抗体特异性等原因，使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会得到不同的检测结果，因此，在监测过程中，用不同试剂检测所得结果不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释；建议实验室在发给临床医生的检测报告注明所用试剂特征。系列监测中如果改变试剂类型，则应进行额外的连续性检测并与原有试剂结果进行平行比较以重新确定基线值。10.【检验方法的局限性】（1）内源性干扰物质对检测结果的影响。（2）嗜异性抗体或类风湿因子等对检测结果的影响。（3）有关假性升高或降