fas-fasl与婴幼儿血管瘤演变过程的关联性研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 Fas/FasL 与婴幼儿血管瘤演变过程的 关联性研究 摘要目的：研究（Fas/FasL 自 杀相关因子，factor associated suicide/factor as sociated suicide lire）表 达在婴儿血管瘤演变过程中每个阶段的 表达量并探求它们之间的关联性。方法： 选取在笔者医院保存的婴幼儿血管瘤病 例标本 60 例，并依据标本所处血管瘤 病理形态将其分成六个阶段，采用 EnVi sion 免疫组化法和 RT-PCR 方法检 测 Fas 和 FasL 蛋白及 mRNA 的表达情 况。结果：Fas 蛋白在增生早期和中期 时有部分表达量，在增生晚期时阳性细 胞增多并且 Fas mRNA 表达量达到最大， 从消退早期至晚期，Fas 表达量呈下降 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 趋势；FasL 蛋白从增生中期开始出现表 达，当到增生晚期时 FasL mRNA 表达 量最大且 FasL 蛋白表达量达到最大， 从消退早期到晚期，FasL 表_量呈下 降趋势。结论：Fas 和 FasL 通过介导血 管瘤细胞凋亡途径来使婴幼儿血管瘤自 行消退，它们之间存在着密切联系。 中国论文网 /6/view-13026612.htm 关键词Fas；FasL；婴幼儿血管 瘤；关系；演变 中图分类号R732.2 文献标志码 A 文章编号1008-6455（2017）07- 0060-03 婴幼儿血管瘤是一种常见的儿童 期皮肤肿瘤，男女发病比例为 1：（35） ，多发于婴幼儿头面部并表 现为刚开始快速增长但后期增长减慢最 终又会部分自行消退。近年来，业内对 于婴幼儿血管瘤自行消退的机制一直为 研究热点，有学者已指出细胞凋亡途径 可能就是其自行消退的主要原因，而且 细胞凋亡途径中主要通路就是 Fas/FasL -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 蛋白介导的死亡受体通路。本研究通过 对 60 例婴幼儿血管瘤标本进行检测， 研究其 Fas 和 FasL 蛋白及 mRNA 的表 达情况并找出其中的关联性，现报道如 下。 1 资料和方法 1.1 一般资料：选取 2010 年 1 月 2016 年 12 月在笔者单位住院的婴幼儿 血管瘤标本 60 例，所有入选的标本患 儿均为未经过治疗且单纯进行手术切除 制备石蜡标本，患儿年龄 2120 个月， 依据患儿病理标本的形态将 60 例标本 分成 6 份，分别为增生早期、中期和晚 期及消退早期、中期和消退晚期。增生 早期 6 例标本，患儿年龄 23 个月； 增生中期 8 例标本，患儿年龄 46 个 月；增生晚期 16 例标本，患儿年龄 712 个月；消退早期标本 10 例，患儿 年龄 1236 个月；消退中期 8 例标本， 患儿年龄 3660 个月；消退晚期标本 12 例，患儿年龄 60 个月以上，所有标 本均是石蜡包埋。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 1.2 方法 1.2.1 免疫组化染色所需试剂：抗 Fas 和抗 FasL 抗体（北京中杉生物技术 有限公司） ，隶属兔源性多克隆抗体； 二抗：羊抗兔多聚酶标二抗，辣根过氧 化物酶标记。 1.2.2 RT-PCR 所需试剂： Fas、FasL 和 -ActinPCR 引物设计序列， 如表 1 所示。合成公司，中科院上海生 物工程中心；PCR Ex Taq 酶反应系统， 日本 TaKaRa 公司；抽提 RNA 和逆转 录试剂盒 SuperScript 1T，美国 Gibco 公 司。 1.2.3 免疫组化染色方法：实验前 将标本用机器制成病理切片，约为 4um 厚度。对其进行 Envision 法免疫组化染 色，各个免疫组化染色指标用 PBS 液作 为阴性对照，将细胞胞浆内或细胞外基 质中出现棕黑色或棕黄色物定义为阳性， 其余为阴性。 1.2.4 RT-PCR：将标本进行总 RNA 抽提并逆转录合成 cDNA，用 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 PCR 仪进行扩增，条件是 90s94- 30s50-30s72，总共 30 个循环，最 后 5min 延伸时间，将扩增后的溶液进 行琼脂糖凝胶电泳并对凝胶图进行吸光 度值分析，每个样品均检测 3 次，计算 公式如下：mRMA 表达相对量 =目的基 因片段条带的吸光度 A 值/同一样本 - Actin 条带的吸光度 A 值。 2 结果 2.1 免疫组化染色：通过表 1 可 以看出，Fas 蛋白在增生早期和中期时 有部分表达量，细胞饱满、致密，部分 细胞有棕黄色染色，且阳性细胞数目增 多，在增生晚期时阳性细胞增多，但从 消退早期至晚期，Fas 表达量呈下降趋 势，且微血管内皮细胞仍有微弱阳性染 色；FasL 蛋白的表达从增生中期开始， 呈现少数阳性细胞，有的阳性细胞位于 血管壁中，直到增生晚期时 FasL 蛋白 表达量达到最大表达，阳性细胞增多， 且均在细胞密集之处；从消退早期到晚 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 期，FasL 表达量呈下降趋势，直至几乎 看不见阳性细胞。 2.2 RT-PCR ：通过对 Fas 和 FasL 蛋白 mRNA 的电泳图进行观察，可以 发现 Fas mRNA 在增生早期和中期有一 定量表达，在增生晚期达到最高，进入 消退期开始下降，等到消退完成其几乎 检测不到，FasL mRNA 从增生中期开 始有少量表达并在增生晚期表达到最高， 进入消退期仍然很高但在消退完成期又 几乎检测不到，通过进行吸光度值分析 可发现 Fas 和 FasL 蛋白的 mRNA 含量 均是先升后降。增生早期、增生中期、 增生晚期、消退早期和消退晚期患儿的 临床表现，见图 1。 3 讨论 哺乳动物细胞凋亡主要通过死亡 受体通路和线粒体通路进行，其中死亡 受体途径主要涉及蛋白为 Fas/FasL、caspase8 和 TNF 等，线粒体 途径主要涉及蛋白为 easpase9、细胞色 素 C 和 BAX 等，这两条途径都是通过 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 caspase3 来完成最终的细胞凋亡，有学 者经过大量实验证明线粒体途径不会在 血管瘤内皮细胞凋亡过程中发挥作用， 因为在血管瘤中线粒体涉及蛋白均表达 量低而且在增殖期和消退期均无明显变 化差异，故死亡受体途径可能会在血管 瘤细胞凋亡中发挥主要作用。 CTL、Th1 和 NK 细胞均会产生 FasL， 这些细胞数量增多和活性增强会促使细 胞凋亡的发生，有文献表明 T 细胞和树 突状细胞的数量在血管瘤增殖期和消退 期中明显多于其消退晚期，在增殖早期 婴儿血管瘤细胞中的 CD3+、CD4+和 CD8+数量比较少，但到了增殖中期这 三个指标数量就显著增多，等到消退晚 期这三个指标数量又显著下降，并通过 对微血管壁进行观察发现上面有少数 FasL+存在，说明其正在穿过微血管进 入细胞团或者正与微血管壁细胞发生作 用，故由此可以推出增生晚期细胞凋亡 数量增多的原因是 FasL 的 Tc 和 Th1 的 增多，所以说婴幼儿血管瘤演变的重要 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 因素是 Fas 和 FasL 蛋白介导免疫和凋 亡机制，其演变过程应属于肿瘤免疫范 围。 婴幼儿的免疫状态也是其血管瘤 细胞凋亡的一个重要影响因素，因为刚 出生的胎儿其免疫系统尚未完全建立， 其各种免疫细胞含量少，尤其由 T 细胞 介导的细胞毒作用和树突状细胞功能弱 或不完全，再加上此时婴幼儿不能通过 胎盘获得母体的免疫因子，故胎儿出生 后对外来和内在抗原的免疫应答能力低， 近而容易诱发患儿出现血管瘤，而且有 数据表明早产低体重儿血管瘤发病率极 高，这都可以用新生儿免疫系统尚未发 育完全来解释。随着婴幼儿免疫系统的 建立逐步完善，T 细胞开始分泌 FasL 和 Fas 受体促使婴幼儿血管瘤细胞凋亡 并降低血管瘤生长速度。患儿早期血管 瘤的微血管是由内皮细胞和周细胞包围 形成，当患儿的体内免疫系统建立起来 后 T 细胞通过识别周细胞并