虫草素对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38mapk通路及tgf―β1表达的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 虫草素对高糖介导大鼠肾小管上皮 细胞 p38MAPK 通路及 TGF1 表 达的影响 摘要目的 探讨虫草素 （Cordycepin ）对高糖介导大鼠肾小管 上皮细胞 p38MAPK 通路及 TGF-1表 达的影响。方法 体外培养大鼠近端肾 小管上皮细胞株（NRK52E 细胞株） ， 分为正常对照组（NG 组） 、高糖组 （HG 组） 、高糖+虫草素组（HG+C 组） 。 应用定量 RT-PCR 测定 NRK52E p38MAPK 及 TGF-1 mRNA 的表达； 采用 Western 印迹方法检测不同时间点 p-p38MAPK、TGF-1 蛋白的表达水平。 结果 与 NG 组比较，HG 组 NRK52E -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 细胞的 p38MAPK、TGF-1 mRNA 表达 增多（P 中国论文网 /6/view- 12962525.htm 关键词p38MAPK；虫草素； TGF-1；葡萄糖 中图分类号 R285.5 文献标识 码 A 文章编号 1674-4721（2017） 06（b）-0004-04 AbstractObjective To investigate effect of cordycepin on p38MAPK pathway and TGF-1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Methods NRK52E cells were cultured in the mediun with normal glucose concentration （group NG） ，high glucose concentration （group HG） and high glucose concentration+cordycepin （group HG+C）.The expression of p38MAPK and TGF-1 mRNA was measured by quantitative RT-PCR；the expression level of p-p38MAPK and TGF-1 protein was detected by Western blot.Results The -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 p38MAPK and TGF-1 mRNA in NRK52E cells were highly expressed in group HG compared with group NG （P0.01） ；the tendency of p-p38MAPK and TGF-1 protein expressed was accordance with expression of mRNA.However，cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Conclusion Cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose. Key words P38MAPK；Cordycepin；TGF- 1；Glucose 糖尿病I 病（diabetc nephropathy，DN）是导致终末期肾病 （end-stage renal disease，ESRD ）最常 见的原因之一1，小管间质纤维化是其 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 重要的临床表现2。多种因素参与了糖 尿病肾病的发生及发展3，包括高糖、 细胞通路的激活4等。p38 丝裂原活化 蛋白激酶（p38MAPK ）是 MAPK 家族 的一个亚族，可被高糖等因素激活，激 活后可通过上调 TGF-/Smad等多条信 号转导途径5最终导致了肾小球的纤维 化6。TGF-1 是公认的致纤维化因子， 在肾纤维化过程中发挥重要作用。研究 发现，TGF-1 和 p38MAPK 存在相互 串话7，共同导致了肾脏的纤维化。虫 草素是中国名贵草药冬虫夏草的主要成 分之一，在肾脏中具有重要保护作用， 但是机制尚未明确，本实验通过体外培 养 NRK52E 细胞，观察虫草素对高糖介 导的 NRK52E 细胞 p38MAPK 通路及 TGF-1表达的影响，探讨虫草素对肾 脏保护作用的机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 NRK52E 细胞（肾小 管上皮细胞，中山大学余学清教授惠赠） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 ，虫草素（Sigma 公司，货号：C3394- 10MG） ，葡萄糖（Sigma 公司，货号： G7021-100G） ，TRizol 试剂（Invitrogen 公司，货号：15596026） ，逆转录试剂 盒（SuperScriptR First-Strand Synthesis System for RT-PCR kits，Invitrogen 公司） ，PCR 扩增试剂 盒（SYBRRSelect Master Mix， Invitrogen 公司） ，胎牛血清（美 国 Gibco BRL，货号：16000-044） ，兔 抗大鼠 p-p38MAPK 多克隆抗体（英国 New England Biolabs） ，小鼠抗大鼠 TGF-1单克隆抗体（美国 Abcam）等。 1.1.2 仪器设备 恒温 CO2 细胞培 养箱：美国 Thermo 公司；倒置荧光显 微镜：美国 AXJOVERT 公司；PCR 扩 增仪 PCT-200：美国 Thermo 公司；荧 光定量 PCR 仪：Applied Biosystems； 超微量分光光度计 NANODROP- 2000：美国 Thermo 公司；显微镜及成 像系统：OLYMPUS BX51；凝胶成像 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 系统：法国 BIO-UISON100；超声波细 胞粉碎仪：SCIENTZ 公司；定量酶标 仪：美国 MRX2；电泳仪：美国 Bio- RAD 公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及分组 用低糖 DEME 完全培养基（含 10%胎牛血清） 培养细胞，待细胞贴壁 60%80%，改 用无血清培养基进行同步培养，将细胞 按照设计进行分组并加入不同浓度葡萄 糖：正常对照组（5.5 mmol/L） 、高糖组 （30 mmol/L） 、高糖+ 虫草素组（30 mmol/L，虫草素浓度 10 g/ml） ，高糖+ 虫草素组使用虫草素进行预先干预 2 h。 1.2.2 qRT-PCR 待细胞培养足够 时间，收集细胞，提取细胞的总 RNA。然后对 RNA 进行 OD 值及浓度 测定。取 1 g的总 RNA 按照试剂盒说 明书的方法进行合成 cDNA，然后再对 逆转录产物进行扩增。采用 primer 5.0 软件设计目的基因引物序列，由北京华 大基因公司合成，所得引物用 DEPC 水 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 稀释后放于-20备用，各基因引物序 列见表 1。反应体系：SYBR 10 l；Forward 0.16 l；Reverse 0.16 l；ddH2O 4.68 l；cDNA 5 l；反应条 件及步骤：预变性：采取 95进行 2 min；变性：95的温度进行 15 s；退火：58进行 30 s；延伸： 72延伸 30 s；循环：总共经过 40 个循环，再充分延伸 10 min。将所合成 的指标（p38MAPK 、TGF-1 ）与内参 （GAPDH）的 Ct 值采取取对数的方式 进行比较，其比值表示待测指标的 mRNA 的相对表达量。 1.2.3 Western blot 按设计分组培 养细胞并加入不同的刺激，15 min、30 min、60 min、12 h、24 h、48 h 后，收 集细胞，提取细胞总蛋白，进行超声破 碎，接着采用 BCA 定量法对蛋白进行 测定其浓度。采用 8% SDS-PAGE 分离 胶上样，电泳时先采用 80 V，待样品蛋 白到达分离胶后，改成 120 V，继之在 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 340 mA 下转膜 2.53 h，使用 5%脱脂 牛奶封闭 2 h，一抗采用浓度为：（ p- p38MAPK， 13000；TGF- 1，12000）过夜，使用脱脂牛奶洗 涤加二抗（15000110 000） ，暗室 曝光、显影，最后进行灰度分析。 1.3 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料数据用均数标准 差（xs）表示，多组间比较采用单因 素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验；以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 不同时间点 NRK52E 细胞的 p38MAPK mRNA 表达情况 高糖刺激后，不同时间点的 p38MAPK mRNA 的表达明显升高，并 且在 15 min、24 h 两个时间段出现高峰； 高糖+虫草素组的 p38MAPK mRNA 表 达较高糖组明显降低，较正常对照组升 高（P0.01） （图 1） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 2.2 不同时间点 NRK52E胞的 TGF-1 mRNA 表达情况 在高糖的刺激下，不同时间点的 TGF-1 mRNA 的表达明显升高，并且 在呈时间依赖性增加；高糖+虫草素组 的 TGF-1 mRNA 较高糖组明显降低， 较正常对照组升高（P0.01） （图 2） 。 2.3 不同时间点 p38MAPK 蛋白 的表达情况 在高糖的刺激下，不同时间点的 p-p38MAPK 蛋白的表达明显升高，并 且在 15 min、24 h 两个时间段出现高峰； 高糖+虫草素组的 p-p38MAPK 蛋白表达 较高糖组明显降低，较正常对照组升高 （P0.01） （图 3） 。 2.4 不同时间点 NRK52E 细胞的 TGF-1蛋白表达情况 在高糖的刺激下，不同时间点的 TGF-1蛋白的表达呈时间依赖性地升 高；高糖+虫草素组的 TGF-1蛋白表达 较高糖组明显降低，较正常对照组明显 升高（P0.01） （图 4） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 3 讨论 糖尿病肾病是以肾小球系膜细胞 增殖、肥大以及细胞外基质过度积聚， 最终导致肾脏纤维化。多种因素及细胞 通路参与糖尿病肾病肾脏纤维化的发生 及发展，包括 TGF-/Smad通路、 p38MAPK 通路 8等。 TGF- 是公认的导致肾脏细胞外 基质（ECM ）沉积和纤维化的最重要的 因子，在糖尿病肾病患者的发展中起着 核心作用9。 Zeisberg 等10研究发现， TGF-1刺激后，人近端肾小管上皮细 胞失去上皮细胞表型 E-cadherin，获得 了肌成纤维细胞的表型 -SMA，并导致 了细胞外基质成分产生增加。有研究表 明，在糖尿病肾病中，TGF- 可以通过 激活 TGF-依赖的 Smad 信号通路，也 可以激活非 TGF-依赖的信号通路，如 p38MAPK，最终促进 ECM 的合成、 EMT 的发生11-12，最终引发肾间质 纤维化。 p38MAPK 是各种细胞外信号刺 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 激细胞内信号传递的共同通路，它可以 被多种因素激活。Lv 等13发现，高糖 能够导致肾小管上皮细胞 p38MAPK 通 路的激活，参与了 EMT 的发生；在糖 尿病肾病中，p38MAPK 的活化可以直 接调节 -SMA蛋白的合成14，同时间 接的活化 Smad 通路，参与了 TGF-1 诱导的肾小管上皮细胞 EMT 的发生15。 Tzeng 等16用乙醇提取的金银花可以 抑制 p38 MAPK 的活化延缓了 STZ 诱 导的糖尿病肾病的发生及发展。 冬虫夏草是我国传统的名贵中草 药，具有“益肺肾 p 补精髓”之功效。 虫草素是从其分离出来的单体，是一种 核苷类似物。周巧玲等17-18的研究发 现，冬虫夏草可下调糖尿病肾病肾组织 TGF-1、CTGF 及型胶原的表达，减 轻糖尿病肾病肾纤维化。除此外虫草素 还可以抑制嘌呤合成，诱导凋亡，引起 细胞周期阻滞、减少炎症介质释放等药 理作用19-20 。 本实验研究显示，高糖介导下， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 不同时间点的 p38MAPK、TGF-1 mRNA 及蛋白表达均明显增高，虫草素 干预后，高糖介导下的 p38MAPK、 TGF-1 mRNA 及其蛋白高 表达均明显下调，提示虫草素可以抑制 高糖介导大鼠肾小管上皮细胞 p38MAPK 通路活化及 TGF-1表达。 因此，本研究推测，虫草素可能通过抑 制 p38MAPK 通路活化从而下调 TGF- /Smad信号转导，减轻糖尿病肾病肾 脏纤维化。本研究组下一步将检测虫草 素对 p38MAPK、TGF-/Smad 通路活化 后下游相关蛋白的表达的影响，明确虫 草素对糖尿病肾病防治机制，为糖尿病 肾病的治疗提供新的认识和理论依据。 嘉南 1Nazir N，Siddiqui K，Al- Qasim S，et al.Meta-analysis of diabetic nephropathy associated genetic variants in inflammation and angiogenesis involved in different biochemical pathwaysJ.BMC -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 Med Genet，2014，15（1）：103. 2Sasai Y，Iwakawa K，Yanagida K，et al.Advanced glycation endproducts stimulate renal epithelial cells to release chem-okines that recruit macrophages，leading to renal fibrosisJ.Biosci Biotechnol Biochem，2012 ，76（9）：1741-1745. 3Goldberg R，Rubinstein AM，Gil N，et al.Role of heparanase- driven inflammatory cascade in pathogenesis of diabetic nephropathyJ. 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