多肽药物的含量测定方法PPT课件

肽类药物的含量测定方法 背景： 多肽类药物及其主要优势人体 的生长和发育都离不开多肽，多肽是调节 系统功能 和 细胞生长的基础。多肽类药物作为药物开发的主要方向， 它包括 多种类型，常见的多 肽类药物有如下 几种 .多肽类疫苗：多肽类疫苗的研制为人类攻克肝炎、艾滋病 等疾病带来了希望。 .抗肿瘤多肽类药物：肿瘤危害人类的生存，其产生是多方 面因素共同作用的结果，但归根到底是癌基因表达的问题。 多肽类抗癌药物由于其能够 成为肿瘤 基因表达 时的调控因子，因而成为了抗癌药物研究的新希望 。 .抗病毒类多肽药物：一般来说，病毒感染细胞的过程包括以下几个主要阶段：吸 附、自我复制、重新组合、释放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附和病毒复制 两个阶段，通过与宿主细胞特异性结合或者病毒蛋白酶结合来发挥作用。 一 、 酸碱滴定法 示例：苯 酪 酞的测定 测定方法：取本品约 0.5g精密称定，加中性 乙醇（对酚酞指示液呈 中性） 60ml，振摇，溶 解后加酚酞指示液数滴 ，用氢氧化钠滴定（ 0.1mol/L)，即可。 二 、 紫外分度光度法 示例：五肽胃泌素含量测定 五肽胃泌素为白色或类白色粉末。 本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因 子的分泌，其促胃酸分泌作用相当 于内源性胃泌素的 1/4，作用可持续 1040分钟。临床上主要用于胃酸分 泌机能的检查 。 方法原理： 供试品加 0.01mol/L氨溶液定量稀释，制成供试液，置紫 外可见分光光度计 ,于 280nm波长处测定吸收度，计算出其含量。 试剂： 氨溶液（ 0.01mol/L） 标准品： E1%1cm 为 70计算 仪器设备： 紫外可见分光光度计 注：分光光度法应以配制供试品的同批溶剂为对照，采用 1cm的石英吸收池。 以吸收度最大的波长作为测定波长，一般供试品的吸收度读数，以在 0.3-0.7之 间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得 的吸收度偏低。狭缝宽度的选择，应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增 加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后 应减去空白读数，再计算含量。 三、效价测定法 实例（ 1）：抑肽酶效价的测定 抑肽酶 (Trasylol，别名：抑胰肽酶、屈来密多 ) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻 止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和 治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗 休克治疗。在腹腔手术后，直接注入腹腔可预防肠 粘连。 抑肽酶通过酶上的丝氨酸活性部分，形成抑肽酶 -蛋白酶复合物而达到抑制作 用。然而与不同的蛋白酶结合，显示出不同的离解常数。与胰蛋白酶的结合最 牢固与人体纤溶酶的结合不很牢固。 （ 1）底物 溶液的 制备 (2) 胰蛋白酶 稀释溶液的制备 精密量取胰蛋白酶溶液 1ml，用硼砂氯化钙缓冲液（ pH 8.0）稀释成 20ml，室温 放置 10min ，置于冰浴中。 取 N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯盐酸盐 171.3mg，加水溶解并稀释至 25ml。临用时配制。胰蛋白 酶溶液的 制备 取胰蛋白酶对照品适量，精密称定，加盐酸滴定液（ 0.001mol/L）溶解并制成每 1ml中约含 0.8单位（每 1ml中约含 1mg）的溶液，临用时配制并 置于冰浴中。 (3) 供 试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加硼砂一氯化钙缓冲液（ pH 8.0）溶解并制成每 1ml中约含 1.67 单位（每 1ml中约含 0.6mg）的溶液，精密量取 0.5ml与胰蛋白酶溶液 2ml，再用硼砂一氯 化钙缓冲液（ pH 8.0）稀释成 20ml，反应 10分钟，置冰浴中（ 2小时内使用）。 (4) 测定 法 取硼砂氯化钙缓冲液（ pH 8.0） 9.0ml与底物溶液 1.0ml，置 25ml烧杯中，于 25 0.5 恒温水浴中 放置 3 5分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）调节 pH值为 8.0，精密加入供试品溶液（ 经 25 保温 3 5分钟） 1ml，并立即计时，用 1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）滴定释 放出的酸，使溶液的 pH值始终保持在 7.9 8.1。每隔 60秒读取 pH值恰为 8.0时所消耗的氢氧化钠滴定 液（ 0.1mol/L）的体积（ ml），共 6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液 1ml，按上法操作，作为对 照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）为纵坐标作图，应为一条 直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）的体积（ ml），按下式计算。 每 1mg抑肽酶的效价（单位 ） 式中 4000为系数； W为抑肽酶制成每 1ml中约含 1.67单位时的酶量， mg； n1为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）的体积， ml； n2为供试品溶液每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）的体积， ml； 2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照测定时的 2倍； f为氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L）校正因子。 效价单位定义 能 抑制一个胰蛋白酶单位 每秒钟能水解 1mol的 N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯（ BAEE）为一个胰 蛋白酶单位（ microkatal） 的活力称为一个抑肽酶活力单位（ EPU）。每 1EPU的抑肽酶相当 于 1800KIU。 注意 事项： （ 1）本实验测定原理：在一定条件下（ pH8.0， 25 ），胰蛋白酶可使 N-苯 甲酰 -L-精氨酸乙 酯水解为 N-苯甲酰 -L-精氨酸，使溶液 pH下降，当加入氢氧化 钠滴定后，使溶液 pH又回到 8.0，水解继续进行。 （ 2）当胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使 50%的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰 蛋白酶继续与底物进行水解反应，用氢氧化钠滴定释放出的酸，使 pH始终维 持 7.98.0，在一定时间内，根据根据样品消耗的氢氧化钠（ 0.1mol/L）的体 积（ ml)算出活力单位。 实例（ 2）杆菌肽效价测定： 利用杆菌肽能够抑制微生物生长特性，进行实验设计。通过与标 准品对微生物产生抑菌圈面积的大小，从而得到待测样品相对与标 准品的效价 实例（ 3）缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通 过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品 的效价。 总结： 在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式： 第一种属于比较精准的定量 如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多 肽分子结构上的特点。方法一利用游离的氨基或羧基，使多肽表现出酸碱性，可以利用低浓 度酸或碱进行滴定；方法二利用某些特性的官能团来进行定量。因此再要进行对某种多肽物 质进行定量时，可以从结构特性下手，利用特性化学反应或者物理特性进行定量。 第二种属于一种比较抽象的定量方式 效价测定。跟酶活力单位类似是一个可以随人为