毕业论文-城市生活污水用于产油微藻的培养.doc

毕业论文 作 者： 学 号： 院 系： 化化 学学 工工 程程 学学 院院 专 业： 生生 物物 工工 程程 题 目：城市生活污水用于产油微藻的 培养 指导者： 评阅者： 2013 年 6 月 吉 林 摘 要 i 摘摘 要要 将废水与产油微藻培养结合起来，可以实现废水的无害化处理，还可为微藻的培养 提供营养组分和大量水源。利用高产油的小球藻，以城市生活污水为水源，考察了添加 不同营养组分对小球藻细胞的生长、生物质产量、总脂含量以及氮磷去除情况的影响。 结果表明：城市生活废水非常适合于产油微藻的培养。利用生活废水进行微藻培养中， 需补充添加无机氮、无机磷、铁离子以及微量元素，而这些营养组分的加入量对藻细胞 的生长、生物量和油脂积累有重要影响。在优化的废水培养基中微藻细胞浓度可达1.9 g/l 左右，高于标准se培养基 1.4 g/l的水平。微藻细胞对于无机氮与磷有着高的吸收 能力，在废水中添加钙离子浓度为25 mg/l，镁离子浓度为75 mg/l，铁离子浓度为0.5 mg/l和足量微量元素条件下， 无机氮含量小于187.5 mg/l，无机磷含量小于18.75mg/l 的生活污水接种小球藻培养 78 d 后，培养液水体中氮磷残留量会小于20%，收获的小 球藻藻液油脂含量在8.4%左右。由此表明利用城市生活废水培养含油微藻在获得微藻油 脂产品的同时将水体的氮磷无害化处理实现是可以实现的。 关键词 小球藻培养，城市生活废水，微藻生物量,氮去除率，磷去除率,油脂含量，生 物柴油 abstract ii abstract municipal wastewater is usually problematic for the environment. the process of oleaginous microalgal culture requires large amounts of nutrients and water. therefore, we studied the feasibility of oleaginous microalgal culture of scenedesmus dimorphus in bubbled column photobioreactor with municipal wastewater added with different nutrients. s. dimorphus could adapt municipal nutrient-rich wastewater by adding some nutrients as nitrogen, phosphorus, ferric ammonium citrate and trace elements,and the amounts of such nutrients have significant effects on cell growth, biomass yield and lipid accumulation. at optimum compositions of wastewater medium, the algal cell concentration could reach1.9 g/l, higher than that of 1.4 g/l in standard se.furthermore, s. dimorphus had strong capacity to absorb inorganic nitrogen and phosphorus from its culture water. micro algae cells for inorganic nitrogen and phosphorus have a high absorption capacity, adding calcium ion concentration in the wastewater is 25 mg/l, the magnesium ion concentration of 75 mg/l, iron ion concentration is 0.5 mg/l and under the condition of sufficient trace elements, containing inorganic nitrogen under 187.5 mg/l, 18.75 mg/l under the inorganic phosphorus in the sewage vaccination chlorella training after 7 8 d, nutrient solution of nitrogen and phosphorus in water residue is less than 20%. suggesting that cultivate oil micro algae using the urban life waste water can be gained in micro algae oil products at the same time realize the innocent treatment of nitrogen and phosphorus of the water body. key words chlorella cultivation, municipal wastewater, algal biomass,nitrogen removal rate，phosphorus removal rate，oil content，biodie 目 录 iii 目 录 摘 要i abstract .ii 目 录.iii 第 1 章 绪 论- 1 - 1.1 课题研究背景- 1 - 1.1.1 水污染现状- 1 - 1.1.2 微藻净化污水- 2 - 1.1.3 微藻生物柴油- 3 - 1.1.4 污水深度处理和生物柴油生产耦合系统.- 4 - 1.2 课题研究目的和意义- 4 - 1.3 国内外微藻净化污水现状- 5 - 1.4 主要研究内容与技术路线- 8 - 1.4.1 主要研究内容- 8 - 1.4.2 采用的技术路线- 8 - 第 2 章 实验材料和方法- 9 - 2.1 实验材料和仪器.- 9 - 2.2 实验方法.- 9 - 2.2.1 生活污水的预处理.- 9 - 2.2.2 培养基的配置.- 9 - 2.2.3 微藻细胞的培养及收集.- 10 - 2.2.4 细胞生物量和细胞干重测定.- 11 - 2.2.5 总氮、总磷的测定.- 11 - 2.2.6 cod 的测定- 11 - 2.2.7 藻油测定.- 11 - 第 3 章 实验过程及讨论- 13 - 目 录 iv 3.1 城市生活污水水质.- 13 - 3.2 小球藻在 se 培养基上的生长 .- 13 - 3.3 小球藻细胞干重和 od 值间线性关系.- 14 - 3.4 营养条件和培养条件的优化.- 15 - 3.4.1 小球藻最佳培养条件.- 15 - 3.4.2 不同营养成分对小球藻处理废水及油脂积累的影响.- 18 - 3.4.3 钙离子对小球藻生长的影响.- 21 - 3.4.4 镁离子单因素实验.- 22 - 3.4.5 铁离子单因素实验.- 23 - 3.4.6 无机氮单因素实验.- 24 - 3.4.7 无机磷单因素实验.- 26 - 3.4.8 无机氮无机磷不同浓度组合实验.- 28 - 3.5 本章小结.- 30 - 第 4 章 微藻生产生物柴油初步探讨- 31 - 结 论- 32 - 参考文献- 33 - 致 谢- 35 - 东北电力大学本科毕业设计论文 - 1 - 第第 1 章章 绪绪 论论 1.1 课题研究背景 1.1.1 水污染现状 21 世纪人类面临着水资源危机，水资源短缺成为制约人类发展的主要瓶颈之 一。而水污染更是加剧了水危机，据估计，全世界每年约有 4200 多亿 m3的污水 排入江河湖海，污染了 5.5 万亿 m3的淡水，这相当于全球淡水总量的 14%以上1。 水污染对人类身体健康造成很大危害。在发展中国家约有 10 亿人喝不清洁水， 每年约有 2500 多万人死于饮用不洁水，全世界平均每天有 5000 名儿童死于饮用 不洁水，约 1.7 亿人饮用被有机物污染的水，3 亿城市居民面临着水污染。在肝癌 高发区流行病的调查表明，饮用藻茵类毒素污染的水是肝癌的主要原因1。 水污染也对社会的发展造成很大的影响。多年来，我国水资源质量不断下降， 水环境持续恶化，由于污染所导致的缺水和事故不断发生，不仅使得工厂停产、 农业减产甚至绝收，而且造成了不良的社会影响和较大的经济损失，严重威胁社 会的可持续发展1。 在我国经济的飞速发展和城市化的快速推进，使得大量富含氮、磷等营养物 质的生活污水、工业废水及农业废水流入自然水域，从而导致了水体的富营养化。 我国七大水系和周边海域都遭到了不同程度的污染。其中海河、辽河、黄河、淮 河及渤海等污染都相当严重，基本全都是由氮和磷引起的水体富营养化和赤潮； 全国超过四分之三的湖泊也出现了不同程度的富营养化，尤以巢湖、滇池、太湖 为重；近岸海域四类、劣四类海水水质占 30%，超标污染物质主要为氮和磷。这 已对生态系统和社会经济的发展造成很大的负面影响。受技术水平，短期利益使 然和法制不健全因素的影响，我国大多数污水都未经严格处理就被排放到公共水 域里去了，因此除去污水中的氮磷是修复水环境的主要课题。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 2 - 污水再生利用是解决水污染这一问题的重要途径，而如何经济有效地净化污 水成为关键。微藻作为一种自然环境的净化者，自 20 世纪 50 年代就被 oswald 等 提出用于处理废水中的无机氮磷以及金属元素等污染物质的去除。与传统方法相 比，利用藻类处理污水可以克服传统污水处理方法易引起的二次污染、潜在营养 物质丢失、资源不能完全利用等弊端，同时能够有效去除造成水体富营养化的氮、 磷等营养物质 1 2。 1.1.2 微藻净化污水 微藻也称单细胞藻类, 是一种在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻类类群。 约占全球已知 3 万余种藻类的 70%。藻类大多具有从水相中吸收有毒物质或降解 有机污染物的能力。微藻具有资源丰富、种类繁多、光合效率高、生长速度快 、 易无性繁殖和适应性强的特点, 因此可利用藻类进行污水处理和水环境修复。 微藻在污水处理中去除氮磷的机理包括直接作用和间接作用。微藻细胞能够 利用水体中多种无机氮和有机氮化合物作为氮源, 利用二氧化碳和碳酸盐作为碳源， 进行光能自养生长。被藻细胞吸收的硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐可以用于氨基酸和 蛋白质等物质的合成；水中的磷可直接被藻细胞吸收,并通过多种磷酸化途径转化 成 atp、磷脂等有机物。同时，微藻的光合作用造成水体 ph 值升高，导致正磷酸 盐和 nh3h2o 分别通过形成沉淀和挥发的形式去除，从而间接去除氮磷。此外， 微藻光合作用形成高 ph 值，也可起到一定的污水净化作用。 因此，基于光合作用，微藻细胞可以用来去除污水中的氮、磷等营养物质， 并以有机物的形式将其储存在藻细胞中2。 1.1.3 微藻生物柴油 微藻能够在淡水环境或海洋环境中通过光合作用快速生长，它的生物质产量 和细胞含油量也比陆生的油料作物要高出许多，可以达到传统油料作物的几倍乃 至几十倍之多。与一般的传统油料作物相比，因为微藻的细胞结构更简单，可以 东北电力大学本科毕业设计论文 - 3 - 在水生环境中悬浮生长，所以它利用光能、co2、水、矿物质以及其它营养物质进 行生长代谢，从而它生产有机物的效率更高。一些微藻的油脂含量可以占其总干 物质重量的 20%-40%，某些特殊的藻种在一些特定的条件下，其油脂含量甚至可 以达到总生物质干重的 75%。相关研究表明，通过养殖产油微藻，每公顷土地每 年可获得的油脂高达 15000 升，而传统的油料作物如大豆等，每公顷土地每年的 产量却只有 150200 升。微藻的高生产效率以及高含油量表明：藻类在用作生产油 脂的原料方面的潜力是巨大的。与传统油料作物相比，藻类具有环境适应能力强、 生长周期短、不占用耕地、生物产量高等特点。因此，能源微藻生产油脂实现产 业化的必经发展之路是使其能大规模、高密度的培养。这样才能降低生产成本、 提高能源微藻的生长速率。 微藻的油脂合成从微藻进行光合作用开始，微藻的光合系统中存在的 ps i 和 ps ii 可以将光能转化为化学能，然后化学能在微藻体内经过一系列的传递，最终 进入到卡尔文循环，在卡尔文循环中，一种名叫核酮糖一 1,5 一二磷酸的物质在核 酮糖一 1,5 一二磷酸梭化酶的催化作用下固定 co2并且生成了 3-磷酸甘油酸，然 后 3-磷酸甘油酸会进一步生成其他油脂。 在进行能源微藻工业化大规模培养以生产生物柴油用时，能源微藻生长所需 要的 n、p 营养盐以及微量元素等各种营养物质成本在其总的生产成本中占有相当 大的比例。目前，藻类养殖成本过高成为制约藻类生产油脂技术大规模工业化发 展的主要瓶颈3。因此，找到合适的廉价培养基，降低生产成本，成为该技术的关 键之一。而每年城市生活污水的排放达到一个惊人的量，其含有丰富的营养盐， 基于微藻培养的污水深度处理和生物柴油生产耦合系统应运而生3。 1.1.4 污水深度处理和生物柴油生产耦合系统 基于微藻培养的污水深度处理和生物柴油生产耦合系统是在污水处理厂二级 沉沉池之后构建微藻光生物反应器，选择高含油的脱氮除磷优势藻种接种于微藻 光生物反应器，以二级出水为培养基培养微藻。由于光合放氧作用，微藻光生物 东北电力大学本科毕业设计论文 - 4 - 反应器的出口气体含有浓度相对较高的 o2，可用于二级生物处理中曝气池的曝气； 由于活性污泥中微生物的呼吸作用，曝气池的出口气体含有浓度相对较高的 co2，可用于微藻光生物反应器的曝气（如污水处理厂附近有热电厂，可向微藻光 生物反应器中通入热电厂废气，其中的高浓度 co2可作为微藻生长所需的无机碳 源） 。在微藻光生物反应器内部或外部，通过膜分离截留和浓藻液回流的方式，实 现反应器内部微藻的高密度培养，同时膜分离可得到低氮磷含量的清水。膜分离 得到的高密度藻液通过进一步浓缩、提取油脂，最终可制备生物柴油3 4。 1.2 课题研究目的和意义 随着全球化石能源短缺和环境不断恶化问题的日益突出，生物柴油作为一种 可持续的绿色能源形式，受到世界范围内的广泛关注。目前全球各国都在大力发 展生物柴油产业，但其最大的瓶颈在于大规模低成本可持续性油脂原料的供应。 微藻是一种浮游的光自养微生物类群,广泛存在于海洋、湖泊、河流等水体环境中， 其中有很多藻种在特定环境条件下,可以积累大量的油脂产物，用于生物柴油生产， 同时由于其光合效率高、生长速度快、产油量高、吸收 co2 作为碳源利用、不与 民争粮和不与粮争地等优势，因而具有比传统油料作物更高的发展潜力。 微藻培养主要采用的是液体悬浮式的培养，水源、营养盐等消耗大,培养成本 过高使得微藻能源产品的生产成本过高，因此发展微藻生物能源技术，除了通过 培养技术突破大幅度提高微藻产率外，解决廉价的水资源和营养盐成本也是降低 微藻培养成本的重要措施之一。人类社会生产和生活产生大量富含氮磷的废水， 这些废水的无害化处理已成为环境保护的重要问题，利用废水来培养产油微藻， 能够实现废水深度处理与产油微藻培养藕合，一举两得。 本课题研究利用城市生活污水进行规模化能源产油微藻培养，同时进行产油 微藻对城市生活污水处理效果的研究，为工业废水治理提供可行性的技术基础。 1.3 国内外微藻净化污水现状 目前污水氮磷处理方法主要有物理化学法和生物法。物理化学法处理费用较 东北电力大学本科毕业设计论文 - 5 - 高，且易产生二次污染，越来越多的学者关注生物处理法。废水二级处理出水的 进一步脱氮除磷是国内外研究的难题和热点。传统的生化二级处理除磷工艺使大 量的磷从污水转移至剩余污泥中，从根本上看，仍然不能消除磷对生态环境的影 响。藻类是自养型生物，其生长对废水中的营养要求较低。藻细胞以光能作为能 源，利用氮、磷等营养物质合成复杂的有机质。因此，藻类可降低水体中的氮、 磷含量。 微藻在污水处理中去除氮磷的机理包括直接作用和间接作用。微藻细胞能利 用水体中多种无机氮和有机氮化合物作为氮源, 利用二氧化碳和碳酸盐作为碳源， 进行光能自养生长。被藻细胞吸收的硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐可以用于氨基酸和 蛋白质等物质的合成；水中的磷可直接被藻细胞吸收,并通过多种磷酸化途径转化 成atp、磷脂等有机物。同时，微藻的光合作用造成水体ph值升高，导致正磷酸 盐和 nh3h2o 分别通过形成沉淀和挥发的形式去除，从而间接去除氮磷。此外， 微藻光合作用形成高ph值，也可起到一定的消毒作用。 作为一种新型的“绿色”技术，利用藻细胞去除污水中的氮磷主要有以下优 势： a.能源（太阳光）充足； b.去除氮磷的同时可固定 co2； c.去除氮磷无需投加外部碳源； d.处理出水中含有丰富的溶解氧； e.无污泥处置问题，无二次污染； f.获得的藻细胞利用途径多（如动物饲料、生 物沼气、生物柴油等）。 由于微藻的上述优势，加之其生长速度快，代谢迅速，对污水的净化效率高, 因此利用微藻净化污水已经成为污水处理中的重要研究方向。 20世纪60年代，出现了高速率藻塘，它通过形成藻菌共生系统来净化污水。 此工艺既有传统氧化塘工艺投资省、运行费用低、易管理等特点，较普通氧化塘， 它又能承受更高负荷的污水，塘更浅。但由于其主要依靠自然生长的藻类和半人 工控制手段，藻类的生长受到许多因素的控制，处理效果的稳定性受到影响。同 时，出水中藻类难以收获或收获费用太高，这些都严重阻碍其进一步的应用发展。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 6 - 1971年，mcgriff 等提出“活性藻”方法，把藻类和活性污泥结合起来，使藻类具 有与活性污泥一样良好的絮凝沉降性能，再采用与活性污泥相似的流程来处理污 水，污水中氮的去除率达92%，磷的去除率达94%。但由于活性污泥的遮光作用， 使得光因子成为对“活性藻”工艺影响较大的因素，进而阻碍了“活性藻”在工 程中的推广应用5。 20世纪80 年代，微藻的固定化技术逐渐发展起来。该技术利用物理和化学手 段将游离细胞定位于限定的空间区域，使其保持生物活性并可反复利用。国内外 学者对此做了大量的实验，指出固定化藻类对氮、磷的净化效率明显高于悬浮态 藻。tam等研究了普通小球藻在悬浮态和固定态下，对模拟生活污水的净化效果， 结果表明固定态小球藻对氮、磷的去除率分别为78%和94%，而悬浮态小球藻的去 除率仅为40%和59%，因此，固定化小球藻的净化效率比悬浮态的小球藻要高得多 5。 随着研究的深入，现在正逐步采用多种藻类或者藻类和大型水生植物共同作 用净化污水。已经有科学家证明了多种藻类或者藻类与大型水生植物对污水中氮、 磷的去除效果很好，甚至比只有微藻单独作用于污水的效果还好。目前已出现一 种具有高光能利用效率、造价相对便宜、适于污水处理及藻类资源收获一体化的 光生物反应器，但该反应器培养藻类仍处于实验室研究阶段。我国微藻研究中， 微藻光生物反应器也是一个新方面。华南理工大学正在展开这项工作，并已取得 了良好的进展5 6。 近几年生物膜反应器技术的成功应用和金属硫蛋白基因向蓝藻中转移的成功， 进一步推动了微藻在污水处理方面的研究与应用7。 虽然目前利用微藻净化污水的研究已取得一定的进展，但是，除了一些个别 的应用以外，大多数处理方法均处于实验室阶段，在实用化或工业化应用上还有 许多问题有待研究。如处理量较少、周期较长、污水往往需要预处理等。此外， 还需解决藻体的收集问题，微藻体积小、质量轻，浮游生活，沉降性能很差，传 统的静止沉淀方法很难达到良好的固液分离效果。理想的解决方法是通过藻类修 东北电力大学本科毕业设计论文 - 7 - 复配套技术(如菌藻共生)，利用分解菌将藻体吸附的有毒重金属经生物转化而解毒， 解决藻类收集困难的问题而实现规模应用，提高修复效率。未来的研究方向集中 在以下几方面： a 新型藻类资源的开发与应用：选育和改良新型藻种，继续筛选具有高效净 化能力的微藻，重点是筛选对有机物具有降解能力和自身经济价值较高的藻种。 b 通过转基因技术获得重金属耐受株，或鉴定、克隆相关基因，将有助于揭 示藻类重金属耐性和解毒机制，并推动相关领域的研究。 c 廉价及性能良好的固定化载体开发：藻类固定化首先需要选择理想的固定 化载体。目前，固定化载体主要有天然高分子凝胶，如海藻酸钙、琼脂等和有机 合成高分子凝胶载体，如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。天然高分子对生物没有毒害， 传质性能较好，但是强度较低；有机合成高分子凝胶强度较大，但其传质性能稍 差。 d 藻类生长繁殖条件的控制。由于微藻培养和污水处理耦合系统的前期投资 较大，必须满足微藻最佳的培养条件和污水处理最低的运行成本，既要选择合适 的光照方式，提高光能利用率，选用合适的培养系统，达到最大的培养数量，又 要考虑出水水质和环境条件对污染物的影响等7。 1.4 主要研究内容与技术路线 1.4.1 主要研究内容 针对微藻生物培养在生活污水处理与能源开发应用方面的有机结合，本文在 已有研究的基础上，着重研究筛选适合在城市生活污水环境下生长的产油型小球 藻，考察在废水基质中添加不同的营养成分下藻细胞的生长及油脂积累，研究通 过对营养条件和培养条件优化来引导细胞代谢进入脂合成过程，从而实现微藻高 效处理污水的同时高产油。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 8 - 1.4.2 采用的技术路线 以城市生活污水为原料，根据污水所含有丰富营养物质的特点，大规模培养 微藻，再浓缩提取微藻油脂进而生产微藻生物柴油，其技术路线如图 1-1 所示8。 微藻培养系统 分离浓缩 城市生活污水 浓藻液 油脂提取 生物柴油 图 1-1 城市生活污水生产生物柴油技术路线图 东北电力大学本科毕业设计论文 - 9 - 第第 2 章章 实验材料和方法实验材料和方法 2.1 实验材料和仪器 试剂：nano3；nacl；k2hpo4；mgso47h2o；cacl22h2o；fe- edta；fecl36h2o；kh2po4；znso47h2o；cuso47h2o；mncl24h2o ；na2moo42h2o；co(no3)2；cuso45h2o ；caco3 ；菜园土； hcl；naoh；h3bo3等。 仪器：紫外可见分光光度计、离心机、锥形烧瓶、量筒、烧杯、高压蒸汽灭 菌锅、水浴锅、滴定管等。 藻种：本实验采用的是实验室保持的纯种小球藻 污水：实验所用城市生活废水取自吉林省吉林市东北电力大学污水排放口， 取水时间为春季下午16:00 左右。 2.2 实验方法 2.2.1 生活污水的预处理 废水经过孔径为45 m筛绢过滤，去除固形物；再进行高压蒸汽灭菌后，放在 荫凉处保存备用。测定灭菌后污水的化学需氧(cod)、总氮(tn)、总磷(tp)、ph 等，结果见表3-1。 2.2.2 培养基的配置 活化小球藻培养基为 se 培养基，其组成如表 2-1。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 10 - 表 2-1 se 培养基的组成 成分 质量（g/l）成分质量(g/l) nano30.25nacl0.025 k2hpo40.075fecl36h2o0.0005 mgso47h2o0.075fe-edta1ml cacl2h2o0.025a51ml kh2po40.175 a5是微藻生长所需的各种微量元素的混合溶液，是微藻生长所需的营养元素， 其组成如表2-2。 表 2-2 a5 的组成 成分质量（g/l）成分质量(g/l) h3bo32.86cuso45h2o0.08 mncl24h2o1.86co（no3）20.05 znso47h2o0.22土壤提取液40ml na2moo42h2o0.39 土壤提取液作为培养基的一个成分,采取 1 茶匙干燥菜园土, 1 撮 caco3和 200 ml 蒸馏水。装入特定的容器并盖好,然后在每 2 个连续作业日内,每天蒸汽处理 2 h。再于 10下冷藏 24 h 以上,恢复到室温后倾倒出上清液供配方使用。nano3和 k2hpo4分别被作为 n 源和 p 源加入到微藻培养基中,调节 ph 到 7.1 后高压灭菌或 过滤杀菌。 2.2.3 微藻细胞的培养及收集 微藻原种培养在 250 ml 的锥形瓶中的 100 ml 培养基中进行,每 16 d 传代培养 1 次。生长温度为培养室的常温(25),光照由冷白光和日光灯荧光混合组成,光照 强度为光子 150190mol/(m2s),昼夜比 12：12。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 11 - 所有藻类菌株在锥形烧瓶中培养,细胞初始浓度为(1105)个/ml,培养基为 170 ml,重复 3 次，持续培养至藻细胞增长静止阶段。培养结束后采用离心法(60001 0000 r/min)离心 10 15 min,收集微藻细胞。 2.2.4 细胞生物量和细胞干重测定 用紫外可见分光光度仪测定微藻溶液在 680 nm 处的吸光值（od680）。用移 液器移取 3 ml 待测藻液于 1cm 比色皿中，以去离子水为空白对照，通过每天测定 吸光值绘制微藻的生长曲线9。 细胞干重和od680呈线性关系： 细胞干重（mg/l）=aod680nm+b（式 2-1） 2.2.5 总氮、总磷的测定 微藻培养液于 7000 r/min 离心 3 min 后，收集上清液用于总氮、总磷含量测 定。总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法 (gb 11894-89，水质总氮的测定)， 总磷采用钼酸铵分光光度法测定 (gb 11893-89，水质总磷的测定) 7。 2.2.6 cod 的测定 水样 cod 的测定采用高锰酸钾法，在酸性条件下以高锰酸钾为氧化剂，在沸 水浴中加热反应一定的时间，剩余的高锰酸钾加过量的草酸钾溶液还原，再用高 锰酸钾溶液回滴过量的草酸钾，以高锰酸钾指数表示，单位 mg/l9。 2.2.7 藻油测定 微藻在指数生长末期收获，于 7 000 r/min 离心 5 min，灭菌的蒸馏水清洗 3 次，经冷冻干燥，置于-20冰箱中冻存备用。 将冷冻干燥后的微藻干粉，按 1 g 藻粉：3 g 石英砂的比例混合，置于研钵中 充分研磨后，加入氯仿甲醇混合溶剂（氯仿甲醇水的体积比 120.8）提取 东北电力大学本科毕业设计论文 - 12 - 油脂。将混合体系于涡旋振荡器上振荡 5 min，静置 15 min 后离心（6 000 r/min，2 min），收集上层提取液，下层沉淀重复上述操作，共提取 3 次。合并所 有的提取液，加入氯仿和水，使氯仿、甲醇和水的最终体积比为 110.9。将混 合液摇匀后静置分层，收集下层氯仿层，在旋转蒸发仪中 60蒸去溶剂氯仿。对 所得油脂称重，计算微藻中油脂的得率10。 油脂得率 = 所得油脂重量 / 藻粉重量100%（式 2-2） 东北电力大学本科毕业设计论文 - 13 - 第第 3 章章 实验过程及讨论实验过程及讨论 3.1 城市生活污水水质 对所取污水进行水质检测，每个指标重复测量 3 次，结果以平均值表示，实 验结果见表 3-1。 表 3-1 城市生活污水特性 参数 c（mg/l） c（mg/l） c（mg/l） 平均值 （mg/l） cod 23.32 23.40 23.34 23.35 tn 14.4 14.6 14.6 14.5 tp 1.65 1.65 1.66 1.65 ph 7.0 7.0 7.0 7.0 3.2 小球藻在 se 培养基上的生长 以标准 se 培养基培养处于对数生长期的小球藻为种子液，接种于 300ml 锥 形烧瓶生物反应器中（接种量为 5%），于温度为 (281) ，光暗周期为 12：12h，光强为 3500 lx 条件下摇瓶震荡培养，实验设 3 个平行组对照。每天取 样测定 od680以监测微藻细胞生长情况，生长曲线如图 3-1。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 024681012 时间（d） od值 东北电力大学本科毕业设计论文 - 14 - 图 3-1 小球藻在 se 培养基上的生长曲线 培养结束后对培养液进行离心（7 000 r/min，5 min），对离心所得藻液进行 冷冻干燥保存，然后取干藻粉进行藻油含量的测定实验，测得的平均结果为 8.3%。 3.3 小球藻细胞干重和 od 值间线性关系 用 se 培养基培养小球藻，取不同培养时期的小球藻培养液液进行细胞干重的 测定，同时检测藻液的 od680，以求得小球藻的细胞干重和 od680间公式。共进行 了 10 组实验，每组做 3 次平行的实验，取平均值为实验结果，实验结果如图 3- 2。 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 00.10.20.30.40.5 od值 藻细胞干重（g/l） 图 3-2 藻细胞干重与 od 值的关系图 实验结果表明藻细胞干重和 od680间呈线性关系，通过对实验数据的计算得 出以下公式： 细胞干重（g/l）=0.357od6800.0027，r2=0.9947 东北电力大学本科毕业设计论文 - 15 - 3.4 营养条件和培养条件的优化 3.4.1 小球藻最佳培养条件 (1)光暗周期对小球藻生长的影响 以 se 培养基培养小球藻，设置 5 个实验组，每组 3 个平行实验。小球藻在培 养箱中培养，光照周期通过通过调节培养箱内日光灯光照和黑暗时间来调节，每 天检测 od680来监测小球藻的生长情况，共检测 18 天的小球藻培养液的 od 值。 实验结果如图 3-3。 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 05101520 时间（d） od值 24;0 8:16 12:12 16:08 0:24 图 3-3 小球藻在不同光暗周期条件下的生长曲线 如图 3-3 所示，小球藻生长趋势较好的光暗周期是 8：16 和 12：12，而在第 14 天 12：12 的实验组小球藻的 od 值远大于光暗周期为 8：16 的实验组。在全黑 暗条件下，小球藻几乎不生长。而全光照条件和 16:8 的光暗周期下，小球藻的生 长较缓，最大 od 值在 0.15 左右，远小于最大值 0.2。可见培养小球藻较适宜的光 暗周期是 12：12。 （2）ph 对小球藻生长的影响 实验设置 5 组 ph 条件，以 se 培养基为基础，通过添加 0.1mol/lhcl 溶液或 东北电力大学本科毕业设计论文 - 16 - naoh 溶液来调节培养液 ph，使培养液的 ph 为 6、7、8、9，另一组不调节 ph 使培养液的 ph 为自然状态，每天检测 od680以监测小球藻的生长情况，共进行了 13 天的实验，实验结果见图 3-4。 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 02468101214 时间（d） od值 ph自然 ph6 ph7 ph8 ph9 图 3-4 小球藻在不同 ph 条件下的生长曲线 如图 3-2 所示，小球藻生长趋势较好的是 ph 为 7、8、9 的实验组，而在第 13 天，ph 为 9 的实验组小球藻的 od 值更是达到 0.29 远大于其他组，可见小球藻适 宜在碱性条件下生长。 （3）不同氮源对小球藻生长的影响 以 se 培养基的营养成分为基础，考察不同氮源对小球藻生长的影响。实验设 置 5 组实验，分别将 nano3、nh4no3、尿素、nh4cl 作为氮源用于小球藻的培养， 通过计算各物质的加入量使得溶液中总氮的浓度相当。每天检测培养液的 od680以 监测小球藻的生长，实验结果如图 3-5。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 17 - 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 02468101214 时间（d） od值 硝酸钠 硝酸铵 尿素 氯化铵 图 3-5 不同氮源条件下小球藻的生长曲线 如图 3-5 所示，以 nano3为氮源的实验组的小球藻的生长趋势明显比其它组 的好，在第 12 天培养液的 od 值达到最大为 0.107 远大于其他三组的平均值，由 此可见小球藻生长的最佳氮源是 nano3。 （4）ph 与氮源的正交实验 设置 a、b、c 三大组实验，通过通过添加 naoh 溶液来调节培养液 ph，使 培养液的 ph 分别为为 7、8、9。每个大组又分为 3 组实验分别用 nano3、nh4no3、nh4cl 作为氮源，其他组分参照 se 培养基。每组进行 3 平行 实验，小球藻均在 12：12 的光暗周期的条件下培养，每天进行的检测 od680以监 测小球藻的生长情况，共进行了 13 天的实验，实验结果见表 3-2。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 18 - 表 3-2 ph 与氮源的正交实验结果 ph=7.0ph=8.0ph=9.0时 间nano3nh4no3nh4clnano3nh4no3nh4clnano3nh4no3nh4cl 1d0.0040.0030.0030.0040.0040.0020.0030.0030.004 2d0.0070.0040.0050.0060.0040.0030.0050.0070.008 3d0.0150.0090.0100.0170.0110.0090.0230.0140.016 4d0.0210.0170.0210.0270.0200.0210.0460.0350.052 5d0.0560.0450.0540.0640.0870.0990.0870.0910.100 6d0.0940.0910.1200.1000.1690.2370.1650.1560.178 7d0.1580.1630.2180.1770.2950.3160.2780.2890.234 8d0.2130.2060.2910.2850.3530.3680.3660.3500.277 9d0.3420.3570.3670.3680.3740.3700.4090.3720.302 10d0.3940.3640.3360.4760.3870.3750.4100.3690.351 11d0.4130.3860.3710.4930.4030.4010.3960.3570.344 12d0.4070.3740.3650.4850.3850.3840.3610.3440.315 13d0.3770.3740.3720.4420.3690.3730.2950.2730.332 由表可见，od 值最大的是培养到第 12 天的以 nano3为氮源且 ph 为 8.0 的培 养液，所以适宜小球藻生长的氮源和 ph 组合为 nano3为氮源和 ph 为 8.0 的组合。 3.4.2 不同营养成分对小球藻处理废水及油脂积累的影响 以 se 培养基各种营养母液和微量营养元素为基础，实验设置 6 组营养元素组 合条件，每组实验设 3 个平行组实验，在适宜的培养条件下（光暗周期为 12：12，ph 为 8.0，28），考察以城市生活污水培养小球藻时钙离子、镁离子、 铁离子、a5 与 edta 的添加对微藻生长及污水处理的影响，添加量按标准 se 培 养基，以 od680监测指标并取样测得水样中总氮浓度的变化，每隔 4 天测一次培养 液的 od680，同时对上层离心液进行总氮总磷的测定，共进行 5 次实验测定。 第 1 组以不添加任何其他物质的纯污水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻， 东北电力大学本科毕业设计论文 - 19 - 第 2 组以添加 cacl2h2o 的污水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻，第 3 组以 添加 mgso47h2o 的污水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻，第 4 组以添加 nafe（edta）2的污水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻，第 5 组以添加 edta 的污水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻，第 6 组以添加微量元素的污 水在锥形烧瓶生物反应器中培养小球藻11。各物质的添加量参照 se 培养基。实验 结果见图 3-6,3-7,3-8。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0510152025 时间（d） od值 纯污水 污水+ca离子 （25mg/l） 污水+mg离子 （75mg/l） 污水+fe离子 （0.5mg/l） 污水+a5 （1ml/l） 污水+edta （25mg/l） 图 3-6 小球藻在不同营养条件下的生长曲线 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0510152025 时间（d） tn(mg/l) 纯污水 污水+ca离子 （25mg/l） 污水+mg离子 （75mg/l） 污水+fe离子 （0.5mg/l） 污水+a5 （1ml/l） 污水+edta （25mg/l） 图 3-7 不同营养条件下污水的总氮浓度变化 东北电力大学本科毕业设计论文 - 20 - 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0510152025 时间（d） tp(mg/l) 纯污水 污水+ca离子 （25mg/l） 污水+mg离子 （75mg/l） 污水+fe离子 （0.5mg/l） 污水+a5 （1ml/l） 污水+edta （25mg/l） 图 3-8 不同营养条件下污水的总磷浓度变化 如图 3-6 所示，从第 2、3、4 组条件的 od680生长曲线看，在添加 cacl2h2o、mgso47h2o、nafe（edta）2的条件下，小球藻的生长趋势明显 比 1 组纯废水、5 组添加 a5 和 6 组添加 edta 的培养基生长强，而且第 1、5、6 组的生长趋势相近，三曲线几乎重合，培养 20 天后六组实验中 od680最高的是第 4 组达到 0.92，而第 2 第 3 组分别达到 0.82 和 0.83，略大于第1 组的 0.76，表明钙 离子、镁离子、铁离子对小球藻的生长有促进作用。 如图 3-7 所示，从第 2、3、4 组条件的污水总氮浓度含量曲线上可以看出， 在添加 cacl2h2o、mgso47h2o、nafe（edta）2的条件下，污水中总氮浓 度的降低趋势明显比 1 组纯废水、5 组添加 a5 和 6 组添加 edta 的培养基快，培 养 20 天后六组实验中氮的去除率最高的是第 4 组达到 89.7%，而第 2 第 3 组分别 达到 80%和 74.5%，略大于第 1 组的 64.8%，可见在污水中添加钙离子、镁离子和 铁离子对小球藻处理污水中的氮有促进作用。 如图 3-7 所示，从第 4 组条件的污水总磷浓度曲线上可以看出其总磷浓度的 降低趋势明显快于其他六组，而第 3、4 组条件的污水总磷浓度含量曲线上可以看 出，在添加 mgso47h2o、nafe（edta）2的条件下，污水中总磷浓度的降低趋 势略比 1 组纯废水、5 组添加 a5 和 6 组添加 edta 的培养基快，培养 20 天后六 东北电力大学本科毕业设计论文 - 21 - 组实验中氮的去除率最高的是第 4 组达到 94.5%，而第 2 第 3 组分别达到 90.4% 和 91.5%，略大于第 1 组的 84.8%，结果表明污水中有钙离子、镁离子、铁离子对 小球藻处理污水中的磷有促进作用。 培养结束后对培养液进行离心，上清液进行 cod 的测定实验，测得 cod 的 平均结果为 15.08、14.75、14.62、12.10、14.72、14.92mg/l，从结果可以看出污 水中添加钙离子、镁离子、铁离子对小球藻进行污水净化降低 cod 有促进作用。 对离心所得沼液进行藻油测定实验，测得的平均结果为 8.2%、8.1%、8.8%、8.2%、8.6%、8.2%。从六组实验的微藻的油脂含量可以看出， 添加 mgso47h2o 和 a5 的污水培养基培养的小球藻的油脂含量比其它四组实验 的小球藻油脂含量高，也比 se 培养基培养的小球藻油脂含量高，表明镁离子和微 量元素能促进小球藻的油脂积累。 综上钙离子、镁离子、铁离子对小球藻处理污水中得氮磷和降低污水 cod 有 促进作用，其中镁离子可以促进小球藻积累油脂，此外微量元素也能促进小球藻 的油脂积累。 3.4.3 钙离子对小球藻生长的影响 以 se 培养基的钙离子浓度为基准，设置 5 组实验，每组设 3 个平行实验，在 适宜的培养条件下考察 0、0.5、1、1.5 和 2 倍 ca2+，即 0、12.5、25.0、37.5、50.0 mg/l 浓度条件下（镁离子、铁离子的浓度同 se 培养基） ，以 od680为指标，以 3 组实验的平均值为结果，每四天测一次，共进行五次测定。 实验结果见图 3-9。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 22 - 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0510152025 时间（d） od值 纯污水 污水+ca离子 （12.5mg/l） 污水+ca离子 （25mg/l） 污水+ca离子 （37.5mg/l） 污水+ca离子 （50mg/l） 图 3-9 不同浓度 ca2+的废水培养小球藻的生长曲线 如图 3-9 所示，从第 1、2、3 组实验的小球藻生长曲线可以看出在一定范围内 提高溶液中 ca2+可以促进小球藻污水中的生长。而第 4、5 组的小球藻生长曲线几 乎与第三组的小球藻生长曲线重合，表明过高浓度的钙离子并不能促进小球藻在 污水中生长。由此可见适宜小球藻生长的钙离子浓度最低为 25 mg/l。 3.4.4 镁离子单因素实验 以 se 培养基的镁离子浓度为基准，设置 5 组实验，每组设 3 个平行实验，在 适宜的培养条件下考察 0、0.5、1、1.5 和 2 倍 mg2+，即 0、12.5、25.0、37.5、50.0 mg/l 浓度条件下（钙离子、铁离子的浓度同 se 培养基） ，以为指标，以 3 组实验结果的平均值为最后结果，每四天测一次，共进行五次 测定。实验结果见图 3-10。 东北电力大学本科毕业设计论文 - 23 - 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0510152025 时间（d） od值 纯污水 污水+mg离子 （3.75mg/l） 污水+mg离子 （75m