毕业设计（论文）-玉米蛋白生物大分子有机基质为模板的生物矿化过程及其调控机理研究.doc

东南大学学士论文摘要体内骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，由有机质和无机质两大部分构成。随着组织工程学的发展，利用生物大分子有机基质作为调制生物矿化的模板，设计生物材料并将其用于骨组织的修复取得了较大的进步。玉米蛋白是一种来自于玉米的含大量疏水氨基酸的醇溶蛋白质，由于玉米蛋白具有良好的可吸收性和生物相容性，是一种新型生物材料。本文采用三个方案研究玉米蛋白生物大分子有机基质为模板的生物矿化过程及其调控机理。第一个方案是通过红外光谱、xrd、扫描电镜观察与分析，研究不同的ph、滴加方式、矿化的时间等不同的条件对矿化产物的影响。第二个方案是用去酰胺和磷酸化两种方法对玉米蛋白微球进行改性，然后再用改性后的玉米蛋白微球对羟基磷灰石进行矿化研究。第三个方案是利用不同的的方法制备不同大小半径的玉米蛋白微球，然后用泡模拟体液的方法，研究玉米蛋白微球的仿生矿化。关键词：玉米蛋白、微球、羟基磷灰石、生物矿化abstractbone tissue in vivo, controlled by cell growth, is a biological mineralized tissue which consists of both organic matter and inorganic matter. with the development of tissue engineering, the use of biological macromolecules as a template for biomineralization modulation, and to design biological materials for bone tissue repair has made great progress. zein, came from corn, is a prolamin protein which contains a large number of hydrophobic amino acid content. for its good absorbency and biocompatibility, zein is a new biological material. this study uses three schemes of corn protein biological macromolecules organic templates biological mineralization processes and regulation mechanism. the first one is by ir, xrd, sem observation and analysis, the research of different ph, add ways such as time and mineralization in different conditions on the influence of the mineralization products. the second option is to use two kinds of methods and amide phosphorylation of corn protein microspheres, then modified with modified corn protein microspheres were of hydroxyapatite mineralization. the third is using different methods of preparation of different size radius of corn protein microspheres, and then use the method, the fluid bubble simulation research corn protein of biomimetic mineralization.目录第一章 生物矿化31.1 生物矿化31.1.1 生物矿化材料31.1.2 生物矿化的类型41.1.3 生物矿化的过程41.1.4 生物矿化的机理51.2有机基质诱导生物矿化71.2.1 胶原蛋白71.2.2 丝素蛋白81.2.3 聚乳酸81.3玉米醇溶蛋白91.3.1玉米醇溶蛋白的组成91.3.2玉米醇溶蛋白的构型101.3.3玉米醇溶蛋白的溶解性101.4羟基磷灰石101.4.1羟基磷灰石晶体结构111.4.2生物学特性121.4.3 在生物医学领域的应用131.5 本论文的研究目的与主要内容14第二章 玉米蛋白对羟基磷灰石晶体的矿化调控152.1 引言152.2 实验部分152.2.1 材料152.2.2实验步骤162.2.3产物的表征172.3结果与讨论172.3.1工艺条件的影响172.3.2 矿化产物的ft-ir表征202.3.3 矿化产物的形貌212.4本章小结22第三章 改性玉米蛋白对羟基磷灰石晶体的矿化调控233.1 引言233.2 实验部分243.2.1 试剂与仪器243.2.2 模拟体液的制备243.3 结果与讨论253.3.1脱酰胺后的玉米蛋白对羟基磷灰石晶体矿化的影响253.3.2磷酸化后的玉米蛋白对羟基磷灰石晶体矿化的影响263.4本章小结274.1 引言284.2 实验部分294.2.1 试剂与仪器294.2.2 模拟体液的制备294.2.3 玉米蛋白微球的制备以及矿化294.3 结果与讨论314.3.1 矿化微球形貌314.3.2 ft-ir表征354.4 本章小结35第一章 生物矿化1.1 生物矿化生物矿化是指生物体内无机矿物的形成过程，包括两种形式：一种是正常矿化，如骨骼、牙齿和贝壳等的形成；另一种是异常矿化，如结石、牙石和龋齿等。生物矿化涉及生物学、化学、结晶学、材料学、矿物学和医学等多学科，引起了这些领域专家的广泛关注和高度重视。深入研究生物矿化的特征和生物矿物形成的机理，不但有助于新型材料的开发和利用，而且有助于治疗异常矿化引起的人体疾病。1.1.1 生物矿化材料生物矿化材料是指由生命系统参与合成的天然生物陶瓷和生物高分子材料，如骨骼、牙齿、珍珠、贝壳等。虽然生物矿化材料的主要无机质广泛存在于自然界中，甚至有些矿物在组成和结晶方式均于天然岩石圈中相应的矿物相同，但是这些矿物在形成过程中由于特殊的生命系统的调控，便具有了常规陶瓷材料无法比拟的优点，如极高的强度、良好的断裂韧性、优异的抗冲击性能、良好的表面光洁度、特殊的光学性能以及特有的生物学性能和许多特殊功能。这些不同寻常的性能来源于特定生物条件下，材料的巧妙组装过程及其所特有的高度复杂精细的微观结构；这便是生物矿化的魅力所在。天然骨组织便是经过这样的特殊生物矿化过程调控下组装而成的纳米羟基磷灰石胶原蛋白纤维复合材料1。至今已知的生物体内矿物有60多种，含钙矿物约占生物矿物总数的一半，其中碳酸盐是最为广泛利用的无机成分，磷酸盐次之。碳酸钙主要构成无脊椎动物的外骨骼；磷酸钙主要构成脊椎动物的内骨骼和牙齿；硅氧化物多见于植物中；泌尿系结石的主要组分为草酸钙、磷酸钙、磷酸镁铵、尿酸和胱氨酸等;铁锰氧化物和氢氧化物主要见于铁细菌，其中磁铁矿主要见于磁性细菌和软体动物的部分矿化组织中，如石鳖齿舌中含有大量的磁铁矿；硫酸盐主要分布于厌氧的光能硫细菌和硫氧化细菌中，在原真核生物中也有残余，如棘骨虫亚纲( acantharia)的天青石(srso4 )骨针。与自然界中形成的一般矿物相比，生物矿物主要特性有4点：（1） 结构上的高度有序使得生物矿物具有极高的强度和良好的断裂韧性。骨骼和牙齿具有高强度，软体动物的贝壳珍珠层具有高硬度和优异韧性，均是归因于蛋白质与无机晶体间复杂的相互作用而形成的高级自组装结构。（2）生物矿物一般具有确定的晶体取向。如鸡蛋壳中方解石以c 轴垂直于蛋壳表面；软体动物壳层中方解石常沿（001）面垂直生长，珍珠层中文石的a 轴平行于2 几丁质纤维（2 chitin fibrils），b 轴平行于2 折叠（2 pleated sheet）的类丝心蛋白多肽链。（3）矿物质与有机基质的相互作用。草酸钙尿石超微结构的原子力显微镜（afm）表明，尿石晶粒之间都填充呈条索状或细纤维状但形态不定的基质，基质不仅紧密包绕在晶粒周围，将晶粒紧密连结起来，而且基质自身互相连接、融合，构成形态不一的网状纤维。这表明在结石形成过程中，晶粒的聚集不是简单堆积，基质起着连接、黏附晶粒以及聚集融合作用。（4）矿物质在整个生物代谢过程中形成，并参与代谢过程。1.1.2 生物矿化的类型mann初步阐述了生命体中无机矿物的形态和结构、生物矿化类型和生理功能、生物矿化作用的化学控制、边界组织、有机基质控制等基本问题，并提出界面有组织矿化的观点，认为生物矿化过程存在着不同层次的控制作用2。生物矿物的形成常常是各种因素协同作用的结果，根据生物体对生物矿物调控程度的不同，生物矿化可分为生物诱导和生物控制两类。生物诱导矿化是由生物的生理活动（如新陈代谢、呼吸作用和细胞壁的建立等）引起周围环境物理化学条件改变而发生的生物矿化作用。这种矿化没有圈定的局限空间，没有专门的细胞组织或生物大分子引导，所形成的晶体任意取向，缺乏独特形态. 一般认为，生物诱导矿物生长是环境中的离子不断沉积到矿物表面的结果，但banfield 等3提出了一种新的生长方式，即生物矿物的生长可通过纳米微粒的取向黏附来完成，并对两种铁氧化细菌（嘉利翁氏菌属和纤发菌属）及其诱导下形成的生物矿物羟基氧化铁（feooh）进行了研究，发现feooh 由直径为2-3 nm 的水铁矿纳米微粒组成，在一定的面积内，各微粒的晶轴平行。生物控制矿化是由生物的生理活动引起，并在空间、构造和化学三方面受生物控制的矿化过程. 它发生在圈定的局限空间（如脂质泡囊）内，形成的生物矿物有机物质含量高，结晶习性独特，大小均匀，形状一致，排列规则。chan 等4报道：嘉利翁氏菌属和纤发菌属细菌细胞表面突出的细丝状聚合物可作为空间定位的膜板，诱导四方纤铁矿（ 2feooh）围绕其沉积，形成长几微米，直径20-200 nm 的矿化细丝。x 射线光电子散射光谱（x2peem） 和x 射线吸收近边结构谱（xanes）结果表明，这种细丝状聚合物主要的有机成分海藻胶质（alginate）是一种酸性多糖. 因此推测，它是海藻胶质调控 2feooh 的形成。1.1.3 生物矿化的过程生物体内的矿化过程一般分为4个阶段5：(1) 有机大分子预组装构造有序的反应环境。在矿物沉积前构造一个有组织的反应环境，该环境决定了无机物成核的位置。有机基质的预组织是生物矿化的膜板前提，预组织原则是指有机基质与无机相在分子识别之前将识别无机物的环境组织得愈好，则它们的识别效果愈佳，形成的无机相愈稳定。该阶段是生物矿化进行的前提。(2) 有机无机界面的分子识别，控制晶体的成核、生长。mann 根据酶与底物作用的特点最早提出分子识别的概念及著名的锁与钥匙原理。分子识别可理解为底物与受体选择性结合，并具有专一性功能的过程，互补性和预组织是决定分子识别过程的两个关键性因素。分子识别过程可引起体系电学、光学性质及构象的变化，也可引起化学性质的变化，这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理.在已形成的有机基质组装体（底物）的控制下，无机物（受体） 从溶液中在有机无机界面成核。其中的分子识别表现为有机基质分子在界面处通过晶格几何特征、静电电势相互作用、极性、立体化学互补、氢键相互作用、空间对称性和形貌等方面影响和控制无机物成核的部位、结晶物质的选择、晶形、取向及形貌等。(3) 生长调制，使晶体初步组装形成亚单元。无机相通过晶体生长进行组装得到亚单元，同时形状、大小、取向和结构受有机基质分子组装体的控制；由于实际生物体内矿化中有机基质是处于动态的，所以在时间和空间上也受有机基质分子组装体的调节。在许多生物体系中，分子构造的第三个阶段即通过化学矢量调节赋予了生物矿化物质具有独特的结构和形态的基础。(4) 细胞加工，亚单元矿物组装形成多级结构的生物矿物。在细胞参与下亚单元组装成更高级的结构。该阶段是造成天然生物矿化材料与人工材料差别的主要原因，而且是复杂超精细结构在细胞活动中进行最后的修饰的阶段。1.1.4 生物矿化的机理生物矿化过程的一个显著特征是这个过程受控于有机大分子基体6。生物矿化研究20 年来一个重要的进展就是认识到有机膜板对无机晶体的调制作用。有机基质对无机晶体的成核、生长、晶形及取向等的控制是一个相当复杂的过程，目前一般将这种过程称为分子识别。（1）静电相互作用和电荷在界面的富集lochhead等7认为带负电的有机基质易于诱导无机相的异相成核而抑制无机相的均相成核，从而有利于晶体成核生长。他们对这种有机-无机界面的相互作用进行了理论计算，发现在带负电荷的有机单层膜界面处，阳离子的浓度一般比溶液体相中的要高，且与体相中的阳离子浓度无关，但界面处的阴离子的浓度比体相中的要低，从而使界面处的阴、阳离子之比偏离晶体的化学计量比，而这种偏离有利于晶体成核生长。带负电荷的有机基质鳌合带正电的阳离子，诱导出局部的晶体阴离子浓度增大，从而进一步吸引更多的阳离子，直到有机无机-界面阳离子浓度有利于晶体的异相成核。在生物矿化中有机基质中亲水头起着微粒的作用，先吸引阳离子，后诱导晶体的晶核的形成。lin等8研究了纤铁矿和磁铁矿在lb 膜（将兼具亲水头和疏水尾的两亲性分子分散在水面上，经逐渐压缩其水面上的占有面积，使其排列成单分子层，再将其转移沉积到固体基底上所得到的一种膜）下的生长，他指出以带负电十八醇（stearyl alcohol）单层膜作膜板可以诱导纤铁矿的定向和外延生长，而带正电的十八胺为膜板和无膜时的现象一样，即界面没有成核，原因是界面层中不存在适合晶体生长的静电相互作用。（2）晶体面网的几何匹配根据晶体成核热力学理论和公式可知：降低表面能垒或增加溶液饱和度都可以促进成核；如果晶粒-基物表面之间相互作用所表示的净界面能比晶粒-溶液的界面能低，那么异相成核优先发生。在膜的诱导下晶体的生长机理发生改变，一方面，膜的存在使溶液表面成核物种浓度增大，膜与成核物种之间的分子识别导致膜亲水基团和成核物种之间的精确匹配。有机基质膜板的周期结构与晶体某一方向面网的周期晶格常数相适应时，降低了无机相异相成核的活化能，会诱导晶体沿该方向面网生长，从而使该面网的晶轴垂直膜板。一般认为，当有机基质通过分子识别选择性地与晶体某一方向面网相互匹配时，会阻塞其他生长位置，使晶体在垂直该面网方向的生长速度相对其他方向面网会大大减少或停止生长，从而使该面网相对稳定并体现在最终形态中。（3）空间立体化学结构互补所谓立体化学互补，要求有机-无机界面处的有机头基和晶体中的无机离子在配位体机构上即空间结构上达到互补，从而达到相互识别的效果。立体化学互补在有两个晶面竞争生长时，其作用更为突出。欧阳健明等研究了dppc（dipalmitoylphosphatidylcholine，即二棕榈磷脂酰胆碱）单分子膜下草酸钙的取向生长，证实二者之间存在立体化学匹配时，草酸钙才会受控生长。总的来说，有机质对无机晶体结晶的控制作用常常是各种因素协同作用的结果9。另外局域化学控制也起一定的作用。在这几种作用中，静电相互作用必不可少，它对于界面电荷富集和双电荷层的形成起着关键的作用，同时晶格匹配和立体化学机构互补具有空间定位和空间约束的作用，控制成核过程和晶体生长等的立体化学专一的特征，因而使晶体的大小、形貌、结构都得到控制和调节。此外，分子识别时的协同作用还包括有机基质各功能基团的协同作用，识别时有机基质结构的改变，以及有机基质各功能基团之间的相互作用等，这几方面已经成为生物矿化研究的前沿。一般认为有机基质诱导生物矿化的驱动力是由有机-无机界面间的静电力、几何、结构和立体化学二元互补性决定。有机基质表面的作用主要是降低成核活化能，成核活化能的降低反映了有机-无机界面结构和立体化学互补性要求，而且从能量的角度上说明有机基质诱导下的晶体的生长符合能量最低原理，即在这样的环境条件下，特定晶形的出现是能量最低化的一种表现形式。这一点可以从经典的晶体成核理论得到很好的解释，更进一步说明了生物体对外界的协同性和适应性。1.2有机基质诱导生物矿化生物矿化过程的一个显著特征是这个过程受控于有机大分子基质。有机基质可以定义为任何由有机成分组成的局域化表面，如蛋白质、磷脂、胶原质和碳水化合物等。天然复合材料中的有机质不仅有其结构上的框架作用，更重要的是控制着无机矿物的形核、生长以及矿物结构的堆积方式。确定生物体中各种蛋白，特别是某些重要的微量基质蛋白对矿化的控制作用是当前生物矿化机理研究的一个重要问题。生物体内的矿化过程十分复杂，至今远未充分认识生物矿物的形成机理以及基质、细胞等对生物矿物的调控作用。在接近生物体内环境的条件下，研究生物大分子专一的调控作用以及协同调控作用，进一步研究基质中的生物矿化过程，能为开发仿生材料和治疗异常矿化引起的疾病提供启示。近年来骨组织工程的研究工作主要集中在种子细胞、 支架材料、 成骨因子和骨的构建几个方面。随着骨组织工程支架材料的研究逐渐深入，羟基磷灰石作为一种生物陶瓷类材料, 以其优良的生物学性能受到研究者的广泛关注，尤其是羟基磷灰石与胶原、聚乳酸、壳聚糖和丝素蛋白等的复合材料的研究，取得了较大进展。1.2.1 胶原蛋白胶原蛋白是皮肤、骨、腱、软骨、血管和牙齿的主要纤维成分，细胞骨架的重要成分也是胶原，因此，胶原不同程度地存在于一切器官中。胶原重要的生物学功能有：构成细胞外基质的骨架结构，与细胞相互作用并影响细胞的形态、骨架组装及增殖与分化；与细胞周围的基质有良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分；可生物降解性及能促进细胞生长代谢。胶原可与其它材料相复合的特点，使之成为组织工程中的一种重要材料。研究表明, 胶原对溶液中ca2+有良好的亲和性，在 ha结晶过程中起晶核和矿化模板作用，具有诱导 ha成核，引起 ha颗粒沿胶原纤维表面分布的功能。du10、冯庆玲11、 廖素三12等将纳米羟基磷灰石/胶原材料经x射线衍射、扫描电镜、透射电镜观察分析，发现纳米羟基磷灰石与型胶原分子的自组装结构与天然骨的微结构类似，其显微硬度可以达到骨皮质显微硬度的下限。姚晖等13动物实验结果表明纳米羟基磷灰石/胶原材料具有良好的生物相容性，成骨细胞可在框架材料上正常地贴附铺展、生长繁殖，并分泌纤维状细胞外基质与材料成为一体。将骨修复材料植入体内后对局部和全身无毒副作用，局部无明显的淋巴细胞、异物巨细胞聚集，无明显的炎症反应和组织坏死。1.2.2 丝素蛋白丝素蛋白（silk fibroin，简称 sf）是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70%80%，富含18种氨基酸，其中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，约占蛋白总量的85%。近年来丝素蛋白在生物医用材料方面的研究和应用得到了广泛的关注，如用做手术缝合线、药物缓释载体、固定化酶载体、隐形眼镜、人工血管、人工肌腱和韧带、创面覆盖物、硬脑膜修复材料、细胞培养基质等。研究发现，丝素蛋白有很多优异的性质，使其具有应用于临床修复和组织工程支架材料的潜力，如：良好的生物相容性和力学性能；良好的生物降解性；对多种细胞具有相容性，能够支持细胞的粘附、增殖和分化；优越的血液相容性，对血凝过程没有显著影响；体内引起的异物反应小，不会引起显著的炎症反应等。丝素蛋白含有较多的羟基和羧基，能与钙离子紧密结合，诱导羟基磷灰石在丝蛋白上矿化结晶，形成自组装纳米复合物材料。卢神州等14用氢氧化钙与磷酸共沉淀合成羟基磷灰石，加入丝素蛋白诱导羟基磷灰石晶体的定向生长，以仿生的方法得到复合颗粒。研究结果表明，丝素蛋白能够诱导羟基磷灰石形成针状晶体，晶体的长轴沿c轴方向。一定温度范围内，复合材料的结晶度随合成温度的升高而增加。wang, l. 15通过控制丝素粉末添加量合成ha-sf复合物，结果表明丝素蛋白作为模板为羟基磷灰石晶体的成核和晶体生长提供了活性位点，丝素粉末添加量的改变会引起羟基磷灰石晶体形貌的改变。kong, x.d 16通过向cacl2与sf的混合溶液中滴加 na2hpo4的方法合成ha-sf复合物，每隔2-3h收集沉淀物，通过 x射线衍射仪分析磷酸钙的矿化过程。研究结果表明，sf能够促进溶液中的 cahpo4向ha的转化过程，促进 ha的生长。wang, l17采用碱液和酶对丝素蛋白进行预处理，用共沉淀的方法合成ha-sf复合物。结果表明经酶预处理的丝素将ha晶体形貌从710 nm宽的杆状转变为46 nm宽的须状，ha晶体表现为更加明显的沿c轴的自组装择优取向。1.2.3 聚乳酸聚乳酸（polylactic acid，pla）是一种具有良好生物相容性和生物降解特性的聚合物，具有较好的机械强度、弹性模量和热成型性，在骨组织和软骨组织的再生与修复等骨组织工程中基本能满足作为细胞生长载体材料的要求。通过调节分子量、结构和组成等手段可以改善pla的力学性能和降解速度，以满足不同的临床要求。pla的最终降解产物是co2和h2o，中间产物乳酸是体内正常代谢物，因此，pla在生物体内降解后不会对生物体产生大的不良影响。pla材料的不足之处在于其机械强度较差，不具有骨传导性，在临床单独使用时，修复骨缺损的速度很慢，尤其是对于较大的骨缺损，难以达到完全修复，所以pla材料单独应用不是理想的骨修复替代材料。通过研制多孔ha/pla复合材料，一方面可提高材料的韧性，满足骨植入替代材料机械强度的要求，另一方面，聚乳酸的酸性降解产物可被ha缓冲，同时ha的骨诱导性可提供良好的骨细胞生长环境，多孔结构则为细胞生长、组织再生及血管化提供条件，从而更加符合骨组织工程材料的生物学要求。deng18等合成了nha/聚乳酸复合材料，对材料的力学性能测试结果表明，在一定范围内，随着ha含量的增加，复合材料的拉伸强度得到提高，推测这是由于nha作为短小纤维填充入有机质起到了提高聚合物强度的作用。ha/pla复合材料具有很好的生物相容性和骨传导性，而且ha与pla复合后，ha既可以均匀增强材料强度，又可减慢 pla的降解速度。但是，这类复合材料由于作为填充体的ha粉体与pla两者的界面结合力较弱，在应用时其复合界面处首先遭到破坏，从而导致材料机械强度丧失过快。因此，提高ha与pla之间的界面相容性和分散性成为制备性能优异的 ha/pla骨组织工程材料的关键技术。1.3玉米醇溶蛋白玉米醇溶蛋白（zein）是玉米中的主要蛋白质。由于不溶于水且缺乏赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸，并存在色泽和气味问题，其作为食品原料的应用较少。但玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、凝胶化性和抗氧化性等性能。在开发了高度脱色、脱臭技术后，大大拓宽了其应用范围，使之成为一种用途广泛的工业原料。1.3.1玉米醇溶蛋白的组成玉米中约含干物重10%的蛋白质，其中5060%为醇溶蛋白。据mckinney分类，玉米醇溶蛋白分为两类：-zein和-zein。-zein可溶于95%乙醇，-zein可溶于60%而不溶于95%乙醇。-zein的组氨酸（his）、精氨酸（arg）、脯氨酸（pro）和蛋氨酸（met）含量少于-zein，-zein相对不稳定，易沉淀和凝固。成品zein中富含谷氨酰胺（21%26%）、亮氨酸（约20%）、脯氨酸（约10%）和丙氨酸（约10%），但是缺少酸性氨基酸和碱性氨基酸。表1是玉米醇溶蛋白的氨基酸组成。表1-1 玉米醇溶蛋白氨基酸组成（g氨基酸/100g玉米蛋白）1.3.2玉米醇溶蛋白的构型玉米醇溶蛋白的性质不仅与其分子的氨基酸组成有关，还与其分子本身的形状和结构密切相关，其分子形状和结构对其性质有较大影响。通过实验推算，玉米醇溶蛋白分子长轴比为25:1或10:1，其分子是棒状的。玉米醇溶蛋白在溶液中显示出较强的旋光性，说明其含有较多量的。-螺旋体，-螺旋体是由肽主链上的羟基与亚氨基的氢键作用而形成。1.3.3玉米醇溶蛋白的溶解性玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸组成，其分子中不仅存在着大量的疏水性氨基酸，而且还缺乏能带电的酸性、碱性和极性基团的氨基酸，同时还含有较多的含硫氨基酸，因此玉米醇溶蛋白具有独特的溶解性，它不溶于水，也不溶于无水醇类，但可溶于6065%的醇类水溶液中，它还可溶于强碱（ph11）、十二烷基硫酸钠（sds）高浓度尿素及丙二醇和醋酸等有机溶剂19。1.4羟基磷灰石天然骨是由无机矿物与生物大分子规则排列所组成的复合体；成熟的骨除了细胞之外，其基质中有大量规则排列的有机质胶原纤维束和无机盐羟基磷灰石。有机质构成骨支架，赋予骨弹及韧性；无机质则使骨硬挺峰实。天然生物矿化过程赋予骨组织高度有序的纳米羟基磷灰石与胶原纤维矩阵分子级别的独特组装，从而使天然骨具有优异的机械性能，如低刚度、对拉伸压缩的高抵抗、特定的柔性、高断裂韧性等。随着对生物矿化过程的了解不断深入，利用模拟生物矿化的方法制备在结构和功能上与天然骨组织相似的生物材料用于骨损伤的治疗和修复成为最具潜力的研究方向。然而，天然大分子蛋白在生物矿化过程中的分子调控机制至今尚不明确，对于自然界的生物矿化过程，仍然需要进一步研究；弄清生物矿化过程中蛋白质调控无机质晶体生长的规律和机制对生物材料的仿生制备具有重要的指导意义。羟基磷灰石(hydroxyapatite，简称ha)是动物和人体骨骼的主要无机矿物成分， 分子式为ca10(p04)6(0h)2，简称为ha或hap，密度为3.16 g/cm3，性脆，折射率是1.641.65，微溶于纯水，呈弱碱性(ph=7-9)，易溶于酸而难溶于碱20。在正磷酸盐家族中，ha的溶解度是最小的，且具有负溶解度性质，即ha的溶解度随温度的升高而降低。由于羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性及其与人体骨矿物相组分的相似性，在许多骨替代物中脱颖而出，被广泛用于生物医用材料领域，如硬组织修复材料21。目前有关羟基磷灰石的研究已经取得了很大的进展，人工合成ha的方法有多种，如：液相沉淀法22、水热合成法23、溶胶一凝胶法24、微乳液法25、固相反应法26、自然烧法27等。由于单一组分的羟基磷灰石烧结性能差，作为种植材料其度较低、韧性较差、力学性能不足，致使其难以承受负荷或冲击，这就限制了其作为人体材料种植体的使用。yoshimura等人研究表明晶须状羟基磷灰石有望成为增韧增强的材料。1.4.1羟基磷灰石晶体结构 图1-1沿c轴投影到（001）面上ha结构图羟基磷灰石是磷酸钙盐家族的典型代表，其晶体属六方晶系，属l6pc对称型和p63m空间群，其结构为六方柱体，与c轴垂直的面是一个六边形，a、b轴夹角为120，晶格常数为晶胞常数为a=b=9.43 a，c-688 a，cap原子比为1.67，单位晶胞含10个ca2+，6个po3-4和2个oh-，晶体中原子基团排列沿c轴的投影如图1.1所示。从图中可看到oh-位于晶胞的4个角上，10个ca2+分别占据2种位置；4个ca2+占据ca(1)位置，即z=0和z=l2位置各2个；6个ca2+位于ca(2)位置，即z=l4和z=34位置各3个；6个po43-。四面体分别位于z=l4和z=34的位置。ha是强离子交换剂，分子中的ca2+易被cd2+、hg2+等有害金属离子和sr2+、ba2+、pb2+等重金属离子置换，还可以与含羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应。ha通道结构如图1.2所示。附加阴离子x填充于通道中，且位于结构通道中的63轴与ca(2)三角形面(m面)中心交汇处，x位置可被ci-、oh-、br-、i-、co32+、o2-等阴离子替换形成复杂的固溶体28。所以存在于自然界中的羟基磷灰石晶体结构不完善，结合有少量的碳酸根、氟、镁、钠及柠檬酸等离子。图1-2 ha通道结构示意图1.4.2生物学特性ha是典型的生物活性陶瓷，它与骨形成键合表现在：光学显微镜下，新骨和羟基磷灰石植入体在界面上直接接触，其间无纤维组织存在；羟基磷灰石植入体与骨界面的结合强度等于甚至超过植入体或骨自身的结合强度，如果发生断裂则往往是发生在陶瓷或骨的内部而不是在界面上；羟基磷灰石植入体与骨界面的高分辨透射电镜显示新生骨中盐晶体系由植入体中晶体外延生长形成29。羟基磷灰石具有良好的生物特性，已作为天然骨的替代物广泛应用于医疗领域。hulbert30的研究表明，多孔陶瓷材料的孔径在15-40 m时，纤维组织可以长入陶瓷的内部；孔径为45-100 m时，允许非矿物的骨样长入；孔径在150 m时，已能为骨组织长入提供理想的场所。另有研究表明31多孔ha植入体内后，能为纤维细胞和骨组织向羟基磷灰石生长提供通道和生长空间，增大组织与羟基磷灰石接触表面积，使界面的软硬组织都能长入孔隙内，形成纤维组织和新骨组织交叉结合的状态，这种界面结构能保持正常的代谢关系，骨一材料的界面结构具有生理性结合。1990年yamsaki报道了植入狗皮下的多孔羟基磷灰石陶瓷中有骨形成。1991年，张兴栋等和ripamonti分别报nt植入狗和狒狒非骨部位的多孔羟基磷灰石中有新骨生成。将大孔羟基磷灰石陶瓷植入狒狒的腹直肌中，在没有外源性骨形成蛋白存在时，植入30 d后在羟基磷灰石孔壁就发现了骨形成蛋白(bmp3，0p-1bmp7)，植人90 d后，41的样品中伴有骨髓的新骨组织，这表示了大孔羟基磷灰石的骨诱导性能。对于羟基磷灰石的生物活性机理，gross、ducheyne、jarcho等曾做过讨论，认为ha植入机体与邻近骨和体液作用，发生钙、磷等离子交换这种交换维持动态平衡，在ha与骨界面产生新的ha。ha中弥散出钙、磷离子，在体液中的钙和磷离子也向ha表面聚集，在ha表面形成钙、磷离子层并与骨细胞中的蛋白质分子结合，这样ha与骨就紧密地集合为一个整体。随着离子交换的不断进行，影响细胞的增殖分化，引起ha表面的骨生长32。另外，研究表明33多孔ha具有生物降解性，在人体环境下，多孔ha会发生物理化学溶解，或在晶界等活性较高的区域发生化学变化而分解成较小的颗粒，此外，一些生理因素的影响都会使多孔ha发生降解。另外，材料的多孔结构使接触面积增大，加速了降解过程。材料结晶度的下降、晶粒尺寸的减小及杂质离子的存在都可以加速多孔ha的降解速度。1.4.3 在生物医学领域的应用纳米羟基磷灰石由于具备纳米材料表面能高的特性，不仅可以制备高强度和高硬度的生物陶瓷制品，还可以作为药物载体制备出杀伤力更强的靶向药物。同时，纳米羟基磷灰石粒子对于一些肿瘤细胞的生长具有遏制作用，对正常细胞基本没有负面作用。因此，纳米羟基磷灰石应用范围越来越广。一、羟基磷灰石在抗肿瘤方面的应用 hap纳米粒子既可作为药物载体，与化疗药联合抗肿瘤；也可发挥其直接抗肿瘤作用，在对肿瘤治疗中有广阔的应用前景。利用hap纳米粒子作为药物载体和基因转移载体的特性，制成hap纳米药物微粒复合物，将药物、dna等基因治疗分子吸附在其表面，同时也可在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄粒作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗27。研究表明，hap纳米粒子在体外对胃癌、肝癌等19种肿瘤细胞都具有明显的抑制作用。二、羟基磷灰石在造骨方面的应用hap化学组成和结晶结构类似于人体骨骼中的磷灰石，钙磷摩尔比为1.67，与天然骨接近。hap分子中的钙离子可与含有羧基的氨基酸、有机酸等发生交换反应，具有良好的骨传导性能和生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合促进骨骼生长，并且相态比较稳定，无毒性、是公认的性能良好的骨修复替代材料。但hap也有其自身的一些缺点，如压缩强度较低，抗疲劳性差，生物可吸收性差，替代速度慢，植入体内后可能出现疏松、迁移、破坏等34。根据“纳米效应”理论，单位质量的纳米级粒子的表面积明显大于微米级粒子，使得处于粒子表面的原子数目明显增加，提高了粒子的活性。因此，纳米hap粒子较微米级hap更利于与骨组织的整合，骨传导性能、溶解性能和力学性能较微米级hap也有所提高，并且纳米hap颗粒表面光滑平整，植入体内时对有机生命体没有物理损伤35。三、羟基磷灰石作为药物载体的应用纳米药物载体是以纳米颗粒作为药物和基因的载体，将药物、dna和rna等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄粒作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。羟基磷灰石作为药物载体系统能提高药物在生物膜中的透过性，有利于药物透皮吸收并发挥在细胞内的药效36。ijntema k37等采用共沉淀法将蛋白类药物bsa包裹于纳米hap晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系。体外缓释实验结果表明，药物的释放速率由hap的溶解过程控制。1.5 本论文的研究目的与主要内容几乎所有优异的天然生物矿化材料都采取了以基质蛋白为主的有机分子调控无机相生长的策略。其中，有机基质通常应具备分割细胞外空间和提供机械支撑的构架以及能与周围过饱和溶液中离子发生相互作用的矿化形核表面，并有效控制无机矿物的成核、生长和矿物结构的堆积方式。本论文对玉米蛋白、玉米蛋白微球调控羟基磷灰石纳米晶体的矿化过程进行研究。首先，模拟体内微环境进行沉积实验，研究体系ph值、矿化时间、玉米蛋白生物大分子对羟基磷灰石晶体生长情况的影响，晶体组成、结构和形状的变化。其次，研究经酸法脱酰胺以及磷酸化的玉米蛋白基质对羟基磷灰石晶体形成、形貌的影响。另外，制备玉米蛋白微球，经体外沉积制得玉米蛋白/羟基磷灰石复合材料，研究微球结构（直径）、矿化条件等对羟基磷灰石晶体生长情况的影响，以及晶体组成、结构和形状的变化。 第二章 玉米蛋白对羟基磷灰石晶体的矿化调控2.1 引言骨组织工程是应用工程学和生命科学原理，以支架材料为载体，结合有成骨潜力的种子细胞、生长因子，通过体内或体外继续培养，构建有生命活力的仿生骨。骨组织工程支架是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，它是构建组织工程的最基本构架，在组织工程学中支架材料是研究的重点。现在所使用的骨组织工程支架主要包括人工合成高分子 例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚羟丁酯等和天然高分子，例如胶原、壳聚糖等。作为一种天然高分子新材料，玉米醇溶蛋白（zein）是从玉米粉或玉米渣中提取出来的，具有很好的生物相溶性、可降解性、疏水性和抗氧化活性的植物蛋白。zein的氨基酸平衡性较差，非极性的氨基酸含量较多，碱性和酸性的氨基酸含量较少，同时还含有较多的含硫氨基酸。其中谷氨酸（21 %26 %）、亮氨酸（20%）、脯氨酸（10 %）和丙氨酸（10 %）的含量较多，赖氨酸和色氨酸等人体必需氨基酸的含量较少。由于zein的生物相溶性和可降解性，它在生物医学领域有着广泛的应用前景。在细胞培养方面，dong18等的研究表明微球体直径在100500nm和5002500nm的两种zein膜用来培养人体肝脏细胞（hl-7702）和鼠类的纤维原细胞（nh3t3）具有良好的效果。在较低的浓度下，直径小的zein膜对两种细胞的增殖更加有利。 直径在纳米到微米之间， 承载有肝素的微球体zein膜在培养人脐静脉内皮细胞时， 无论膜本身还是其降解产物都表现出很好的生物相容性19。用盐析法制作的zein 多孔支架，鼠类的间叶干细胞能很好的粘附、生长和繁殖20， 进一步研究表明这种zein多孔支架具有很好的组织相容性，降解能力，且无毒性，是一种很好的组织工程材料。几乎所有优异的天然生物矿化材料都采取了以基质蛋白为主的有机分子调控无机相生长的策略。其中，有机基质通常应具备分割细胞外空间和提供机械支撑的构架以及能与周围过饱和溶液中离子发生相互作用的矿化形核表面，并有效控制无机矿物的成核、生长和矿物结构的堆积方式。国内外许多研究组都通过胶原的体外模拟矿化，构建与体内天然骨近似的矿化胶原纤维，用于各类骨缺损修复。本章对玉米蛋白调控羟基磷灰石纳米晶体的矿化进行研究。通过红外光谱、xrd、扫描电镜观察与分析，研究不同的ph、滴加方式、矿化的时间等不同的条件对矿化产物的影响。2.2 实验部分2.2.1 材料试剂：名称 生产厂商 规格 无水cacl2 国药集团有限公司 ar (nh4)2hpo4 南京化学试剂有限公司 ar koh 国药集团有限公司 ar 玉米蛋白 sigma z3625 无水乙醇 南京化学试剂有限公司 ar 去离子水 仪器： 750型傅立叶红外光谱仪（nicolet，美国）mirero-ais 2100型扫描电子显微镜（韩国）x射线衍射仪（rigaku d-max 2500，日本理学仪器株式会社）2.2.2实验步骤基本方案a，分别称取5.55gcacl2和3.96g（nh4）2hpo4分别溶解在100ml的容量瓶里面，分别配制成摩尔浓度为0.5m cacl2水溶液和0.3m（nh4）2hpo4水溶液。b，在室温下，将等体积的0.3m（nh4）2hpo4水溶液以40ml/h的速率滴加入0.3mcacl2溶液，同时磁力搅拌。c，完毕后磁力搅拌1h。d，抽滤提纯产物，置于90烘箱24h烘干，得到粉末装样，送检。总方程式为：10cacl2+6(nh4)2hpo4 +8naoh=ca10(po4)6(oh)2 +12nh4cl+8nacl+3h2o工艺条件的研究（1）溶液的ph 控制其他反应条件完全一致，仅溶液的ph不同，做四组平行实验。实验步骤如下： a，按基本方案步骤a所配好的cacl2溶液、（nh4）2hpo4溶液，然后分成四组等体积的溶液。第一组把cacl2溶液的ph调成4；第二组把（nh4）2hpo4溶液的ph调成8；第三组把（nh4）2hpo4溶液的ph调成10；第四组把（nh4）2hpo4溶液的ph调成8。 第一、二、三组按基本方案的b、c、d步骤完成实验；第四组在完成步骤b后，把溶液的ph调为10，然后按基本方案c、d步骤完成实验。（2）zein溶液 控制其他反应条件几乎一致，仅在0.3mcacl2溶液加入玉米蛋白，并且溶液的ph不同，矿化时间不同做四组平行实验。 a，按基本方案步骤a所配好的cacl2溶液、（nh4）2hpo4溶液，然后分成三组等体积的溶液，然后在加入在0.3mcacl2溶液加入玉米蛋白，使玉米蛋白质量体积浓度为5% 。第一组把cacl2溶液的ph调成4；第二组把（nh4）2hpo4溶液的ph调成8；第三组把（nh4）2hpo4溶液的ph调成8。 第一、二组按基本方案的b、c、d步骤完成实验；第三组在完成步骤b后，把溶液的ph调为10，然后按基本方案c、d步骤完成实验。第四组是保留第三组实验的溶液沉淀一份30d后抽滤、烘干、最后表征。 2.2.3产物的表征以thermo arl xtra x射线衍射仪（美国热电公司）对制备的粉末样品进行广角x射线衍射（waxd）研究（40 kv，20 ma，扫描速率5 /min，2角范围5-70）。将粉末样品和kbr研磨压片，以750傅立叶红外光谱仪(nicolet, 美国)在4000-400cm-1范围内扫描红外谱图。粉末样品经喷金处理后通过mirero ais2100型扫描电子显微镜（韩