头孢噻肟和舒巴坦复方制剂体内外抗菌活性研究.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减头孢噻肟和舒巴坦复方制剂体内外抗菌活性研究（作者:_单位: _邮编: _） 作者：杨文吉 邵振俊 曾云 罗刚 周黎明【摘要】 目的 评价头孢噻肟钠/舒巴坦钠(CTX/SB，11，21，41，81，161)及单组分头孢噻肟钠(CTX)对13株产内酰胺酶革兰阴性菌体外抗菌作用，并与复方制剂头孢哌酮钠/舒巴坦钠(CPZ/SB 11)和哌拉西林钠/三唑巴坦钠(PIPC/TB 81)进行比较，以及对产酶大肠埃希菌与铜绿假单胞菌感染小鼠体内保护作用。方法 采用琼脂二倍稀释法测定CTX/SB(11，21，41，81，161)复方制剂对产内酰胺酶革兰阴性菌体外抗菌作用及对产酶大肠埃希菌与铜绿假单胞菌感染小鼠体内保护作用；生物法测定内酰胺酶对抗生素的相对水解率以及抑酶保护率，PCR扩增并检测了其耐药酶的类型。结果 CTX/SB(11)的MICs较CTX有不同程度的下降；各不同配比CTX/SB的相对水解率均显著低于CTX单用(P0.01)，CTX/SB (11)的相对水解率也显著低于PIPC/TB(81)和CPZ/SB(11)(P0.01)；CTX/SB(11)的抑酶保护率显著低于CTX/SB(81，161)(P0.01)，也低于CTX/SB(21，41)，但无统计学意义。体内试验，CTX/SB(11)的ED50值较CTX有明显下降。结论 体内、外试验表明CTX/SB(11)抑酶效应优于其它配比，也优于同类复方制剂CPZ/SB(11)及PIPC/TB(81)；因此，舒巴坦起到了增强头孢噻肟对内酰胺酶的稳定性和抑酶保护作用。 【关键词】 头孢噻肟； 舒巴坦； 最低抑菌浓度； 生物法； 半数有效量 ABSTRACT Objective To evaluate the in vitro synergistic activity of cefotaxime/sulbactam (CTX/SB, 11, 21, 41, 81, 161) against 13 stains producing lactamases, and compare with cefotaxime, cefoperazone/sulbactam (CPZ/SB, 11) and piperacillin/tazobactam (PIPC/TB, 81); as well as compare the in vivo antibacterial activity between cefotaxime and CTX/SB (11). Methods The minimal inhibitory concentrations were detected by the agar dilution method. The hydrolysis rate and the ability of enzyme inhibitor in protecting cefotaxime from hydrolyzing by lactamases were measured by biological method. The in vivo antibacterial activities of CTX/SB (11) and cefotaxime were detected on mice in experimental infection caused by P.aeruginosa 39 and E.coli 8. Results The relative rate of hydrolysis of each combination of CTX/SB was significantly lower than that of CTX alone (P0.01). The relative rate of hydrolysis of CTX/SB (11) was also remarkably lower than CPZ/SB and PIPC/TB (P0.01). The inhibition rate of lactamases of CTX/SB (11) was lower than that of CTX/SB (81, 161) (P0.05); the ED50 value of CTX/SB (11) was also lower than that of cefotaxime. Conclusion In respect to the inhibition of lactamases, CTX/SB (11) was better than other combination of CTX/SB, and also CPZ/SB and PIPC/TB, therefore, the hydrolysis activity of lactamases was greatly improved by the combination of compounds cefotaxime and sulbactam. KEY WORDS Cefotaxime; Sulbactam; Minimal inhibitory concentration (MIC); Biological method; ED50 头孢噻肟(cefotaxime)属第三代头孢类抗生素，抗菌谱广，作用强，能有效控制铜绿假单胞菌感染，在胆汁中浓度较高，由于临床应用广泛，目前其对大多数超广谱内酰胺酶稳定性差，使疗效下降。舒巴坦(sulbactam)为半合成内酰胺酶抑制剂，其化学稳定性优于克拉维酸，抗菌谱广，活性低，毒性低，对各种内酰胺酶的抑制作用有差别，与内酰胺类抗生素合用有明显抗菌协同作用1。本文研究头孢噻肟加入不同比例的舒巴坦，其拮抗内酰胺酶对头孢噻肟水解作用的强弱，抑酶增效作用，并与其它复方制剂头孢哌酮钠/舒巴坦钠和哌拉西林钠/三唑巴坦钠进行比较；同时也做了部分药物的体内保护试验。 1 材料与方法 1.1 菌株 本实验选用标准内酰胺酶产酶菌3株，由本院药理教研室保存。四川省肿瘤医院临床分离的大肠埃希菌4株，铜绿假单胞菌6株。 1.2 药物 注射用头孢噻肟钠(cefotaxime，CTX)，每瓶1.0g，批号20060401，含量94.0%；注射用舒巴坦钠(sulbactam，SB)，每瓶0.25g，批号20050302，含量89.58%；注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠(cefoperazone/sulbactam，CPZ/SB)，每瓶2.0g，批号20060501，含量为头孢哌酮钠45.90%、舒巴坦钠47.30%；注射用哌拉西林钠/三唑巴坦钠(piperacillin/tazobactam，PIPC/TB，81)，每瓶2.25g，批号20050606，含量为哌拉西林钠79.43%、三唑巴坦钠9.96%，以上药物均由成都奥科生物技术有限公司提供。注射用头孢哌酮钠(CPZ)批号60705701，珠海联邦制药股分有限公司中山分公司生产；注射用哌拉西林钠(PIPC)批号6068853BI，齐鲁制药有限公司提供生产。 1.3 测酶方法及MIC判定标准2 首先用nitrocefin初筛试验菌是否产内酰胺酶(由浅黄色变为粉红色即为内酰胺酶阳性)，按CLSI(原NCCLS，2004)判断标准，以头孢噻肟MIC8mg/L为敏感，MIC64mg/L为耐药。ESBLs菌株按CLSI(2004)表型确证法进行鉴定。 1.4 内酰胺酶提取物的制备3 采用超声波破碎法提取内酰胺酶粗提液。取粗酶提取液少量加入少许nitrocefin工作液，由浅黄色变为粉红色即为内酰胺酶阳性反应2，4，分装后于-70保存备用。 1.5 生物法测定相对水解率及抑酶保护率5，6 采用琼脂平皿测定酶水解率，指示菌为枯草杆菌芽胞悬液。培养基为抗生素培养基II号(pH6.6)。酶作用抗生素底物为头孢哌酮钠/舒巴坦钠(CPZ/SB)、哌拉西林钠/三唑巴坦钠(PIPC/TB)、头孢噻肟钠(CTX)、头孢噻肟钠/舒巴坦钠(CTX/SB 11、21、41、81、161)。将8种底物配制成终浓度为16g/ml，在3ml底物中加入20l 内酰胺酶粗提液，混匀后置37水浴15min。按随机表分别将待测样品加入平皿的不锈钢小杯中，37孵育1618h，测量抑菌圈直径，根据标准曲线计算出残余抗生素的量，由下式计算酶水解百分率： 酶水解百分率=抗生素底物量-酶水解后残余抗生素的量抗生素底物量100% 抑酶保护率(%)=无抑制剂时底物的水解率-抑制剂存在时底物的水解率无抑制剂时底物水解率100% 1.6 PCR扩增法检测酶类型 引物设计是从网址的GenBank中找到铜绿假单胞菌的TEM、SHV和CTXM型酶的原序列，利用Primer5.0软件设计引物，大连宝生物工程有限公司合成。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，纯化并测序。 1.7 体内保护试验 (1)试验药物和菌株 试验药物来源同上。试验菌株为大肠埃希菌1株，铜绿假单胞菌1株，均为产内酰胺酶菌株，来源同体外试验。 (2)试验动物 健康昆明种小鼠，体重1822g，雌、雄各半，由四川大学华西实验动物中心提供。 (3)实验方法7 将受试菌于LB肉汤中37隔夜培养，用0.5%灭菌干酵母粉进行倍比稀释，测定最小致死菌量(MLD)，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。在预试验中确定小鼠感染受试菌后出现0到100%死亡的药物剂量范围，在该范围内将受试药物设5个剂量，剂量组间距为10.7。将小鼠于试验前18h停食供水，按体重随机分组，每组12只，雌、雄各半，分别于腹腔感染试验菌液，每鼠0.5ml，感染后即刻和6h分别静脉给予受试药物(iv为0.2ml/20g小鼠)。给药后观察并记录小鼠死亡数，连续观察14d，根据小鼠死亡数，运用NDST软件计算半数有效量ED50值及其95%可信限。 1.8 统计方法 采用方差分析进行统计学分析。 2 结果 2.1 最低抑菌浓度 各抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MICs)见Tab.1。 2.2 相对水解率 内酰胺酶对CPZ/SB、PIPC/TB、CTX、CTX/SB(11、21、41、81、161)的相对水解率见Tab.2。内酰胺酶对不同配比的CTX/SB的相对水解率均显著低于CTX单用(P0.01)，同时各配比间随着SB剂量的增加，相对水解率也逐渐降低；CTX/SB(11)的相对水解率明显低于CPZ/SB(11)和PIPC/TB (81)(P0.01)，其它配比也有降低，但无统计学意义。 2.3 抑酶保护率 酶抑制剂SB对内酰胺酶水解CTX的抑酶保护作用见Tab.3。CTX/SB(11)的抑酶保护率显著高于CTX/SB(81，161)(P0.05)，也高于CTX/SB(21，41)，但无统计学意义。 2.4 PCR结果 只扩增出blaTEM等4株大肠埃希菌，无blaSHV和blaCTXM(Fig.1)。 2.4 体内保护试验 CTX/SB(11)和CTX的ED50值及95%的可信限结果见Tab.4。结果表明CTX/SB(11)对小鼠感染大肠埃希菌和铜绿假单胞菌有很好的保护作用。CTX/SB(11)对小鼠感染大肠埃希菌的ED50较CTX的ED50小(P0.05)，对小鼠感染铜绿假单胞菌的ED50较CTX的ED50有明显降低(P0.01)。 3 讨论 头孢噻肟属第三代头孢菌素类抗生素，抗菌谱广，作用强，对铜绿假单胞菌及厌氧菌有较强的作用，可用于危及生命的败血症、脑膜炎、肺炎、骨髓炎及尿路严重感染的治疗，能有效控制严重的铜绿假单胞菌感染，近年在临床上得到大量应用，致使耐药菌株日益增多。细菌主要是通过产生内酰胺酶耐药的。抗生素与酶抑制剂联合应用是一条治疗产酶耐药菌引起感染的有效途径。近年来的实验研究证实内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸、三唑巴坦和舒巴坦等)不仅对广谱酶，而且对部分超广谱酶也有抑酶作用8。 本文通过CTX、CTX/SB等抗生素体外抗菌作用、酶稳定性试验研究和体内保护试验，初步证明了内酰胺酶抑制剂SB可通过抑制内酰胺酶一定程度保护CTX不被酶水解。试验结果显示，内酰胺酶对各配比的CTX/SB的平均相对水解率已由100%降到6.1%42.7%之间，较CTX有显著降低(P0.01)；不同配比的CTX/SB对内酰胺酶的稳定性在56.1%86.2%之间，说明SB在保护CTX不被内酰胺酶水解起到了重要作用；体内保护试验也可以看出SB与CTX联用的ED50较CTX有明显的降低。本实验仅初步研究了酶抑制剂对内酰胺酶稳定性，而从MICs看，SB与CTX联合后，其MICs值不都下降明显，有些几乎没有变化，提示产内酰胺酶是细菌对头孢噻肟耐药主要机制之一，还存在其它耐药机制，如：青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的改变，菌膜通透性的改变，细菌生物膜的形成以及主动外排作用等，有待用分子生物学方法作进一步研究。【参考文献】 1 Arunoff S C, Jacobs M R, Johenning S, et al. Comparative activities of the lactamases inhibitor YTR830, sodium clavulanate, and sulbactam combined with amoxicillin or ampicillin J. Antimicrob Agents Chemother,1984,26(4):580584. 2 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 14th informati