硕士学位论文-苯二氮卓类药物有关物质的研究.pdf

中国药品生物制品检定所 硕 士研 究生 学位 论文 苯二氮卓类药物有关物质的研究 姓名程 东 升 学号 专业药 物 分 析 导师南 楠研究员 二零零七年七月 目录 中文摘要 英文摘要 前言 第一章劳拉西伴有关物质检查 第一节劳拉西拌有关物质检查一方法的建立及优化 第二节劳拉西浮有关物质检查一的方法学验证及样品测定 第三节本章小结 参考文献 第二章奥沙西洋有关物质检查 第一节奥沙西拌的强制破坏试验 第二节杂质制备 、结构确证及其他杂质的定性 第三节分析方法的建立 、 优化选择 、 方法学考察及应用 第四节本章小结 、 参考文献 综述 已发表文章 图 , , , 谢 原创性声明和授权使用说明 中国药品生物制品检定所硕士论文 摘要 本文探讨并建立了苯二氮卓类药物中劳拉西洋及奥沙西洋有关物质的反相高效 液相色谱法一妙叩,即 一的分 析方法,并对其进行了方法学的验证,为国家新药标准中劳拉西洋及中国药典中奥沙 西洋原料和制剂的有关物质检查方法的建立及改进提供了参考,为其原料及制剂在生 产过程中的质量控制提供了依据 。实验主要分为两个部分 一 、在劳拉西伴有关物质分析的一方法的探讨中,我们利用己获得的 个劳拉西洋有关物质的美国药典对照品,改进并提高了美国药典对劳拉西伴原料及制 剂中有关物质的检查方法,通过对不同的流动相系统进行了比较研究分析,最终建立 了一个相对较好的一分析方法,进行 了方法学验证并以此方法对三个不同厂 家的劳拉西洋片剂及原料进行了测定,结果表明,该方法简便 、 灵敏 、 专属性强,可 用于劳拉西洋原料及其制剂中有关物质的检查 。 二 、 对奥沙西伴的有关物质进行了分析研究 。 首先,通过对奥沙西洋在强酸 、 强 碱 、热 、光照及氧化等条件下的强制破坏试验,利用一对其降解产物进行了 分析,并利用薄层色谱法对其中所产生的主要的未知降解产物进行了分离 、 制备,对 其进行了质谱 、 核磁 、红外光谱分析,确定了其分子结构式结合生产工艺及降解特 点,最终确定了奥沙西伴的三个有关物质 。 其次,通过对奥沙西洋及有关物质进行了 不同的流动相系统的比较研究分析,最终建立了一分析方法,进行了方法学 验证,并以此方法测定了奥沙西洋原料药和片剂,结果表明,该方法简便 、 灵敏 、 专 属性强,为奥沙西伴有关物质检查方法的建立提供了依据 。 关键词奥沙西伴劳拉西伴有关物质一 砂 中国药品生物制品检定所硕士论文 一一 , ,一 , ,一 , , , 一, 从, 又 一 , , 中国药品生物制品检定所硕士论文 前 、 口 镇静催眠药是抑制中枢神经系统引起镇静和催眠的药物 。小剂量引起镇静作用, 使患者处于安静和思睡状态,用以解除焦虑和烦燥不安 。 中等剂量引起催眠作用,可 减少觉醒次数,延长睡眠时间,用以治疗失眠症 。 某些药物大剂量有抗惊厥作用 、 肌 肉松驰作用和麻醉作用 。 理想的镇静药物能解除焦虑,但不产生或仅有轻微的运动 障碍或精神症状 。 理想的催眠药应较快的产生困倦感,加速进入睡眠,并能保持近似 生理的睡眠状态,醒后无延续作用 。目前常用的镇静催眠药有 巴比妥类如巴比妥 、苯巴比妥 、司可巴比妥等 苯二氮卓类如地西伴 、氯氮卓 、奥沙西汁、劳拉西伴等 其它类水合氯醛 、格鲁米特等 有关对苯二氮卓类药物的抗焦虑 、 镇静 、 催眠的作用部位和机制的认识,己经有 了明显的进步 。在脑皮质 、海马区和杏仁核发现有相当高密度的苯二氮卓受体 受体,而在丘脑和脑干中密度较低 。已有证据表明苯二氮卓的抗焦虑作用主要是通 过与杏仁核和海马区的受体的相互作用而产生的,抗惊厥作用是与皮层内的受体,镇 静安眠作用是与脑干核内的受体作用的结果 。 苯二氮卓类药物药动学特性可作为药物 选择的基本原则 。 因苯二氮卓类药物临床疗效较好,不良反应较轻,是 目前发展很快 的一类药物,氟西伴 、 地西伴 、 奥沙西伴 、劳拉西伴是常用的安眠药,在临床上常作 为抗焦虑 、镇静 、催眠的首选药,而巴比妥类 己逐渐被淘汰 。 目前,国内外对苯二氮卓类药物报道主要是集中在药理学方面,关于质量控制及 有关物质研究的相关报道不是很多 。 随着现代社会生活节奏加快,压力加大,以及夜 生活 、饮酒等不 良生活习惯,都会引发睡眠障碍,据世界卫生组织调查,的人有 睡眠问题和焦虑现象,因此,一个具有较好的疗效和较高安全性的苯二氮卓类药物也 会有更好的经济效益和社会效益,被广大睡眠障碍患者所使用 。 一个药物从合成原料药到制备有关的制剂,再经贮藏 、 运输 、 使用,要经历一段 较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一过程都有可能产生有关的杂质,如生产中可 能带入起始原料 、 试剂 、中间体 、 副产物和异构体等在贮藏和运输过程中,可能产 生降解产物 、 聚合物或晶型转变等特殊杂质 。 为保证药物的安全有效,同时也要考虑 到生产实际情况,因此,国内外对药物的研究,可允许含有一定限量的无害或低毒性 的有关物质,但对毒性较大,能危害人体健康的、 无效的或能影响药物稳定性的有关 中国药品生物制品检定所硕士论文 物质则必须严格控制 。 因有关物质的量微小,故检测方法至关重要,必须选择专属性 强 、 灵敏度高 、 重复性好的方法 。目前,首选方法就是色谱法,可根据药物及其有关 物质的性质采用,及等,必要时可采用、或 等联机技术,对有关物质进行定性定量分析 。 中国药典版收载的苯二氮卓类药物共有种,其有关物质的检查主要采用 的是薄层色谱法,其专属性 、 灵敏度 、 准确度均较差,大多口服固体制剂均未对有关 物质进行检查 。 因此,为了保证临床用药的安全与有效,我们对较为常用的奥沙西伴 和劳拉西洋建立了准确 、快速 、专属性高的 即一方法并推荐给药典委员会,对 于奥沙西洋和劳拉西伴的分析和质量控制是非常必要 。 通过采用新的更高灵敏度和专 属性的有关物质测定方法,结合药物原料及制剂的生产工艺,对药物进行质量控制, 也可以对生产工艺进行论证和指导,具有很大的应用价值和现实意义 。 为此,本课题主要分为以下两个部分 。 一 、在劳拉西洋有关物质分析的一方法的探讨中,我们利用已获得的 个劳拉西伴有关物质,即杂质、 、的美国药典标准品,对不同的流动相系 统进行了比较研究分析,最终建立了一个相对较好的 即 一分析方法并进行了方 法学验证,并对三个不同厂家的劳拉西伴片及原料进行了测定 。 二 、 对奥沙西洋的有关物质进行 了分析研究 。 首先,依据中国药典 化学药物杂 质研究的技术指导原则 ,对奥沙西伴在强酸 、 强碱 、 热 、 光照及氧化等条件下进行 强制破坏试验,并利用薄层色谱法对其中所产生的共同的降解产物及酸破坏条件下产 生的较大的未知降解产物进行了分离 、制备,利用、等对其进行了光 谱学 、 质谱及核磁共振谱的分析,在此基础上确定了未知杂质的分子结构式利用 一并结合生产工艺中可能引入的过程杂质对其降解产物及原料药进行了分析,最终 确定了奥沙西伴中必检的三个有关物质 。 其次,对奥沙西伴及有关物质进行了不同的 流动相系统的比较研究分析,最终建立并优化了一分析方法,进行了方法学验 证,同时测定了北京益民药业生产的奥沙西伴片剂,结果表明,该方法简便 、灵敏 、 专属性强,为奥沙西浮有关物质检查方法的建立提供了依据 。 中国药品生物制品检定所硕士论文 第一章劳拉西浮有关物质检查 劳拉西伴,又名氯轻安定,为美国公司开发的苯二氮卓类精神类药物, 其化学结构如图 。峪 。 拿 劳拉西洋为中枢神经抑制药,可引起中枢神经系统不同部位的抑制,随着用量 的加大,临床表现可 自轻度的镇静到催眠甚至昏迷 。 其作用部位与机制尚未完全阐明, 一般认为可以加强或异化 赞氨基丁酸的抑制性神经递质的作用,在苯 二氮卓受体相互作用下,主要在中枢神经各部位起突触前和突触后的抑制作用 。 劳拉 西伴为苯二氮卓受体的激动剂,苯二氮卓受体为功能性超分子盯功能单 位,又称为苯二氮卓一受体一 亲氮离子复合物的组成部分 。 受体复合物位于神经 细胞膜,调节细胞的放电,主要起氮通道的闭值功能 。受体激活导致氮通道开 放,使氮离子通过神经细胞膜流动,引起突触后神经元的超极化,抑制神经元的放电, 这个抑制传译为降低神经元的兴奋性,减少下一步去极化兴奋性递质 。 劳拉西洋可增 加氮通道开放的频率,可增强与其受体的结合或易化受体与氮离子通 道的联系来实现 。劳拉西洋因可作用在依赖性受体而具有以下药理作用 。 抗焦虑 、镇静 、催眠作用 。刺激上行性网状激活系统内的受体,因在 中枢神经系统为抑制性递质,其受体的刺激增强了在脑干网状结构受刺激后的皮质和 边缘性觉醒反应的抑制和阻断 。分子药理学研究体示,减少或拮抗的合成, 则该药的镇静催眠作用降低,如增加其浓度则能加强药的催眠作用 。遗忘作用地 西伴和劳拉西洋在治疗剂量时可以干扰记忆通道的建立,从而影响近事记忆 。抗惊 厥作用部分地可能由于增强突触前抑制,抑制皮质丘脑和边缘系统的致痈灶引起的 癫痈活动的扩散,但不能消除病灶的异常活动 。骨骼肌松弛作用主要抑制脊髓多 突触传出通路,也可能抑制单突触传出通路 。 劳拉西伴也可能直接抑制运动神经和肌 肉功能 。 劳拉西洋肌注吸收快而完全,属短至中等半衰期苯二氮卓类药,半衰期为一 小时,口服后一小时 、 肌注一小时血药浓度达峰值,重复给药蓄积作用甚小, 中国药品生物制品检定所硕士论文 经一天血浓度可达稳态 。经肾脏排泄,停药后消除快速 。劳拉西洋比已有的苯二 氮卓类药物毒性小 、 用量低,对 自主神经失调症 、 心脏神经症等引起的紧张不安 、 焦 虑 、忧郁等有较好的疗效日。本品在国外销售势头良好,曾在年美国前百名处 方药排名中名列第位,并被列为年世界畅销药物。 迄今为止在多个国家销 售使用 。在国内,该药主要依赖进 口,但也己有厂家获得生产批件 。 目前,国内外关于劳拉西洋的文献报道们 多是临床应用及血药浓度分析方面, 而关于劳拉西洋有关物质分析报道很少 。川报道了劳拉西伴中一个新的杂 质 。 美国药典版 收载了劳拉西洋原料及其制剂,包括片剂 、注射剂及口服溶液 剂 。 在原料药中主要列出二个杂质,即杂质和杂质,在制剂中主要考察了四个杂 质,即杂质、杂质、杂质、杂质。 美国药典收载的各有关物质分子结构及名称 尸州 介 今。丫日了 丫 ” 乙 、日人呀汀 州 己。 。 。,。,口 、声尹 八 、尹以 叮 卞印 二 升 气 杂质杂质 杂质、 、 一一 氯一一一 氯苯基一,一 二氢一一 乙酞氧基一护,一 苯二氮卓一一 酮 一 氨基一一 氯苯基一 氯苯基 甲酮 一 氯一一 一 氯苯基 一 喳哩琳一一 醛 一 氯一一一 氯苯基一一 喳哇琳 甲酸 一 氯一一一 氯苯基一一 哇哩琳 甲醇 中国药品生物制品检定所硕士论文 劳拉西洋合成工艺 孕岁 。丫 、 杂质 。 应袭才 么退,、扩,。 杂质劳拉西伴 劳拉西伴的降解过程 杂 质 杂 质杂 质 由合成工艺及降解过程看出,杂质和杂质均为过程杂质,但杂质同时又可 能是降解产物,因此,美国药典对原料药中杂质进行了严格的控制,对杂质则并 未做具体要求而杂质、 、 均为降产物,故在制剂中重点考察了该个降解杂质 。 欧洲药典 仁 中只收载了劳拉西伴原料药,并列出杂质和杂质,但均未做具体 要求 。中国药典未收载该品种,但已有国家新药标准,考察了杂质及未知总杂质 。 各国药典收载劳拉西伴的情况,如表 中国药品生物制品检定所硕士论文 表国家新药标准 、及关于劳拉西伴及其制剂中有关物质检查 有有有关物质质 采用的方法法限度规定定 原料料及其他他展开剂氯仿一二氧六环一冰醋酸紫外检视视总量不得过 总总总总杂质质质质 展开剂氯仿一二氧六环一冰醋酸显色色落 注注注射液液、流动相甲醇一磷酸二氢钱,氨水调柱。 检测波长廷 展开剂氯仿一正庚烷一乙醇显色色毛 口口口服服、 、即流动相甲醇一磷酸二氢钱柱检测波长 溶溶溶液液液液、 总量蕊 片片片片、 、展开剂氯仿一二氧六环一冰醋酸紫外检视视总量蕊 展开剂氯仿一二氧六环一冰醋酸显色色毛 国国家 新新原料料展开剂氯仿一二氧六环一冰醋酸紫外检视视片剂簇 药药标准准片剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂剂其其其其他未知知流动相甲醇一水柱,检测波长落片剂 原料料、展开剂甲醇一 氯仿紫外检视视毛 从检测方法来看,原料药大多采用或多个系统分别考察各杂质含量,其 中有的薄层色谱法要先后采用种显色剂才能最终观察结果,其灵敏度 、 选择性 、 准 确性相对较差 。由于各杂质结构 、极性相差较大,制剂的有关物质检查方法多采用 和相结合或两个方法相结合的方式来检测,给实验操作和结果判定带 来不便 。 国内己有厂家研制生产劳拉西洋,在我国新药标准中并未规定杂质的具体限 度,但国家药监局药审中心建议申报企业增加对杂质的测定 。 这是某厂家申报资料中杂质对照品的测定图谱 ,纽 口 日 自为翻 刽白 宙 翻 奋月、 福 对公 巴 必自臼 毒 器 竖 凳产 踢玉 磊朵翰 盗肠,。 摄 雾 努 念资 簇 鑫 丝 扩, 积 犯溉 色 璐 困 分 拉 侧 浮物 斌 以冲启 崔 妥 由图中可以看出,杂质峰形很差,无法判断其纯度,给杂质定量带来困难 。同 时,杂质的获得性较差,企业无法制备满足检测需要 。 中国药品生物制品检定所硕士论文 为了提高人民群众用药安全性,增强我国药品标准对质量的可控性,我们对劳拉 西洋有关物质进行了进一步的考察 。 从各国药典及我国药品标准收载的情况来看,对 于杂质均未作出严格和详细的规定,因此,我们主要对杂质、 、 、 进行了深 入的考察,而对各标准均未做出严格规定的杂质,未进行具体的研究 。本部分的工 作主要包括 分析方法的建立 、优化选择 我们以劳拉西洋及有关物质为主要研究对象,对劳拉西洋进行了强制破坏试验, 以考察劳拉西伴在不同条件下的稳定性及可能产生的降解产物,确定了主要杂质为杂 质、 、 、,以劳拉西洋及获得杂质、 、 、 的美国药典标准品为研究对象, 考察了不同的流动相组成及,以分离度 、分析时间等因素为指标,确定了 【 一 磷酸二氢钱一 甲醇一 乙睛一 磷酸调的流动相系 统较好 。 对所建立的方法进行了方法学验证及样品的测定 我们对所建立的方法进行了方法学验证,并利用该方法测定了三批原料及来 自泰 国大西洋制药有限公司及香港澳美制药厂提供的批劳拉西伴片剂样品,试验结果表 明,该方法简便 、灵敏 、专属性强。 第一节劳拉西浮有关物质检查一方法的建立及优化 劳拉西伴的强制破坏试验 试剂与样品 劳拉西浮对照品,含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 杂质、 、 、 均为美国药典对照品甲醇 、乙睛为色谱纯,磷酸二氢按 、磷酸为 分析纯,水一 盐酸溶液,一 氢氧化钠溶液和双氧水溶液 。 仪器及色谱条件 一 工 工 型澄明度检测仪 调节照度为,天津大学精密仪器厂 ,检测器 色谱条件 色谱柱为一 柱, 检测波长 中国药品生物制品检定所硕士论文 流速 流动相系统甲醇一乙睛一磷酸二氢钱,用一 磷酸调节约为 溶液的配制及试验 供试液的配制 称取劳拉西洋对照品于量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀 。 分别量取上述溶液于个量瓶中,其中三个分别加入一 盐酸溶 液,一 氢氧化钠溶液和双氧水溶液,室温下放置,加甲醇稀释 至刻度另外两个先用甲醇定容,其中一个置 水浴中做加热破坏试验另 取一个置下放置做光破坏试验 。分别取上述各破坏项下的溶液, 加流动相溶解至,进样,并记录色谱图。 标准溶液的配制 准确称取杂质、 杂质、 杂质及杂质各分别于量瓶中,加甲醇至 刻度,摇匀,取上述溶液分别于量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,做为对照 溶液,进样,以保留时间为指标考察各强制破坏溶液所产生的降解产物 。 结果 强制破坏试验结果 酸破坏、碱破坏、光破坏、 么二六二 一一一一一下一而 一 一油浦 如。 热破坏和氧化破坏的色谱图 劳拉西伴未知降解产物杂质杂质 中国药品生物制品检定所硕士论文 杂质杂质溶剂峰 各成分的谱图 讨论 通过破坏试验,可以看出劳拉西伴对强碱和强光相对较稳定 。在热破坏 下,产生杂质,按峰面积归一化法计算,约为在酸破坏下,则产生了一个 未知杂质和杂质,按归一化法计算,杂质总量约为在氧化破坏下,产生了 杂质、杂质、杂质,按归一化法计算分别约为、。 通过图谱扫描,我们确定了检测波长为,与美国药典 了 一致 。 方法的建立 以劳拉西伴及各有关物质为主要研究对象,考察了不同的流动相组成及,以 分离度 、分析时间 、峰形等因素为指标,发现 了以一,磷酸二氢钱一 甲醇 乙睛,用。 一 磷酸调酸性 为流动相体系的分析效果较好 。 试剂与样品 劳拉西洋对照品,含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 杂质、 、 、 均为美国药典对照品甲醇 、乙睛为色谱纯,磷酸二氢钱 、磷酸为 分析纯 仪器及色谱条件 色谱条件 色谱柱均为一 、 柱 检测波长 , 流速 中国药品生物制品检定所硕士论文 流动相系统 甲醇一磷酸二氢按,为 甲醇一 水,含三乙胺,约为 甲醇一乙睛一磷酸二氢按,用磷酸调节约为 溶液的配制 准确称取劳拉西伴对照品、杂质、杂质、杂质及杂质各分别于 量瓶中,加甲醇至刻度,作为贮备溶液 。 分别取上述贮备液于量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,做为对照溶液, 进样 ,考查各方法的参数 。 试验结果 劳拉西伴及其有关物质在各系统下的峰形 劳拉西伴 结果表明,劳拉西伴在各系统中的峰形基本一致 。 杂质 杂质在系统中的拖尾现象较为严重,在、 系统中峰形较好 。 杂质 中国药品生物制品检定所硕士论文 结果表明,杂质在碱性系统中峰形最好,在系统中有前伸现象 。 杂质 杂质在碱性系统中几乎不保留,可能是由于分子结构中含有的梭基基团所致, 在酸性系统中有一定程度的拖尾现象 。 杂质 杂质在系统中峰形较好,在、 系统中有托尾现象,其中在系统中较为 严重 。 各有关物质在不同流动相系统中与劳拉西洋的相对保留时间图 中国药品生物制品检定所硕士论文 各有关物质与劳拉西伴相对保留时间图 圈 亘言翻举蕊辱 有关物质 由表中可以看出,在系统中,杂质与杂质对劳拉西洋的相对保留时间十 分接近分别为、,在混合体系中将很难达到分离,且杂质对劳拉西伴 的相对保留时间也接近于在系统中,、 不能良好的分离,杂质几乎随溶 剂出峰,与劳拉西伴的相对保留时间为,且杂质出峰时间也相对较长在 系统中,各峰对劳拉西伴的相对保留时间较为合理 。 杂质与杂质也能较好的分离 相对保留时间分别为和,但在条件优化试验中,我们仍将杂质与杂 质的分离度作为考察指标 。 另外,我们还试验了加入离子对试剂或四氢吠喃等其他的流动相系统,均未取 得理想效果,同时,实验中还发现水相比例对杂质的保留时间影响较大 。 综合上述 因素,我们选定了甲醇 、乙睛 、磷酸二氢钱组成的酸性流动相系统 。 方法的优化 在这部分中,我们以甲醇一乙睛一磷酸二氢按为基础流 动相,用一 磷酸调节,以拖尾因子 、容量因子 、杂质与杂质的分离度 为指标,考察了各物质在、不同条件下的分离分析情况 。 试剂与样品 劳拉西伴对照品,含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 杂质、 、 、 均为美国药典对照品甲醇 、乙睛为色谱纯,磷酸二氢馁 、磷酸为 分析纯 仪器及色谱条件 ,检测器 色谱条件 色谱柱均为一 柱咖, 检测波长流速 中国药品生物制品检定所硕士论文 流动相甲醇一乙睛一。磷酸二氢按,用一 磷酸 调节分别为、 溶液的配制 分别取 动相至刻度, “溶液的配制 ” 项下的贮备溶液各于同一量瓶中,加流 摇匀,作为供试溶液,进样,考查各方法的参数 。 试验结果 不同条件下各成分的拖尾因子变化 不同条件下各成分拖尾因子 一一一 一一一叫 一 叶叶 一一一一卜 一一 卜卜 一 一 一 一 一 份 一 一 一 一 一一曰曰 今劳拉西浮 一杂质 杂质 一 例一 杂质 一 帐一 杂质 平医醒垠 由图中可以看出,各成分在不同条件下的拖尾因子均在一之间,其 中劳拉西洋 、杂质、 杂质及杂质随变化较小,而杂质的拖尾因子随变 化发生了比较明显的变化,在时较大 。 不同条件下各成分的容量因子变化 不同条件下各成分的容量因子变化 一一 一一一叫杏一一一一一 今劳拉西伴 一杂质 杂质 一 噪 婿 杂质 书卜 杂质 冷区叫仲 由表中可以看出,杂质的保留时间随升高而明显的变小,可能是由于 变化影响了杂质的电离平衡,从而使其保留时间发生了变化,即 中国药品生物制品检定所硕士论文 。协 、护 寸 ,护 其他成分的保留时间随变化基本保持不变 。 不同条件下杂质与杂质的分离度变化 不同条件下的分离度变化 内匕 匀一匕 月任 一 任 侧袍求 由表中可以看出 时, 杂质与杂质的分离度随变化发生了一定的变化 。在 使得杂质与杂质的分离度能满足分析要求 。当在 时,则小于了。 最终,我们确定了这样的流动相系统甲醇一乙睛一磷酸二氢钱 ,用一 磷酸调节约分别为 第二节劳拉西浮有关物质检查一的方法学验证及样品测定 本部分实验主要是对已建立方法进行了方法学考察,并对来 自两个厂家的片剂 样品及三个厂家的原料药进行了有关物质的测定 。 方法学验证 试剂与样品 劳拉西洋对照品,含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 杂质、杂质、杂质和杂质对照品均为美国药典对照品,原料药由湖北中天爱 百颗药业有限公司,批号为、 泰国大西洋制药有限公司,批号为 中国药品生物制品检定所硕士论文 和香港澳美制药厂,批号为提供劳拉西伴片分别来 自泰国大西洋制药有限 公司,批号分别为、和香港澳美制药厂, 批号分别为、,规格分别为每片含劳拉西洋, 甲醇和乙睛为色谱纯,磷酸二氢馁 、磷酸为分析纯 仪器及色谱条件 色谱条件 色谱柱一 柱二,“ 检测波长流速 流动相系统甲醇一乙睛一磷酸二氢馁,用磷酸调节 约为 溶液的配制 精密称取劳拉西伴对照品、 杂质对照品、 杂质对照品 、杂质对照品和杂质对照品分别于量瓶中,加甲醇溶 解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液 。 系统适用性试验 分别精密量取上述溶液于同一量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇 匀,作为系统适用性试验供试液,进样,记录色谱图,计算各峰理论塔板数 均大于,邻近峰间分离度均大于。 最最最 、 系统适用性试验的色谱图 方法学验证 线性 精密量取杂质、 、 、 的贮备液,一,分别于 中国药品生物制品检定所硕士论文 量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,制成杂质、 、 、 混合对照品溶液, 标记为一号,分别进样,记录色谱图。以峰面积为纵坐标,以浓度 厂 一为横坐标,进行线性回归,以考察各有关物质的线性 。 相对响应因子 取系统适用性试验溶液,进样,重复进样次,按峰面积与浓度之比计算 各杂质与劳拉西伴的相对响应因子 。 进样精密度 取系统适用性试验溶液,在内重复进样次,计算各峰面积的相对标准偏差 。 稳定性试验 取系统适用性试验溶液,分别于,进样测定,以峰面积变化为指标, 考察各成分在溶剂及流动相系统中的稳定性 。 最低检测限 精密量取杂质、 、 、 的贮备液分别于量瓶中,加流动相至 刻度,摇匀,作为最低检测限试验溶液,进样,按信噪比二计算最低 检测限 。 回收率试验 称取三份劳拉西伴各己知杂质均未检出各约,分别置量瓶中,分 别准确加入 “ 线性范围 ” 项下第号杂质、 、 、 混合标准溶液、 ,作为回收试验的高 、 中、 低浓度供试液,加流动相稀释并定容,进样。 根据标准对照法计算各杂质的回收率 。 结果 线性 各成分回归方程分别为 杂质厂犷,线性范围为“ 一 杂质 曲线 彩 目 誊 溶液浓度 中国药品生物制品检定所硕士论文 月盛 一一 杂质子犷二,线性范围为一 杂质 曲线 彩目暂 溶液浓度 杂质二丫,线性范围为一 杂质 曲线 彩 目 誉 溶液浓度 杂质丫,线性范围为一一。 杂质 曲线 彩 旧 鹭 溶液浓度 结果表明,各有关物质在一定浓度范围内线性关系 良好,该浓度范围可以满足有 关物质分析的浓度要求 。 相对响应因子 按峰面积与浓度之比计算各杂质与劳拉西伴的相对响应因子,杂质为,杂 质为,杂质为,杂质为。 进样精密度下 中国药品生物制品检定所硕士论文 各峰面积及相对标准偏差结果 样品劳拉西洋杂质杂质杂质杂质 峰面积 平均峰面积 稳定性试验 时间间隔 劳拉西伴 峰面积平均峰面积 杂质 杂质 户内 叮了。 八 口 ,卜卜卜卜 卜目 卜 八曰山连 几曰座 日 月性 日乙庄 上口自庄 杂质 杂质 结果表明,杂质在内进样峰面积为,表明杂质在内是稳定 中国药品生物制品检定所硕士论文 的其他各成分在内进样峰面积均小于,表明在是稳定的,除各主 峰外,无其他杂质峰出现 。 最低检测限 按信噪比计算最低检测限,杂质为,杂质为,杂质 为,杂质为。 回收率试验 样品浓度对 照 品 加 入 量测得量回收率平 均 回 收 率 杂质高 中 左 三口 日 匕一 口,曰 自 八口八 曰上曰上曰,人,土,二 低高中低高中低高中低 杂质 杂质 杂质 样品测定 参照了 收载的原料药及片剂中有关物质的限度标准,其中各己知杂质按杂质 对照计算,未知杂质按劳拉西洋 自身对照计算有关物质含量,我们测定了来 自 湖北中天爱百颗药业有限公司 、 泰国大西洋制药有限公司和香港澳美制药厂提供的三 批原料药样品和来 自泰国大西洋制药有限公司和香港澳美制药厂的片剂,取得了满意 的结果 。 劳拉西洋片剂 取劳拉西洋片粉适量 约相当于劳拉西浮,分别置量瓶中,加流动 相适量,超声溶解,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试 品溶液,按本法测定,进样,记录色谱图 。结果见表及图。 中国药品生物制品检定所硕士论文 劳拉西伴原料药 取劳拉西洋原料药约,置量瓶中,加流动相适量,超声溶解,加流 动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,按上述色谱条件,进样,记录色 谱图。结果见表及见图。 表样品有关物质测定结果 有关物质 杂质 杂质未知杂质 杂质总量 片齐 原料药 未检出 八咖 图劳拉西伴片剂和劳拉西洋原料药 劳拉西伴杂质杂质未知杂 质 小结 在原料药及片剂测定中,均未检出杂质及杂质美国药典 规定片剂中杂质 的含量不得过,其余有关物质总量不得过。由样品测定结果可以看出, 有的批次样品其有关物质总量可达以上,当采用薄层色谱半定量法进行测定 中国药品生物制品检定所硕士论文 时,很难判断出是否符合规定,但通过本文中方法,则可以较为准确的测定各杂质的 百分含量 。 第三节本章小结 在本章试验中,我们主要进行了劳拉西伴有关物质分析方法的研究 。 首先,对劳 拉西伴进行了强制破坏试验,确证了劳拉西伴可能产生的降解产物,利用获得的 个劳拉西伴已知杂质对照品,建立并优化了同时测定该四种有关物质的一 测定方法,并进行了方法学验证及样品测定 。 试验结果证明该方法具有专属性强、 灵敏度高、 方便快速的优点,克服了美国药 典中采用薄层色谱半定量时不准确和临界结果难 以判断的弊端,同时,统一了原料药 和片剂的检测方法 。 通过方法学验证试验中相对响应因子的考察,杂质、 、均为左右,在 实际检测中可采用高低浓度 自身对照法杂质的相对响应因子为,略偏高,实 验中可采用加校正因子的自身对照法计算杂质限度,若采用不加校正因子的自身 对照法将 “ 从严 ” 要求,不会降低其质量标准,总之,可以克服杂质对照难以获得的 麻烦 。 试验中也对杂质的纯度进行了考察,证明了杂质的纯度可以满足有关物质 检查的需要,峰形差的原因是流动相体系不适合造成的,解答了厂家的疑问。 参考文献 孙定人,张石革 国家临床新药集 中国医药科技出版社 汤光 李大魁,现代临床药物学 化学工业出版社 李瑛 劳拉西淬的现状及前景展望 中国医药导刊,一 部娜,贾琳静等 反相高效液相色谱法测定人血浆中劳拉西洋的浓度 药物分析杂 志,一 温预关,陈伟家,叶莉英法测定人血浆中劳拉西洋的浓度 中国临床药学 杂志, 助,一 一 中国药品生物制品检定所硕士论文 第二章奥沙西浮有关物质检查 目 口吕 奥沙西伴,又名去甲轻安定,商品名为舒宁,是继地西洋后于年合 成的药物,实际上也是地西洋在体内的代谢物门,其化学结构见图。 , 了 、 名 “ 川 人 从 灯 一占 此药具有显著的镇静 、抗焦虑作用,能缓解神经官能症患者的焦虑不安 、精神 紧张及烦恼失眠等症状,对更年期焦虑亦有效。 该药亦有较好的松驰肌肉和抗抽搐 作用,与地西伴相比,只是效力稍弱,相当于地西洋。由于该药对 自主神 经系统的作用较为显著,故对胃肠道 、 心血管 、 呼吸系统不适引起的焦虑症状有较好 的效果 。 口服后吸收较慢,小时内血药浓度达峰值 。 口服后生物利用度, 与血浆蛋白结合率约。 吸收后分布于各脏器,其中肝 、 肾代谢的分布占总量的半 数以上,代谢方式为与葡萄糖醛酸结合而成为无活性的代谢物,随尿排出,平均消除 半衰期为小时 。此药没有注射用制剂,只能口服 。 一些文献, 仁 报道了组织与血浆中奥沙西洋的测定方法,但重点是强调了该药 与血浆和组织的分离赵慧玲等 对中国药典奥沙西伴有关物质的薄层色谱法测定 方法做了改进 采用了柱,以甲醇一水一冰醋酸为 流动相,测定了奥沙西伴片剂及胶囊剂中的有关物质,但所用方法对于有关物质的分 离及峰形均较差,难 以实现定量 。美国药典版仁 收载了奥沙西洋原料及其制剂, 包括片剂 、胶囊剂,但均未对有关物质检查做出规定 。欧洲药典 中只收载了奥沙 西洋原料药,并以板 、甲醇三氯甲烷为展开剂的薄层色谱法对有 关物质进行了测定 。 英国药典 。 和中国药典 收载该品种的原料及其片剂,中国药 典只对原料药中有关物质进行了测定,英国药典对片剂中有关物质也只采用了薄层色 谱法进行了测定,其方法的专属性及灵敏度相对较差 。 就 目前来看,对奥沙西伴有关物质的系统性研究未见报道,而各国药典所采用的 检测方法也比较落后,也没有杂质对照品,为了提高人民群众用药安全性,增强我国 药品标准对质量的可控性,我们对奥沙西伴有关物质进行了深入研究 。 本部分的工作 主要包括 奥沙西伴的强制破坏试验 中国药品生物制品检定所硕士论文 我们以奥沙西伴为实验样品,依据 化学药物杂质研究的技术指导原则 ,对 奥沙西洋进行了强酸 、 强碱 、 热 、 光照 、 氧化等破坏试验,针对各条件下产生的杂质, 初步建立了适用的高效液相色谱法 。 杂质制备及其他杂质定性 根据强制破坏试验的结果,我们选择了薄层色谱法对两个主要的未知降解产物进 行了分离 、制备,并进行了、试验,确证了它们的分子结构式 。 采用一对各强制破坏试验溶液进行了进一步的分析,结合奥沙西伴的生产合 成工艺,明确了奥沙西伴在生产 、 存放 、 使用过程中可能产生的过程杂质及降解产物 。 分析方法的建立 、优化选择及方法学考察 我们以奥沙西洋及其有关物质为主要研究对象,考察了不同的流动相组成及 、不同的柱温,以分离度 、分析时间等因素为指标,同时考查了有关物质在流动 相系统中稳定性,发现了含的磷酸二氢按并用三乙胺调节左右的甲醇一 水的流动相体系的分析效果较好 并对所建立的方法进行了方法学的验证及样品的测 定,实验结果表明,该方法简便 、灵敏 、专属性强 。 第一节奥沙西洋的强制破坏试验 药物中有关物质一般包括生产工艺引入的杂质和降解产物等,可能是已知的或未 知的、 挥发性的或不挥发性的,有关物质的检测方法包括化学法 、 光谱法 、 色谱法等, 因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法 。 为了考察奥沙西洋在生产 、 贮存 、 使用过程中可能产生的降解产物,我们选用了合适的酸 、 碱 、光 、 热 、 氧化等反应条 件对奥沙西伴进行 了加速破坏性试验考察 。采用了不同流动相系统的高效液相色谱 法,以绘制三维图谱以考察所产生的降解产物,从而保证了能否有效检测出原 料药或制剂中的降解产物 。 结合生产合成工艺可能产生的杂质,我们采用了一法,对奥沙西伴原料 及强制破坏试验溶液进行了分析,从而判定了奥沙西伴可能存在的有关物质 。 一材料与方法 试剂与样品 奥沙西伴对照品 含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 中国药品生物制品检定所硕士论文 溶液。、溶液。、溶液甲醇 、乙睛为色谱纯, 产品水盐酸 、氢氧化钠 、三乙胺为分析纯 。 仪器及色谱条件 色谱系统, 色谱条件 甲醇一,色谱柱,一, ,流速,检测波长 甲醇一水一三乙胺,色谱柱一, ,流速,检测波长。 试验 称取奥沙西洋对照品于量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀 。 分别量取上述溶液于个量瓶中,其中三个分别加入。 一 盐酸溶 液,。 一 氢氧化钠溶液和双氧水溶液,加甲醇稀释至刻度,室温下避 光放置另外两个先用甲醇定容,其中一个置 水浴中做加热破坏试验另取一 个置下做光破坏试验 。分别取上述各破坏项下的溶液,加不同的流 动相溶解至,在各 自的流动相系统下,进样,记录色谱图及谱图。 依上法操作,采用色谱条件,在不同的破坏时间里,进样,以降解产物峰面 积 主峰面积考察各降解产物的变化情况 。 二试验结果 系统下各破坏试验溶液图谱 。,目 系统下酸破坏、碱破坏、光破坏、热破坏和氧化破坏的色谱图 中国药品生物制品检定所硕士论文 奥沙西伴、 、 、 未知降解产物、 溶剂峰 系统下各破坏试验溶液图谱 斤 邺 丛 一 一 艺 系统下酸破坏、碱破坏、光破坏、热破坏和氧化破坏的色谱图 奥沙西伴、 、 、 未知降解产物、 溶剂峰 系统下不同破坏时间时各降解产物峰面积 主峰面积变化结果 酸碱光热氧 未知 未知万 未知 未知 未检出 酸破坏样品图谱 中国药品生物制品检定所硕士论文 三讨论 在不同的液相系统中,各破坏试验溶液所产生的降解产物峰一致,并结合的 三维图谱及图谱可以判定不存在未被分离及未被检出的产物,同时,兼顾奥沙西 伴及降解产物的最大吸收,我们也确证采用作为检测波长 。 通过破坏试验,可以看出奥沙西伴在强酸 、强碱 、光照 、氧化及热环境下均不稳 定,均在时产生了共同的杂质命名为杂质在碱性破坏条件下,产生了 一个未知杂质。科,命名为杂质在酸性破坏下还产生了较大含量的杂质 产,峰面积约相相当于主峰面积,命名为杂质及,、二的一个 杂质 杂命名为杂质。 随着破坏时间的增加,各杂质峰面积 主峰面积值明显增大,我们可以认为各峰均 为降解产物峰 。 由于酸破坏所产生的未知降解产物量较大及在各种破坏条件下均产生另一未知降 解产物,因此,我们决定下一步对该两个化合物进行制备分离并确定结构 。 第二节杂质制备 、结构确证及其他杂质的定性 药物中样品的分离制备,一般常采用或来实现,本试验中,我们采 用了法 吸附剂氏,展开剂参照中劳拉西伴 川 中有关物质检查的薄 层系统,我们选择了一二氧六环一冰醋酸作为展开系统二 分离并制 备了杂质和杂质。 因绷吸附剂中含有粘合剂及荧光指示剂,其化学组成比较复 杂,在提取板分离的化合物的过程中,吸附剂中的一些杂质很可能也被提取出 来,因此,我们预先用甲醇洗脱了薄层板 。 在制备型薄层色谱中,常用的吸附剂厚度 为一,薄层厚度与薄层板的尺寸限制了可 以分离的样品量,一般 厚的硅胶板最多可上样约,而我们采用的是 厚的板,因此,上样量略 中国药品生物制品检定所硕士论文 偏低 。 一杂质的制备及结构确证 试剂与样品 奥沙西伴对照品,含量,由中国药品生物制品检定所提供,批号 一,试剂 盐酸溶液,甲醇为色谱纯,三乙胺 、氯仿 、二氧六环 、冰醋酸均为分 析纯,水 。 仪器及色谱条件 制备系统 紫外检视仪 薄层板、 板,实验室 自制 展开系统一二氧六环一冰醋酸 测定系统 色谱系统, 色谱条件 流动相甲醇一水一三乙胺,二 色谱柱一, 流速检测波长 试验 样品的破坏称取奥沙西伴约于量瓶中,加 甲醇适量约溶 解,加溶液溶液,室温下放置小时,作为供试液 。将供试液稀 释,进样,记录色谱图 。 毒知杂 顶 乞筋 酸破坏样品色谱图 中国药品生物制品检定所硕士论文 制备取供试液,点样点样量约于预先用甲醇纯化的氏 薄层板,以 刃 一二氧六环一冰醋酸为展开剂展开,自然挥千,置紫外灯 下检视,计算奥沙西洋及各降解产物,结果 样品奥沙西洋降解产