硕士论文-含有antiWaxy基因表达载体的构建及水稻遗传转化.pdf

致谢 首先感谢导师李建粤副教授在研究生三年中给我的悉心帮助! 本论文是在导师李建粤副教授的悉心指导下完成的。论文从选题 到制定具体的试验方案，从实施到撰写，每一步都凝结着李老师的心 血。感谢李老师三年来在学业上的悉心指导! 李老师严谨的治学态度、 兢兢业业的工作作风和对科学孜孜不倦的钻研精神，将使我铭记和受 益终生，是我毕生所学习的目标。不仅如此，李建粤老师在生活上还 给予了我最悉心的照料，谨此致以虔诚的敬意和衷，心的感谢! 衷心感谢中科院植物生理研究所与生态研究所洪孟民研究员和 王宗阳研究员为我们提供的质粒，感谢上海闵行区农科所陆文龙高级 农艺师为我们提供试验的水稻材料，感谢遗传学硕士点周根余教授和 杨仲南教授在学习和生活上的关怀以及在论文实验上给予的支持和 帮助! 感谢实验室所有的同学，张伟、刘丽娜、魏秀丽、李海泉、逯慧、 尹中明、顾婷玉、石少华、周永国、沈忠伟，他们都在实验上给了我 无私的帮助! 感谢2 0 0 2 级本科生戎益泉、张善明、魏振、陈文杰同 学在论文和试验中给予的帮助! 感谢好友钱志萍、庞婉婷、杨云云在 生活上给予我的关心和帮助，也给了我很多快乐! 最后，感谢我的家人对我三年研究生学习生涯的支持，他们的理 解、鼓励，关怀与宽容是我不断前进的动力! 再次衷心的感谢所有关心和帮助过我的老师、同学和朋友们! 含有础一嬲哮基因表速栽体构建反水稻遗传转化 摘要 在大量转基因植物被推向市场的同时，人们对转基因植物可能存在的风险感 到担扰。在转基因作物中，不含标记基因和外源启动子将提高转基因作物的食用 安全性和对环境的安全性，更易被广大消费者所接受，也有利于对同一个植物品 种进行多次转基因操作。本研究在p 1 3 w 8 载体的基础上重新构建了含有反义蜡 质基因，且去除了抗性标记基因( 潮霉素基因) 和3 5 s 启动子的安全性表达载体 p 1 3 a w y _ 1 ，这可为日后利用基因工程的共转化法培育优质食味品质安全转基因 水稻奠定基础，更有利于消费者食用安全和生态环境的可持续发展。 本研究还利用根癌农杆菌介导的共转化法，将含有p c a m b i a l 3 0 1 双元载体 ( 含有潮霉素抗性基因、秽s 报告基因) 和己成功构建的p 1 3 a w v l 双元载体( 只 含反义蜡质基因不含抗性标记基因和譬淞报告基因) 的根癌农杆菌以1 ：9 的比 例混合导入由粳型光敏核不育系水稻2 6 1 s 成熟胚诱导形成的愈伤组织中，经抗 性筛选获得4 1 棵转基因植株。转基因t o 代植株经p c r 检测，有1 0 棵为共转化 植株，共转化率为2 4 3 9 。s o u t h e mb l o t 杂交分析证实，p 1 3 a w y _ l 双元载体 t d n a 已整合进入转基因植株基因组中。利用p c 触佃i a l 3 0 1 双元载体上的g w 报告基因从t t 代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代，这为 筛选只含目的基因、无抗性选择标记基因和报告基因的转基因后代奠定基础。 当今世界上正兴起一种新型稻米软米育种。软米最大特点是：稻米的直 链淀粉含量较低，一般小于1 0 ，其米质介于粘性与糯性之间，口感极佳。目前 已有报道表明，导入蜡质基因( 腑哕) 的反义片段能够有效降低稻米的直链淀粉 含量，但其转基因后代中直链淀粉含量小于1 0 或明显降低的后代都比较少。因 此，本研究又在安全性表达载体p 1 3a w v l 的基础上构建含有双份反义蜡质基因 的安全性表达载体p 1 3 a w v 2 ，即把双份反义蜡质基因片段构建在一个1 - d n a 区段上。该表达载体的成功构建可为培育直链淀粉含量明显降低的特种水稻奠定 基础。 关键词：转基因作物安全性 反义蜡质基因表达载体构建无标记基因 共转化根癌农杆菌介导3 5 s 启动子软米食味品质改良 搐要 a b s t r a c t w i t hl a r g ea m o u n to f t r a l l s g e n i cp l a m sb e i n gc o m m e r c i a l i z e d ，p e o p l ef e e lu n e a s y a b o u tt h ep o t e m i a lr i s k so f t r a n s g e n i cp l a n t sm a r k e r - 行e ea n da c c e p t o rp r o m o t e rm a y r a i s ef o o da n de n v i m n m e mb i o s a f e t yo fg e n e t i c a l l ym 0 d m e dc r o p s t h u s ，c o n s u m e r c a nr e c e i v et h e mm o r ee a s i l yr e c o n s t m c t i o no fp 1 3 a w y 二1i sb a s e do np 1 3 w 8 p 1 3 a w y - lc a m e sa n t i - 腑叫g e n eb u tw i t h o u tr e s i s t a n c em a r k e rg e n e ( h y g r o m y c i n ) a n d3 5 sp r o m o t e fnw i l ll a yt 1 1 ef o u n d a t i o nf o rr i c ee a t i n gq u a l i t yi m p r o v e m e mb y t r a n s g e n i ct e c h n o l o g ym o r e o v e l “c a nm a k et h eg e n e t i c a l l ym o d i f i e dp l a m ss a f e rf o r c o n s u m e r sa n dt h ee n v i r o n m e m t h e t w ol ( i n d so f 彳g 阳6 鲫f f 鲫zf 踟咖抬鸺w h i c hr e s p e c t i v e l yc a r r i e dt h ev e c t o r p c a m b i a l 3 0 l ( c o m a i n sh y g r o m y c i ng e n ea i l dg 淞g e n e ) a n dv e c t o rp 1 3 a w y - 1 ( o n l yh a s 姐t i h 切g e n ew i t h o u tm a r k e rg e n e ) ，w e r em i x e da tt h ed e n s i t yr a t i oo fl ：9 t h et - d n a so f t h et w ov e c t o r sp c a m 旧i a l 3 0 1a n dp 1 3a w y 二1w e r ei n t r o d u c e di m o 2 6 l sb yt h ec o t r a n s f o 姗a t i o nm e t h o do f w h i c hi ss a f e t yt r a n s g e n i ct e c h n i q u e u s i n g p c ra n a l y s i ss h o w c dt h a tl o1 i n e sa m o n g4 1i n d e p e n d e n tt r 锄s g e n i c1 i n e sw e r e c o - 仃a i l s f o r m a t i o np l a m s ，2 4 3 9 c o - t r a j l s f o r m a t i o n 仔e q u e n c yt h ev e c t o rp 1 3 a w y - l t _ d n ai nt h er i c eg e n o m ew a sc o n f i r m e dt h r o u 曲s o u t h e mb l o t 卸a l y s i s t h e nu s i n g g 船g e n et ow a s ho u tt ls e e d st h a th a v et t l er 印o r tg e n ea n dt h em a r k e rg e n e nc a l l l a yt h eg r o u n 小0 r kf o rf i l t r a t i n gr i c em a t e r i a l sw h i c hc o n t a i n i n gt a 玛e tg e n e ，w i t h o u t t h em a r k e rg e n ea n dr e p o ng e n e n o 、抛d a y s ，an e wk i n do fr i c e - s o f t p a n e lr i c ei ss p f i n gu pi nt h ew o r l d t h e m o s to b v i o u sc h a r a c t e r i s t i co fs o r p a n e lr i c ei st h a tt h ea m y l o s ec o m e n to fr i c ei s l o w u s u a l l yl o w e rt h a nl o ，a n dt h er i c e - e a t i n gq u a l i t yi s 行n e s o m os t u d i e sh a d d e m o n s t r a t e dt h a ti n t r o d u c i n ga n t i - h 矗砂g e n em i g h tr e d u c ea m y l o s ec o n t e m si nt h e r i c es e e d sb u ti nm o s to ft h et m n s g e n i cd e s c e n d e n t s ，t h ea m y l o s ec o m e n ti sn o t r e d u c e do b v i o u s l yt h e r e f o r ew ec o n s t m c t e dv e c t o rp 1 3 a w y _ 2w i t ht w o 锄t i - 脱聊 g e n e so nt h eb a s i so fp 1 3 a w y - 1 nw i ul a yt h ef o u n d a t i o nf o rb r e e d i n gas p e c i a l g r a d ec r o pt h a tw i t hl o w e ra m y l o s ec o n t e n t k e y w o r d s ：t r a n s g e n i cp l a m sb i o s a f e t y a n t i 一腑咿g e n e v e c t o rc o n s t r u c t i o n m a r k e r - 疗ec o t r a l l s f o r m a t i o n 一g m 6 口c 耙一甜研- m e d i 砒e d 3 5 sp r o m o t e r s o f t p a n e lr i c ee a t i n gq u a l i t yi m p r o v e m e m 2 舍有础一撕基园表达栽体构建反水稻遗传转化 第一部分：文献综述 植物转基因常用的标记基因 以及安全性转基因技术的研究进展 摘要 在大量转基因植物被推向市场的同时，人们对转基因植物可能存在的风险感 到担扰。培育无抗性标记基因和具有安全选择标记基因的转基因植物目前已成为 植物基因工程研究的热点。本文列举了转基因植物研究中所使用的标记基因，简 要介绍了转基因作物中标记基因所引起的安全性问题，并综述了安全性转基因技 术的研究进展：一是使用生物安全标记基因，如糖类代谢酶基因、激素类代谢酶 基因、耐胁迫酶基因、叶绿体合成中的关键酶基因以及有关氨基酸代谢的基因 二是采用无选择标记基因的转化系统；三是构建能去除选择标记基因的转化系 统，如位点特异性重组系统、同源重组系统、转座子介导的再定位以及共转化系 统。这些安全性转基因技术为加速转基因作物的商业化进程提供了一个良好的前 景。 关键词：基因工程转基因作物安全性选择标记基因 植物转基国常用的捂记基因以反安全性转基因技术的研究进展 文献综述 a d v a n c e so nm a r k e r g e e si nt r a n s g 蛐i cp l a n t s a n ds a f e t yt r a n s g e n i ct e c h n o l o g y a b s t r a c t w i t hl a r g ea m o u n to f t r 锄s g e n i cp l a n t sb e i i 培c o m m e r c i a l i z e d ，p e o p l ef e e lu n e a s y a b o u tt h ep o t e n t i a lr i s k so ft r a n s g e n i c p l a n t s t h eg e n e r a t i o n so fs e l e c t a b l e m a r k e r - f b et r 蛐s g e n i cp l a n ta l l dm m s g e n i cp l a n tt h a tc o n t a i ns a f e t ym a r k e rg e n eh a v e b e e nah o ts p o ti nt h ef i e l do f p l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n g t h ep 印e r b r i e n yi n t r o d u c e s t h em a r k e rg e n e si n t r a n s g e n i cp l a n t sa n dt h es a f e t yi s s u e sw h i c ha r i s e 疗o mt h e m a r k e rg e n ei nt r a n s g e n i cp l a n t s na l s os u m m a r i z e st h er e s e a r c hi m p r o v e m e n to ft h e s a f e t yt r a n s g e n i ct e c h n o l o g yt h ef i r s ti st h eu t i l i z a t i o na n dd e v e l o p m e n to f b i o s a f e p o s “i v e l ys e l e c t i v em a r k e rg e n e s ，m a i n l yr e f e r r e dt ot h ec a r b o h y d r a t e sm e ta _ b o l i s m g e n e s ，t h ea u x i n sm e t a b o l i s mg e n e s ，t h es t r e s s - r e s i s t a n te n z y m a t i cg e n e s ，c h l o r o p l a s t s y m h e s i sa n do t h e rg e n e s t h es e c o n di st h ee s t a b l i s h m e n to fm a r k e r 仔e e t r a n s f o m l a t i o nv e c t o rs y s t e m s ，w h i c ha r ee m c i e n ta n ds i m p l e t h et h i r di st h e e s t a b l i s h m e mo f t r a n s f o m a t i o ns y s t e m sa l l o w i n gm a f k e rg e n e st ob ee l i m i n a t e d 丘o m t h e t r a n s g e n i cp l a n t s ， i n c l u d i n gs i t e s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o n ，h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i 0 1 l ， t r a n s p o s o n m e d i a t e dr e p o s i t i o n i n ga n dc o - t r a n s f 0 肌a t i o nt h e s e s a f 乩yt r 锄s g e n i ct e c h n 0 1 0 9 i e sp r o v i d eag o o dp r o s p e c tf o ra c c e l e r a t i f 培t h e c o m m e r c i a l i z a t i o np r o c e s so f t r a n s g e n i cc r o p s k e y w o r d s ：g e n ee f 培i n e e r i n g t h n s g e n i cp l a n t s b i o s a f 矾y s e l e c t i v em a r k e rg e n e 4 舍有磁一镅哆基园表达栽体构建反水稻遗传转化 自从1 9 8 3 年世界上首例转基因烟草问世以来，植物基因工程取得了飞速发展。 由于转基因农作物可能同时具有高产、优质、抗逆境及抗除草剂等多重优点，全世界 范围内转基因作物的种类、产量都迅速增加。1 9 8 6 年抗虫和抗除草剂的转基因棉花 首次进入田间试验，1 9 9 5 年首例转基因植物产品开始商品化生产，1 9 9 6 年转基因作 物商品化应用开始进入迅猛发展时期( 康洁，2 0 0 4 ) 。自世界上首次种植转基因作物 以来，转基因作物己在全球得到大面积推广。据统计，1 9 9 6 年转基因作物的种植面 积仅为1 7 0 万公顷，2 0 0 5 年种植面积达到了近9 0 0 0 万公顷，十年来增加了近5 0 倍。 基因重组技术在农业上的应用被认为是解决人口剧增所导致的食品资源匮乏的最有 前途的良方。然而，转基因食品在给人们带来巨大的经济效益与社会效益的同时，其 生物安全性也引起了很大的争议( 杨丽琛等，2 0 0 3 ) 。 1 植物基因转化中常用的标记基因 所谓标记基因( m a r k e rg e n e ) 是用来区分目的基因转化细胞和非转化细胞的 一类特殊基因。按功能，可把标记基因分为2 类：一类是担负富集转化细胞作用 的基因，称为选择标记基因( s e l e c t a b l e m a r k e r g e n e ) ；另一类是易于检测表达产 物的基因，称为报告基因( r 印o r t e rg e n e ) ( 陆晓春等，2 0 0 0 ) 。此外，一些基因具 有选择和报告双重功能，如n p t i i ( 新霉素磷酸转移酶) 基因和c a t ( 氯霉素 乙酰转移酶) 基因，有的甚至可以用作目的基因，具有多功能，如除草剂基因。 1 i 选择标记基因 选择标记基因的主要功能是该种基因的产物赋予转化细胞产生一种选择压 力，致使未转化的细胞在施加选择剂的条件下不能生长、发育和分化；而转化细 胞对该选择剂具有抗性，可以继续存活，因而有利于从大量的细胞或组织中筛选 出转化细胞及植株。此方法己成为植物遗传转化一种较为方便、快捷的转基因鉴 定方法( h a r epd e ta l ，2 0 0 2 ) 。 植物基因工程所应用的选择标记基因都具有以下几个特征：( 1 ) 编码一种正 常植物细胞中不存在的产物，例如酶和蛋白质等；( 2 ) 基因较小，易构成嵌合基 因；( 3 ) 选择基因产物赋予了转化细胞对选择介质的抗性或激素非依赖性，因此 植物转基因常用的标记基因以反妥奎性转基园技术的研究连展 文献综述 在选择介质存在下，转化细胞能继续生长，而野生型细胞生长受到抑制，从而使 转化子得以富集；( 4 ) 选择基因本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用； ( 5 ) 容易检测，并能定量分析。 常用的选择标记基因主要有两大类。一类是编码抗生素抗性的基因，这种类 型的选择基因是使抗生素失去活性，解除抗生素对转化细胞在转录和翻译过程中 的抑制作用，使转化细胞得以继续生长；另一类是编码除草剂抗性的基因，这类 选择基因的产物能抵抗除草剂的杀灭作用，使转化子能从野生背景中富集出来。 根据现有报道( 侯学文等，1 9 9 7 ；肖志新等，2 0 0 4 ；董文琦等，2 0 0 4 ；王永飞等， 2 0 0 4 ) ，目前在植物转基因过程中普遍应用的选择标记基因如表1 所示。 表1 目前植物转基因过程中普遍应用的选择标记基因 1 a b l elt h em a r k e r sc u r r e n t l yu s e di nt r 粕s g e n i cp l a n t s 1 2 报告基因 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，它的表达产 物非常容易被鉴定。它有多种功能，第一，它可用于检测重组体的基因在导入受 体细胞后是否能表达；第二，它可作为优化转基因体系或检测转基因植株的重要 的前期指标。报告基因可以在基因工程早期筛选转基因植株，从而减少后期转基 因植株检测的工作量。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：( 1 ) 该 基因己被克隆和全序列已测定；( 2 ) 表达产物在受体细胞中不存在，在被感染的 6 全有硝一镅节基因畚迭栽体构建a 水稻遗传转化 细胞中无相似的内源性表达产物；( 3 ) 其表达产物能进行定量测定。因此，在对 转基因作物进行报告基因检测时，不但可以针对d n a 及其表达蛋白检测，还可 以利用酶法分析，组织化学定位方法等有效地检测出重组细胞或组织。 1 2 1 抗生素转化酶基因 这类报告基因将底物抗生素经过乙酰化或磷酸化反应，并对底物进行了放射 性标记，然后将反应产物经过薄层层析，检测产物放射性，便可确定转化与否。 新霉素磷酸转移酶( n p ti i ) 、氯霉素乙酰转移酶( c a t ) 、p p t 乙酰转移酶( p a t ) 是常用的3 种抗性酶，它们可以对底物进行修饰，从而使相应的抗生素失去对植 物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培 养基上正常生长。其中，n p t i i 在大多数植物体中都有很强的表达能力，同时也 适用于酶法分析，检测卜m t i i 酶活性所需要的材料少，易进行早期检测( j e r z yp ，e t a 1 ，1 9 8 4 ) 。c a t 基因的表达能力不如n p ti i 基因的强，但它适宜用于对基因产 物的定性和定量分析。c a t 基因作为报告基因已在番茄、烟草等转基因作物上 应用( 陈丹等，1 9 9 0 ) 。 1 2 2 生物碱合成酶基因 这类报告基因都是合成农杆碱的特异酶类，检测时，加入相应的前体，利用 其酶活性，将其催化成对应的农杆碱，然后在标准品对照下，走纸层析，经一定 的呈色反应，即可判断出该植物是否被转化。胭脂碱合成酶基因( 加s ) 和章鱼 碱合成酶基因( d ) 广泛存在于土壤农杆菌t i 质粒的t d n a 上，类似于真核 基因的启动予和加尾信号( d e b l a e r er e ta l ，1 9 8 5 ) 。对t i 质粒进行改造，用相 应的农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植 物根茎叶中均能表达，不受发育调控。n o s 和o c s 的催化产物容易发生明显的 颜色反应，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光 即可，因此被广泛用于转化体的检测( j e r z yp e ta l ，1 9 8 4 ) 。梁小友等( 1 9 9 4 ) 利用纸电泳菲醌染色检测转基因番茄，在4 株转化番茄中有3 株有明显的荧光斑 点，间接证明目的基因已插入受体细胞的染色体中。 1 2 3 产物具有光学性质的酶基因 利用带有光活性基团的前体作为底物，在这类报告酶的作用下，释放出光学 活性物质，经过比色、荧光检测即可定性、定量地指出报告酶的有无及其活力。 7 植物转基园幸用的标记基因以及安奎性转基因技术的研究进展 文献像述 这类报告酶是比较方便且常用的报告基因。 1 2 3 1b 葡萄糖醛酸糖苷酶( b g l u c u r o n d a s e ，g u s ) 基因 b 葡萄糖醛酸糖苷酶作用的底物是无色的x 一葡萄糖苷酸( x g l u c u r o n i d e ， x g l u c ) 。当表达b 一葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因细胞，在一定条件下与x 唱l u c 底 物起作用，会发生蓝色沉淀，可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点； 加入4 甲基伞形酮基葡萄糖酸苷时生成4 甲基伞形酮，会发荧光，可以用荧光 光谱法测定，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定。g 淞基因最大的优点是该方 法检测所需材料少，而且一旦植物再生后即可进行，并且可研究外源基因表达的 具体细胞和组织部位，这是许多报告基因所不能及的。但有一些植物在胚胎状态 时，能产生内源g u s 活性，检测时要注意设定严格的阴性对照。如甜菜和小麦， 就有较高的g u s 内源表达，但外源表达的g u s 水平高出其2 0 5 0 倍以上，故以 此仍可以判断转化是否成功。此外，还发现随着组织的衰老，g u s 基因的表达 量会逐渐减少，这种现象在黄瓜、甜瓜、烟草、水稻中存在( s o d ，un e ta l ，1 9 9 6 ； d o n gjz ，e ta 1 ，1 9 9 1 ；b r y a mj ，e ta 1 ，1 9 9 2 ；s u l l i v a n nj ，1 9 9 3 ) 。因此，在检测 g u s 活性时，要注意取材的发育时期和取材部分。 1 2 3 2 荧光素酶基因 荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类( d ew e tj r e ta l ，1 9 8 7 ) 。萤火虫荧光素酶( 张菊清等，2 0 0 1 ) 是1 9 8 5 年从北美萤火虫和 叩头虫c d n a 文库中克隆出来的。该酶的分子质量为6 0 6 4 k d 多肽链，在m g ”、 a t p 、0 2 存在时，催化d 荧光素( d l u c i f e r i n ) 氧化脱羧，发出荧光( 凡= 5 5 0 一5 8 0 n m ) 。 细菌荧光素酶是含a 、b 两个多肽亚基的加单氧酶，它催化长链脂肪醛、f m h 2 、 0 2 的氧化反应，发出绿蓝光( = 4 9 0 n m ) 。荧光素酶基因最大特点是不损害植物， 即在整体植物或离体器官内，基因产物都可测定。荧光索酶催化的发光反应能用 生物发光检测仪器进行灵敏、快速检测，而且没有背景。 1 2 4 自身具有光学活性的蛋白基因 绿色荧光蛋白基因( 劝，：g r e e nn u o r e s c e n tp m t e i n ) 是来源于维多利亚水母 ( 一p g “o m 讹肋恸) 的一种由2 3 8 个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量2 7 k d 。 它区别于其它报告基因的优点是没有种属依赖性，无需额外添加任何底物、酶、 辅助因子等物质，只需暴露于3 9 5 n m 的远紫外光或4 9 0 n m 的蓝光下便可受激而 舍有张一翮嗲基园表迭栽体构建反水稻遗传转化 发出绿色荧光( 5 0 8 n m ) ( c h a l f i em ty e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。g f p 的荧光是由s e r 6 5 、脱 氢t y r 6 6 、g 1 y 6 7 自身环化和氧化而产生的发色团发出的。若采用3 9 5 n m 的远紫外 光激发，g f p 产生的荧光强而短促；而采用4 9 0 n m 的蓝光激发，g f p 产生的荧 光则弱但较稳定。如果把绿色荧光蛋白基因和目的基因一起导入植物细胞，用专 门仪器检测( 如f a c s ) ，就能分离转化细胞和非转化细胞。自从n i e d z 等( 1 9 9 5 ) 首先在甜橙原生质体表达g f p 以来，g f p 已在多种单子叶植物和双子叶植物中 成功表达。贾洪革等( 2 0 0 4 ) 利用绿色荧光蛋白来监测转基因烟草中选择标记基 因的消除。c h e n 等( 2 0 0 5 ) 把g 】叩与选择标记基因构建在同一个t - d n a 结构 域上，并在转基因烟草中验证了这一系统的可行性。在转化过程中，g 】即可以作 为辅助筛选标记提高遗传转化的效率；在共转化植株的自交分离后代中，由于 g f p 基因和选择标记基因位于同一t - d n a 结构域上，二者在转基因后代植株中 连锁遗传，因此，通过简单检测g f p 的表达就能初步剔除含有选择标记基因的 后代植株。 2 标记基因在转基因植物中可能存在的危害及不良影响 到目前为止，大多数筛选标记基因在转化后仍然存在于转基因植物中，因此 目前的筛选方法还有一些不足： 2 1 安全问题 转基因植物标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性两个方面。 ( 1 ) 环境安全性：第一，编码抗生素或除草剂的标记基因可能将转基因植物或 通过花粉传布、种子扩散等转基因逃逸渠道使近缘野生种转变成“超级杂草”， 破坏自然生态环境，打破原有生物种群动态平衡的潜在危害( 吴志平等，1 9 9 9 ) 。 第二，转基因产物进入土壤后对土壤生物多样性的影响( w e iw ，1 9 9 8 ) 。第三， 带有标记基因的转基因农作物大面积栽培，有可能使标记基因通过基因漂移的方 式转移到病菌、害虫或杂草的基因组中，使之对农药、抗生素或除草剂产生抗性， 对生态效益产生不良影响( 王忠华等，2 0 0 1 ) 。尽管目前并没有证据证明其危害 性，但公众对安全性的关注大大推迟了转基因作物的商品化和市场运作。 ( 2 ) 健康安全性：在健康领域，人们担心转基因食品的标记基因及其产物可能 对人或动物健康有害，使用时可能是有毒的或过敏的。同时，人们也担心抗生素 植物转基园常用的标记基园以反安奎性转基因技术萌研究琏展 文献榨建 抗性基因有可能从摄入的转基因食物转移到人的消化道细菌中，从而产生具有抗 生素抗性的新菌株，降低或丧失抗生素在临床治疗中的有效性( k o h l ia e t a 1 ， 1 9 9 9 ；y b d e rji ，e ta l ，1 9 9 4 ) 。 2 2 对转化细胞再生的影响 当作物细胞被转化后，需要从非转化细胞中鉴别并分离出转化细胞。筛选标 记基因同目的基因共同转化，然后将转化后的细胞培养在含有抗生素或除草剂的 培养基上，转化细胞能够存活并生长，而非转化细胞不能生长而最终死亡。非转 化细胞在逐渐凋亡过程中会分泌毒素或生长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的 运输，从而会影响转化细胞的增值及分化( h a l d m pa ，e ta l ，1 9 9 8 a ) 。 2 3 对多重转化的影响 目前，大多数转基因作物只是改变了单一的性状，而导入多个基因、改良作 物的复杂性状己成为育种学家们的研究目标。当一个转基因作物品种育成以后， 随着生产环境和生产目标的不断变化以及各种重要功能新基因的发现，通过重复 转化将新的外源目的基因导入受体植物中，集合高产、优质、抗虫及抗病等多种 性状，是培育作物新品种的一种良策。如今，通过对单个外源基因的转基因植株 杂交或再转化，可以获得具有多个优良性状的转基因植株，但是植株中筛选标记 基因的拷贝数也随之增加，多个同源基因的堆积会大大增加基因沉默的可能性 ( m a t z k e a j m ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。而目前转基因技术中适用的标记基因是有限的，因 而转基因植株中标记基因的存在往往会使多基因转化的目标难以实现。此外，植 物基因工程研究中可供利用的启动子同样为数甚少，在许多转化系统中选择标记 基因的启动子往往与目的基因的启动子是一样的。因此，选择标记基因结构的存 在可能诱导同源依赖的基因沉默，导致转基因遗传改良的失败。 虽然有的抗生素抗性基因如印f 口己通过安全性评价，但还是不能彻底消除 人们对转基因植物的担忧，从而影响了大众对转基因植物的接受( p u c h t ah ， 2 0 0 3 ) 。针对传统标记基因存在的弊端，现代育种学家发展了一些新的手段来克 服这些问题，其中包括采用更加安全的标记基因的方法，采用没有标记基因的直 接转化的方法和从转化植物中剔除这些标记基因的方法等，所有这些标记基因应 用的新思路和新技术都对植物基因工程和遗传转化起到了巨大的推动作用。 1 0 舍有“甜彩哮基园表迭栽休构建反水稻遗传转化 3 提高标记基因安全性的策略 3 1 生物安全标记基因的使用 提高标记基因的安全性最为有效的方法就是利用无争议的生物安全标记基 因。安全性标记基因是指对生态环境和人体健康都十分安全的标记基因。安全性 标记基因的表达产物不会增强人、动物或微生物的抗药性，即使发生基因逃逸也 不会增加野生近缘种的竞争力或减少生物多样性。使用安全标记基因作选择标记 的转化系统与传统的转化系统不同，它不是将非转化细胞杀死，而是使转化细胞 处于某个有利的代谢或发育条件下，从而筛选出转化植株。这一选择系统的主要 优点在于选择剂无毒副作用，而且在大多数情况下有利于转化植株的再生，从而 提高转化率。因此，寻找安全标记基因用于植物的遗传转化是基因工程的必然趋 势。 许多学者已在安全标记基因的探索中取得了一些进展，他们根据植物细胞对 不同糖类的分解代谢能力、对细胞造成胁迫环境的酶类基因等开发出了一些安全 标记基因，已经报道的有糖类代谢酶、激素类代谢酶、耐胁迫酶基因、叶绿体合 成中的关键酶基因、有关氨基酸代谢的基因和对转化细胞或组织进行实时监控的 绿色荧光蛋白基因等。 3 1 1 糖类代谢酶基因 离体培养的细胞不能进行光合作用，必须在培养基中添加一定浓度的碳源 ( 如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等) 后细胞才能进行正常的生长分化。近几年根据植 物细胞对不同糖类碳源的分解代谢能力，所发展的利用糖类作为筛选剂的筛选系 统，在安全标记基因方面显示出了巨大的应用潜力。目前己试用于植物转化的此 类标记基因有木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，x y l ) 基因( 巧组) 、6 磷酸甘露糖 异构酶( 6 - p h o s p h o m a n n o s ei s o m e m s e ，p m i ) 基因( p m j ) 和核糖醇操纵子( m i t o l o p e r o n ) 三种。 3 1 1 1 木糖异构酶基因( 捌阴) 砂馏基因来源于红色链霉菌( 砀8 硎。册粥加6 耙一堋批门竹“伽嘲p 门口j ) ， 该基因编码的木糖异构酶能催化d 木糖与d 一木酮糖的互变异构。在以d 木糖为 主要碳源的选择培养基上，整合有外源移删基因的转化细胞因能利用d 木糖作 为碳源而获得优势生长，非转化细胞因碳源供应不足而使其生长受到抑制，以此 植物转基因带用的标记基因以反安全性转基因技术的研究进展 文献绦逑 可区分转化细胞和非转化细胞( e i i l ec ，e ta l ，1 9 9 5 ) 。 h a l d m p 等( 1 9 9 8 b ) 将木糖异构酶基因( 砂删) 分别转到马铃薯、烟草和西 红柿愈伤中，然后将愈伤组织置于含有木糖的培养基上进行筛选，得到了能够在 该培养基上正常生长的转基因植株。实验证明，利用木糖异构酶基因作为选择标 记，具有更高的转化效率，比倒飚择系统高1 0 倍左右。 3 1 1 26 磷酸甘露糖异构酶基因( 舢哂) 磷酸甘露糖异构酶基因( 口m f ) 作标记基因，d 甘露糖作为筛选剂的选择机 理为：口珊f 编码6 磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化6 一磷酸甘露糖转变为6 磷酸 果糖。非转化细胞在含甘露糖的培养基上，由于植物内源己糖激酶催化甘露糖磷 酸化为6 一磷酸甘露糖，消耗a t p ，而它又不能利用6 磷酸甘露糖，从而造成6 磷酸甘露糖积累并大量消耗a t p ，长期处于饥饿状态，生长处于停滞状况；只有 整合了外源口m f 基因的转化细胞才能继续代谢6 磷酸甘露糖，避免了6 磷酸甘 露糖的大量积累并产生a t p ，为细胞正常生长提供能量。因此在含有甘露糖的培 养基上只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞将被淘汰( w e i s s e fp ，1 9 9 6 ) 。 目前来源于大肠杆菌的p 研f 基因已被广泛应用于多种作物的遗传转化。 j o e r s b o 等( 1 9 9 8 ) 在甜菜的遗传转化中用较低浓度的甘露糖得到高达3 0 的转 化率，比用卡那霉素高l o 倍左右，而且8 0 9 0 的绿芽都携带目的基因。n e g r 嘣。 等( 2 0 0 0 ) 利用该选择系统通过农杆菌介导转化玉米幼胚时，用甘露糖筛选，获 得的再生植株中标记基因p 聊j 的转化率是3 0 ，且能按孟德尔方式稳定遗传给后 代。p a o i a 等( 2 0 0 1 ) 利用p 埘f 基因作选择标记，暑w 作报告基因转化水稻幼胚时， 其转化率为4 l ，其中8 5 的植株为s 阳性，就标记基因而言，p 加f 基因要比 抗性基因印f 口转化率高一倍左右。岳建雄等( 2 0 0 5 ) 以p m f 基因作为筛选标记 基因，以甘露糖作为筛选剂，通过农杆菌介导法将劝，基因导入棉花细胞也获得 了再生植株。 3 1 1 3 核糖醇操纵子( 州) 核糖醇是自然界中广泛存在的五碳醇之一，一般生物细胞不能利用它作为碳 源，而大肠杆菌c 菌株却能在以核糖醇为碳源的培养基上生长。这是因为c 菌 株中有两个紧密串联的操纵子，即口玎和，f ，。大肠杆菌b 菌株和k - 1 2 菌株是生 物工程中最常用的菌株，但由于缺少这两个操纵子，而不能分解代谢核糖醇。 含有础一镅嗲基园表迭栽体构建反水稻遗传转化 r e i n e r ( 1 9 7 5 ) 发现，当把口盯和州从c 菌株分别转到b 和k 一1 2 菌株中，两菌 株都能在以核糖醇为碳源的培养基上正常生长。l a f a y e t t e 等( 2 0 0 1 ) 克隆了一 个c 胁j r 片段，该片段含有埘操纵子中的激酶、脱氢酶和转运蛋白三个组成部 分。然后用该片段替换掉p b l u s c r i p t 和p m b c a 两载体中的氨苄青霉素抗性基因， 构建成p b l u s c r i p t r 和p m e c a _ r 。最后用这两种质粒分别转化大肠杆菌k _ 1 2 菌 株d h l o b ，转化菌株能够在以核糖醇为碳源的培养基上生长。因此，作为一种 非抗生素选择标记，州操纵子完全可以替代6 肠基因应用于植物遗传转化中。 3 1 2 激素类代谢酶基因 农杆菌的激素代谢途径中编码酶的基因也己成功用于转基因植物的筛选。与 激素代谢途径有关的基因主要包括异戊稀基转移酶( i s o p e m e n y lt r a n s f e r a s eg 蚰e ， m t ) 基因( 枷) 和吲哚3 一乙酰胺水解酶( i n d o l e - 3 - a c e t a m i d e h y d m i y s e ，i a a h ) 基因( z 砌) 。 3 1 2 1 异戊稀基转移酶( 枷) 柳基因是一种致癌基因，位于根癌农杆菌的t i 质粒上，编码戊稀基转移酶， 参与i a a 的合成。这种酶在一磷酸腺苷( 址o ) 的存在下催化异戊稀基焦磷酸 的缩合，产生异戊稀腺苷酸一细胞分裂素的前体。视基因的过量表达能够提高 细胞分裂素的水平，可以促进器官发生，因此转化的细胞在未加i a a 的培养基 上能继续生长，可形成不定芽。相反，未转化的细胞在不含i a a 的培养基中不 能正常生长和分化而死亡。使用农杆菌中的致癌基因作为筛选标记基因的优点之 一，是转基因的组织可通过形态学的变化来加以鉴别，而不需要使用抗生素或除 草剂。但是获得的转化植株由于激素代谢途径相关酶基因超量表达使得植株内源 细胞分裂素水平上升，丧失顶端优势，生长受阻。这就要求将这些标记基因剔除 或降低其活性。e b i n u m a 等( 1 9 9 7 ) 利用农杆菌介导法将花椰菜花叶病毒启动子 ( c 巩；嚣) 驱动的枷基因转化烟草。转化植株生长受阻，但也出现较少的正 常侧芽，其中由于枷基因插入转座元件a c 之间，a c 的转座活性将功f 基因转 座。k u n k e l 等( 1 9 9 9 ) 利用地塞米松( d e x a m e t h a s o n e ) 诱导表达的启动子驱动 砂基因，转化莴苣和烟草，得到了无安全隐患的转基因植株。利用位点特异性 重组酶和相应识别序列切除标记基因的效率比转座子高的特点，s u g i t a 等( 1 9 9 9 ) 将弘置于r s 之间，转化后，利用位点特异性重组而将加f 切除。由于采用了3 5 s 植物转基园霈用的标记基园以及安全性转基因技术的研究进展 文献综述 启动子表达r 重组酶，6 7 的无标记转化植株中转基因拷贝数多于3 。s u g “a 等 ( 2 0 0 0 ) 后来进一步采用了r 与化学诱导表达的启动子g ，二上r - 2 7 的融合表达系 统取代3 5 s 启动子，以柳为选择标记基因转化烟草，获得了无标记基因的转基 因烟草，效率高达1 4 ，并且转化当代就获得了单拷贝的无标记转化植株。e n d o 等