生殖毒性研究ppt课件

第十八章第十八章 生殖毒性研究生殖毒性研究 1 年份 事件作者 1932 1935 1948 1950 1956 1963 1966 1971 维生素A缺乏可使猴胚胎畸形 X射线照射使大鼠胚胎发生各种畸形 氮芥导致大鼠胚胎畸形 可的松致小鼠胚胎畸形 反应停（Thalidomide）事件 美国药物安全委员会 美国FDA 人用药生殖安全评价准则 WHO规定新药应有生殖毒性研究 Hale Gob Harriu Baxter 2 先天愚型海豹肢畸形 3 生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是药物非临床安全性评价的重要内容， 它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研 究有着密切的联系，是药物进入临床研究及上市 的重要环节。 生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围 、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的 用药风险方面发挥重要作用。 4 分期研究内容检测方法 交配前到怀 孕 成年雄性/雌性动物的生殖功能；配子的 发育和成熟；交配行为及生育力 一般生殖毒 性试验 怀孕到着床成年雄性/雌性动物的生殖功能；着床前 的发育和着床 着床到硬腭 闭合 成年雄性/雌性动物的生殖功能；胚胎发 和大部分器官形成 致畸试验 硬腭闭合到 怀孕末期 成年雌性动物的生殖功能；胚胎生长发 育以及器官发育和生长 出生到断奶成年雌性动物的生殖功能；婴儿在宫外 生活的适应性；断奶前的发育和生长 围产期试验 断奶到性成 熟 断奶前的发育和生长；独立生活的能力 ；完全达到性成熟 避孕药、性激素、性功能障碍药、促精子生成药、致突变试验 阳性或有毒作用的新药，必须进行生殖毒性试验。 5 生殖是机体繁衍种族的生理过程，包括生殖细胞的发育 形成、交配、受精、植入、胚胎形成和发育、分娩和哺乳 等过程。每一个环节均可能是化学物质毒性作用的靶部位 ，机体接触化学物质后干扰了其生理过程，使生殖过程的 功能出现缺陷和损害，此即化学物质的生殖毒性生殖毒性。 生殖毒性有两个特点生殖毒性有两个特点：（1）对化学物质的毒性作用 敏感，一定剂量下，其他系统尚未出现损害之前，生殖过 程中的某个环节或功能已经出现障碍；（2）化学物质毒性 作用对其损害更为深远，不仅表现在接触化学物的机体本 身，还可影响后代。 6 畸胎学：畸胎学：从胚胎学和病理学发展出来的一个分支学科 ，是研究胚胎发育时期，由各种内外因子引起结构和 功能异常的先天性畸形的科学。 致畸性（致畸性（teratogenicityteratogenicity）：）：药物接触胚胎发生期后引起 永久性结构或功能异常的性质。 胚胎毒性（胚胎毒性（embryo toxicityembryo toxicity）：）：某些药物在一定剂量仅 对胚胎或胎儿有毒性作用而对母体没有毒性作用，此作用 被称为胚胎毒性。胚胎毒性表现为胚胎死亡、胚胎生长迟 缓、畸形和功能不全。 母体毒性（母体毒性（embryo toxicityembryo toxicity ）：）：指药物引起怀孕动物的毒效 应，如体重不增或减轻等，最严重的是死亡。 7 畸形（畸形（malformationsmalformations）：）：永久性结构异常或功能异常的 胎儿和新生儿。通常不包括显微镜下细微结构的异常, 生 化代谢性缺陷。单纯功能异常(如精神缺陷、智力缺陷), 也不包括分娩过程中各种因素造成的缺陷。 致畸指数（致畸指数（teratogeny indexteratogeny index）：）：为一种药物对母体的半数 致死量与最小致畸量的比值，是表示一种化学物质的致畸 强度指标。建议致畸指数在10以下定为不致畸，10 100为 致畸，100以上为强致畸。 出生缺陷出生缺陷(birth defect)(birth defect)：指任何解剖学的和功能的异 常。既包括形态结构的异常(大体的和细微的)，也包括 功能、代谢、行为的异常。 8 目的目的 一般生殖毒性试验（reproductive toxicity test） 是研究药物对整个生殖过程的影响。包括生殖细胞 （精子、卵细胞）的发生，卵细胞受精、着床胚胎 形成，胚胎发育阶段的影响并作出评价。 动物及分组动物及分组 至少一种动物，一般为大鼠或小鼠，每组雄性 动物10只，雌性动物至少20只。 9 给药剂量及途径给药剂量及途径 给药组设高、中、低三个剂量；高剂量应能产生 轻微毒性反应，如体重增长缓慢等，但不应出现严 重中毒或死亡。 给药途径应尽量接近临床。 给药时间给药时间 雄性动物交配前给药60 80天，雌性动物交配 连续给药14天。交配后继续给药至大多数器官发生 期（大鼠/小鼠为孕后13天）。 10 检查检查 1. 雄性与雌性动物同笼交配后，每日检查小鼠阴道中有无 阴栓，大鼠则检查精子，以检查到阴栓或精子的当日作 为妊娠第0天。 2. 雌鼠于妊娠第13天解剖观察，以确定妊娠、胎儿的吸收 和死亡情况，并记录母鼠的一般状况、体重变化和胎盘 重量，以确定子宫内的活胎数，对活胎进行性别鉴定、 体重和身长的测量以及外表和内脏器官的形态学观察， 对骨骼进行茜红素染色后进行检查，必要时进行组织学 和组织化学的详细检查。 11 检查检查 3. 大鼠于孕期第20天处死（小鼠18天）。剖腹取 出子宫及卵巢，辨认和记录活胎数，早死胎数 、晚死胎数、吸收胎数和黄体数，对活胎仔应 辨别性别、称重，测量身长及尾长，仔细检查 活胎仔的外观有无畸形，将每只母鼠的2/3活 胎仔剥去皮肤和内脏，经脱水透吸及茜红素染 色后，检查骨骼畸形，将1/3活胎仔浸入Bouin 氏溶液中固定，供检查内脏畸形。 12 结果判定结果判定 100 %畸胎率% = 畸胎总数 活胎仔总数 活胎仔平均畸形数 = 畸形总数 活胎仔总数 100 %母体畸胎出现率% = 出现畸胎母体数 妊娠母体总数 * * 畸胎及畸形的计算方法畸胎及畸形的计算方法 13 目的、原理目的、原理 凡受试物能引起生殖机能障碍，干扰配子的形成或使生 殖细胞受损，其结果除可影响受精卵或孕卵的着床而导致 不孕外，尚可影响胚胎的发生及胎仔的发育，如胚胎死亡 导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。如果对母体 造成不良影响，出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常，亦可 出现胎仔出生后发育异常。 本试验检测药物对整个生殖过程的毒性作用，通过繁殖 试验可以了解药物对试验动物的性腺功能、交配能力、受 孕能力、妊娠过程、分娩、哺乳及对后代生长发育的影响 。 一般倾向于二代繁殖试验。 14 动物及分组动物及分组 大鼠，至少设三个剂量级和一个对照组。每组 动物应至少能产仔20窝；F0代有生育能力的雄鼠至 少10只，以后各代每组也应至少有10只雄鼠。 给药剂量给药剂量 高、中、低三个剂量；高剂量应有毒性作用， 但不能引起10%以上动物死亡，且超过人体预期接 触水平。低剂量应不产生可观察到的有害作用。 15 方法方法 以人体可能接触的方式染毒。 仅对F0及F1代动物染毒。 F0代动物自离乳起（6 w之前）开始染毒，直到F1代 离乳；F1代动物离乳（约30 d）后，部分动物（用来继续 繁殖的动物）每天染毒，直到F2代离乳后30天。 F0代给药至少100天后，开始交配，产生F1代。 F1代给药至少数120天后，开始交配，产生F2代。 16 17 观察指标观察指标 包括动物一般状态、体重、进食量及死亡情况； 着重观察受孕率、妊娠率、出生存活率、产仔总数 及平均仔重等与生殖机能有关指标。 计算下述生殖指数： 100 %1. 生育力指数： 受孕率% = 妊娠雌鼠数 交配雌鼠数 100 %2. 受孕指数： 正常妊娠率% = 活产雌鼠数 妊娠雌鼠数 100 %3. 存活力指数：出生存活率% = 生后4 d 存活仔 数出生时活仔数 100 % 4. 哺育指数： 哺育存活率% = 生后21 d 存活仔数 出生后4 d 存活数 18 原理原理 母体在孕期受到可通过胎盘屏障的药物作用,影响 胚胎的器官发育,导致结构和机能的缺陷,出现胎仔畸 形。因此在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入 细胞及器官分化期时，可检出该物质对胎仔的致畸 作用。 致畸试验（teratogenic test）为鉴定动物致畸物 的标准方法。不仅能检测到药物的致畸性，也可得 到有关药物致胚胎死亡及生长迟缓的资料。 19 动物动物 要求选用对药物敏感性高而自发畸形率低的动物 ，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用2种动物， 一种为啮齿类，另一种要求非啮齿类（狗和猴）。 动物受孕及检查方法动物受孕及检查方法 未交配过的雌鼠，鼠龄3 m以下，体重200 - 250 g，做阴道 分泌物涂片检查，若发现白色分泌物较多，镜下发现有核上皮 细胞，则提示大鼠处于动情前期。此时，将其与雄鼠按21 或 32同笼过夜，次日检查是否受孕。 检查是否受孕。（1）检查阴栓：阴栓是雄鼠精囊与凝固腺 分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒。大鼠阴 栓易脱落，小鼠阴栓不易脱落。（2）阴道涂片检查精子。 阴栓或精子检出当日记为孕0天，次日为孕第1天。 20 剂量分组剂量分组 分组分组 分高、中、低三个剂量组；阴性对照组；阳性对 照组。 剂量确定剂量确定 （1）高剂量应有母体毒性反应，或为最大给药 量；低剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。 （2） 以 LD50 的 1/3 1/5 为高剂量组；以 LD50 的 1/30 1/100 为低剂量。 （3） 以人实际接触量做为低剂量组，并以其倍 数（10倍）做为高剂量。 每组受孕动物数每组受孕动物数 大鼠、小鼠 15 20 只；兔 8 10 只；狗和猴 3 4 只。 21 给药方式及时间给药方式及时间 给药途径根据药物的性质及人类可能的接触方式定 ，多为灌胃和腹腔注射。 给药时间选在胚胎对致畸物的易感期（器官形成期 ）。 22 观察指标观察指标 1 每只实验动物在试验期间的受精日期、给 药日期和剂量、体重等基本指标。 2 对母体的观察：每天检查有无中毒症状， 对有流产或早产征兆者（阴道出血）及时处死检 查。 3 对胎仔的观察 A 活仔外形的检查 B 胎仔内脏检查 C 对胎仔骨骼检查 23 部位 畸 形 头颅 鼻 眼 耳 腭 颌和唇 肢 趾 脊柱 腹部 尾 肛门 脑突出，露脑，颅脊柱裂，单纯性脑膜膨出 单鼻孔，鼻孔扩张 小眼，无眼，开眼，眼异位 无耳，小耳，耳异位 腭裂 颌小，无颌，无口，唇裂 短肢，畸形足 多趾，少趾，缺趾，并趾 脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱侧凸 脐疝 短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，无尾 肛门闭锁 常见畸形及部位常见畸形及部位（外观畸形） 24 部位 畸 形 颅顶骨 枕骨 颈椎骨 胸骨 肋骨 腰椎 四肢骨 盘骨 尾椎骨 缺损，骨化迟缓 缺损，骨化迟缓 缺损，骨化迟缓 缺损，错位，骨化迟缓 多肋，少肋，短肋，分叉肋，波状肋，融合肋 缺失，分裂，变形 多骨，缺失 缺失 缺失，椎弓不连续，融合 常见畸形及部位常见畸形及部位（骨骼畸形）（骨骼畸形） 25 部位 畸 形 头 腭 口腔 眼 心血管 肺 膈 肠 肝 肾 生殖器 膀胱 脑积水，脑室扩大 腭裂 短舌，分叉舌 少眼，小眼，无眼 右位心，室中隔缺损，单房室心，主动脉弓横位 气管食管瘘，肺倒位，少叶 横膈缺损，并引起腹内脏疝或内脏侧位 肠疝 肝异位，少叶 马蹄肾，肾积水，肾积水，肾缺失，肾异位 子宫缺失，睾丸缺失或隐睾，睾丸发育不全（单 侧/双侧），两性畸形 缺失 常见畸形及部位（内脏畸形 ） 26 结果评定结果评定 1 对母体动物评定： 100 % 100 % 母体畸胎出现率（%）= 妊娠母体数 交配率% = 已交配动物数 实验动物数 死亡率% = 死亡动物数 实验动物数 出现畸形胎的母体数 100 % 母体增重= 处死时母体体重 妊娠第6日体重 处死时子宫连胎重 27 结果评定 2 对胎仔评定： 100 吸收胎率（% ）= 早期吸收数 + 中期吸收数 + 晚期吸收数 实验动物数 注意区分畸形数和畸胎数 外观畸形率% = 外观畸形数 检查胎仔数 100 % 骨骼畸形率% = 骨骼畸形数 检查骨骼数 100 100 死胎率（%）= 胎仔总数 死胎数 内脏畸形率% = 内脏畸形数 检查胎仔数 100 % 100活胎率（%）= 胎仔总数 活胎数 28 评定药物致畸作用应注意问题 1. 统计分析；剂量效应关系 2. 实验动物的自发畸形类型和频率 3. 变异 4. 种属差异、品系差异 5. 动物实验结果外推致人类时，须结合人 群流行病学调查 6. 注意人类实际接触量及接触方式与途径 29 30 突变引起胚胎发育异常突变引起胚胎发育异常 细胞死亡和增殖速度减慢细胞死亡和增殖速度减慢 细胞间通讯抑制细胞间通讯抑制 胚胎中间代谢障碍胚胎中间代谢障碍 胚胎组织发育过程不协调胚胎组织发育过程不协调 渗透压不平衡渗透压不平衡 生物合成基质和辅酶的缺乏生物合成基质和辅酶的缺乏 31 遗传因素遗传因素 药物的理化性质药