磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖有丝分裂的影响_毕业设计论文.doc

攀枝花学院本科毕业设计（论文）磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖有丝分裂的影响院（系）： 生物与化学工程学院 年级专业： 2009级生物工程班 二一三年六月攀枝花学院本科毕业设计（论文） 摘要摘 要 本课题为探究磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖有丝分裂的影响。分别由氯化锰和磷酸二氢钾提供锰素与磷素。用一定的锰浓度与不同浓度的磷复合处理蚕豆根尖，然后镜检观察蚕豆根尖细胞染色体畸变情况。 结果表明当用2mmol/l的锰分别与13mmol/l、1.3mmol/l、0.13mmol/l、0.013mmol/l、0.0013mmol/l的磷复合处理根尖并通过三次平行实验后，在该实验条件下蚕豆根尖细胞平均有丝分裂指数呈现先增后减的趋势，在磷浓度为0.13mmol/l时最高达42.6；而平均染色体畸变率呈现先减后增的趋势，磷浓度为0.13mmol/l时最低至33.7。说明在该实验条件下，有丝分裂指数和染色体畸变率与该复合培养液有明显的剂量效应关系。关键词：蚕豆、细胞分裂指数、染色体畸变率、kh2po4、mncl2ii攀枝花学院本科毕业设计（论文） abstractabstractthis paper explores the phosphorus mitogenic in manganese stress effects on mitosis of vicia faba root tip. by mn2cl4h2o and kh2po4 with manganese and phosphorus. manganese concentration with different concentrations of phosphorus compound treatment of vicia faba root tip, and observing the chromosome aberration in root tip cells of vicia faba by microscope. the result shows that, when using the 2mmol/l manganese phosphorus concentration compound treatment with 13mmol/l, 1.3mmol/l, 0.13mmol/l root, 0.013mmol/l, 0.0013mmol/l, obtained by three parallel experiment: under the experimental conditions，the average mitotic index of vicia faba root tip cell increased firstly and then decreased, the phosphorus concentration for 0.13mmol/l 42.6 was highest; while the average chromosome aberration rate showed the trend of decreased firstly and then increased, phosphorus concentration was 0.13mmol/l for a minimum of 33.7%. the result shows that: under the experimental conditions, there is rate-effect relationship between mitotic index and chromosome aberration and the composite medium significantly.keywords:vicia faba, mitotic index, the rate of chromosome aberration, kh2po4, mncl2iii攀枝花学院本科毕业设计（论文） 目录目 录摘 要iabstractii1 绪 论11.1 课题背景11.1.1 引言11.1.2 重金属污染与修复的研究现状与进展11.1.3 锰污染现状21.1.4 锰在植物体内的生理作用以及对其毒害的研究现状41.1.5 磷作为重金属污染修复材料的研究现状与进展51.1.6 蚕豆根尖细胞学实验的研究现状与进展62 实验方案与过程82.1 实验药品与仪器82.2 实验试剂的配制82.3 实验材料82.4 实验方法82.5 实验过程92.5.1 浸种92.5.2 催芽92.5.3 染毒92.5.4 固定92.5.5 解离92.5.6 染色92.5.7 制片92.5.8 镜检计数102.5.9 照相102.6数据统计103 结果与分析123.1 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数与染色体畸变率的影响123.2 蚕豆根尖的细胞染色体畸变的主要形态164 总结与展望184.1磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响184.2 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响184.3 展望18参考文献20附录a：图版22附录b：实验数据25致谢28攀枝花学院本科毕业设计（论文） 绪论1 绪 论1.1 课题背景1.1.1 引言攀枝花是一个以攀钢集团为龙头企业的重工业城市，近年来由于重工业的不断发展虽然带来了可观的经济效益，但是同时也带来了严重的环境污染，而锰、镉、汞等重金属则是造成环境污染最重要的因素之一。而环境中的重金属，特别是锰的含量越来越高，其毒性已引起人们的普遍重视。锰不是植物生长的必需元素，而是一种对植物有积累性危害的污染物质，与其他污染物相比，在环境中的滞留时间较长。重金属锰进入环境后不能被微生物降解，大部分累积于土壤中，在很长一段时间内可以被植物吸收。锰进人植物体后大部分积累在根部，对细胞的毒害作用主要反映在染色体和细胞核的异常变化上。大量的锰可对植物产生毒害作用，它能阻碍植物的生长，降低光合作用，减少蒸腾作用和水分的吸收，还能引起铜的缺乏。研究重金属对植物的伤害是近年来植物生态学领域中一个较有现实意义的课题。重金属污染将导致一定程度的生态风险。生态风险是指一个种群、生态系统和整个景观的正常功能受到外界胁迫，从而在目前和将来减少该系统内部某些要素或导致其本身的健康、生产力、遗传结构、经济价值和美学价值降低的一种可能性。目前已有的几类重金属污染的生态风险评价方法：包括概念模型法、数学模型法、指数法、形态分析法、植物培养法等。根据研究目的与污染特性选择适当的评价方法，可以为土壤生态风险管理提供科学信息。1.1.2 重金属污染与修复的研究现状与进展重金属污染是指重金属对环境造成的污染。当金属元素的相对密度密度大于4.5g/cm3的时候，我们则认为该金属为重金属，比如mn、cu、pb、zn、co、ni、as、cd、ti、v、cr、hg等60余种金属1。由于不同的重金属具有各种不同的性质，以及不同的密度形态2，因此不同的重金属对环境的污染程度是不同的。重金属污染物因为具有毒性大、潜伏期长、来源广泛并且具有能随食物链积累的特点，因此重金属污染是我们应该优先考虑解决的污染问题之一。最近几十年来，随着工业与农业的不断发展带来社会经济迅速发展的同时，大量不同种类的重金属也依靠地表径流、大气沉降、垃圾转移等各种不同的途径进入河流与湖泊，累计到土壤等，分别对生态环境造成了不同程度的毒害。并且由于重金属具有沿着食物链积累的特点，因此低浓度重金属就可以对人体的健康与生态系统造成损害。因此怎样才能有效的减少与缓解重金属的污染、以及重金属对生态环境与生物体的危害，成为了当今环境难题之一3。重金属污染来源广泛，但是最主要的是农业生产与工业生产两个方面。但是随着现在目前城市化的快速发展，也形成了许多特有的污染来源4。目前，在工业大上大都以石油、煤等作为为主要的能源，并且工业生产过程当中广泛的运用了重金属材料，并且环境中重金属污染主要来源为三废中的pb、as、cd、cr等。主要通过以下三个途径来污染环境。最主要是广泛的使用化肥与农药。而农药中则含有大量的重金属，大面积的使用不只是导致农药残留物的积累，同时也引起土壤中大量重金属污染的问题；其次则是运用污水灌溉农田。因为工业化与城市化的快速发展，运用大量的未经过处理或者是处理不合格的城市污水与工业废水来浇灌农田、草地等。虽然带来了一些效益，但是同时也造成了一定的环境污染。再次是运用污泥作为肥料。虽然污泥中的大量营养元素得到了充分的利用，但是其中的重金属也带来了严重的环境问题。其他的污染来源还包括了大气的沉降，以及垃圾的堆放与处理不善等。总之，重金属通过各种各样的方式不断的积累，最终导致严重的环境问题。目前使用的重金属修复技术包括了化学修复、物理修复、微生物修复、热处理法、淋洗络合法、生物修复等。化学修复就是通过加入一些化学材料，利用其与重金属发生沉淀反应等的特点来缓解重金属污染的方法。主要是通过添加化学改良剂来达到修复的目的，目前使用较多的改良剂包括磷酸盐、碳酸钙、沸石、石灰等；物理修复则是通过物理的过程将土壤中的重金属进行分离或者是去除的技术；微生物修复，就是利用土壤中的某些微生物对重金属具有嗜性这一大特点，来固定重金属。目前这方面的研究在国内外均有报道，李培军等人5等人利用菌根来吸收与固定重金属mn、fe、zn、cu已经取得了较好的效果；热处理法就是利用热处理技术将重金属从土壤中解吸处理的一门修复技术，这主要应用于hg的处理；淋洗络合法就是运用淋洗剂将土壤中的固相重金属变为液相，进而达到修复的目的。wasay研究发现edta、dtpa对mn、pb、cr有较好的固定作用6。生物修复则是通过某些特定的微生物或者是植物来吸收或者是转化重金属的一种修复技术。重金属的修复方法是多种多样的，每一种不同的修复方法有不同的优缺点，应该采用互补的方法，综合运用各种方法来达到较好的修复效果。1.1.3 锰污染现状锰是一种化学元素，锰的英文名为manganese。其化学符号是mn，它的原子序数是25，是一种过渡金属。锰广泛的分布在地壳中，而很早就被人们熟知和利用的则是软锰矿，因此锰矿的开采已有很久的历史。锰的应用也是相当广泛的，它一方面给我们人类带来了可观的经济效益，但是同时也给我们带来了不少的问题，尤其在环境污染方面显得尤为突出。在目前随着工业的快速发展，这方面的问题更是严重，急需一个解决问题的办法。人体摄入适量的锰，对身体是有益的，但是如果摄入量过多则会影响到人体健康，造成锰中毒。人体中的锰有多种渠道来源，认真考虑到锰对人体的健康可能造成的危害以及对环境污染的严重性和普遍性，其研究已经成为了一个重点。 锰污染是指锰对环境造成的污染。锰在空气中达到500ug/m3就可能引起锰中毒。锰可以对大气、水体、土壤造成不同程度的污染。攀枝花属长江水系，是其上游的第一城，金沙江水系与雅砻江水系在此交汇。攀枝花以钒钛磁铁矿闻名，经过几十年的快速发展，已经成为了西南地区的一个重要的大型工业城市。在矿山企业快速发展的今天，同时也带来了大量的污染。徐争启7等人针对攀枝花的土壤特性，采集了矿区土壤对cu、pb、zn、co、ni、as、cd、ti、v、cr、hg、mn元素进行了相关分析，认为mn的污染系数仅次于v、cu、cd、ti等金属的污染系数。另外佟洪金等人8还选择了攀枝花地区兰家坝火山矿与尖山坝的排土场、采矿区以及西区西沙的堆渣场与马家田尾矿库作为研究对象，分析了排土场、采矿区与尾矿库的土壤中mn、cu、zn、cd、pb、ni、cr重金属含量，并且对该地区的土壤污染程度做出了评价。周娅9等人对攀枝花土壤的重金属分布特征进行研究，采用了原子吸收分光光度计来测定mn、cu、zn、cd、pb、ni、cr的含量，最后得出了mn的变异系数是最大的为(390)，而仅次于mn的是zn为(90)。而变异系数的大小则反应了其人为干扰因数的大小，越大则说明人为干扰越是强烈。由此则说明攀枝花地区的锰将可能对环境造成的污染问题不容忽视。进几年来随着锰产业的不断发展，带来的污染也是越来越严重。曾经以“锰三角”闻名湖南花垣、贵州松桃、重庆秀山。其电解锰带来的高毒性，高污染以及难以处理和衰变的锰屎就像他的产业一样吸引人的注意。锰屎即我们熟悉的锰渣，锰渣带来的污染并不是只有单一的锰的毒害，通常还伴有大量的铅、铬、锌等重金属物质。在2005年因其产生对三地周边环境的污染问题极度的严重，曾经引起了国家高层领导的高度重视。于2005年8月6日，胡锦涛总书记还在中央政研室第284期简报“锰三角”的剧毒水污染问题亟待解决上做出重要批示“环保总局要深入调查研究，提出治理方案，协调三省市联合行动，共同治理”同年8月26日，胡锦涛总书记再次批示“要明确职责，加强监督，务见实效”。当时锰工业污染问题成为了高层关注的话题。经过几年的努力，目前锰三角的形式已经发生了较大的变化，但是任然不容忽视，应随时保持高度的警惕，既要经济的发展，同时也要环境的保护，二者不可分割。汪明华等人10也对钱塘江的锰污染的形成原因进行过相关的调查，认为造成钱塘江水域锰污染的主要原因为企业污水以及污水处理厂的污水排放。在锰带来的可观经济效益趋势下，不少的锰企业氢酶、异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合成酶等均可以由mn2 + 活化13 14 ，则锰离子与植物的呼吸作用、木质素和氨基酸的合成均有密切关系；锰除了作为一种活化剂参与酶的活化系统中，还作为一种还原剂参加到了酶的氧化还原系统中，因此锰在植物体氧化还原中也有不可替代的作用。叶绿体在光合作用的过程当中，锰可也在快速的发展，与此同时，可能随之带来大量的环境问题。因此我们在追求经济效益的今天，也要与环境和谐发展，携手并进。1.1.4 锰在植物体内的生理作用以及对其毒害的研究现状在植物体维持正常的生命活动方面，锰是一种必不可少的微量元素，因此锰也是植物体的生命元素之一。锰在植物体内维持活化酶的活性、细胞器的正常结构起了重要作用，以及对植物的光合作用也产生很大的影响。因此锰在植物体内必须维持一个正常量，过低则导致低锰胁迫、过高则导致高猛胁迫，都会对植物体产生毒害作用。锰在植物体内参与酶系活动中，其主要作用则是作为一种活化剂，根据统计显示，有36中酶将锰作为活化剂，3种酶将锰作为自身成分11。锰作为酶的一种活化剂，很少有特异性，只有在少数酶活化对于mn离子具有高度的专一性，因此锰通常被其他的二价离子或者是锰离子代替12。锰参与的很多酶触反应过程，主要包括水解反应、还原反应、磷酸化作用与脱羧基作用等，例如糖酵解的过程中己糖酸激酶、羧化酶、烯醇化酶、三羧酸循环中- 酮戊二酸脱以被光激活了的叶绿素氧化还原，成为被光氧化了的mn3 + ，可以使植物体细胞内氧化还原的电位提高，让部分细胞的成分被氧化15 。如果是植物体内的锰过多，则光氧化所产生mn3 + 较多，将会导致细胞的成分氧化过度而出现相应的缺绿症状；锰在植物体的光合作用中也具有重要的生理功能。锰不但直接参与了光合作用的放氧过程，而且也是维持叶绿体结构的重要元素。通常所说的锰对植物体的毒害，则是指高猛胁迫。高锰胁迫通常是显著地降低了植物的生物量形成,最终引起产量的大幅度下降，甚至于绝产。锰毒害的症状通常表现在老叶脉间的区域有褐斑和皱缩，使植物的根部变为褐色，叶缘出现白化的象或者是变为紫色等。植物体中过量的锰还可能导致植物体对其他的元素的吸收，比如镁、铁、钙的吸收，从而影响了植物体的光合作用16； 当植物体内的锰含量过低的时候，则会产生低锰胁迫现象。当植物体缺锰时，细胞壁略增厚并且导致表皮组织间隙皱缩，同时细胞体积会变小，最终使植物体的根系不发达，开花少结果很也少17。由于锰具有维持叶绿体结构的功能，因此当锰缺乏的时候，叶绿体结构则遭到破坏，导致光合作用减弱。当出现低锰胁迫的时候，首先的是表现在嫩叶，但是由于不同的植物又各有差异。目前对锰中毒的植物进行修复的研究较少，报道的则更少，这方面应该引起我们的高度重视。1.1.5 磷作为重金属污染修复材料的研究现状与进展磷在生物圈内广泛分布，地壳含量丰富列前10位。而磷在自然界中主要以磷酸盐的形式存在。广泛存在于动植物组织中，也是人体含量较多的元素之一，稍次于钙排列为第六位。动物体内磷主要集中于骨和牙，同时也分布于全身各组织及体液中，其中一半存在于肌肉组织。它不但构成人体成分，且参与到生命活动中的重要代谢过程，是机体很重要的一种元素，因此磷也被认为是一种重要的生命元素。磷作为植物体的重要的营养元素之一，在进年来越来越受到人们的重视。而磷的供应直接影响农作物的品质和产量。磷作是植物体的一种重要的营养元素。磷本来作为一种植物营养元素，以磷肥的形式广泛的运用于农田，但是随着不断的研究发现，又赋予磷新的作用与意义，即磷可以作为一种重金属污染的修复剂。目前用来修复重金属污染的磷材料主要有磷灰石族矿物、还有无机磷肥、无机磷酸盐与骨粉。包括水溶性磷肥，重过磷酸钙(ca(h2po4)2)、过磷酸钙(caso4和ca(h2po4)2)及磷酸二氢钙(ca(h2po4)2)等；弱酸溶性的磷肥,如钢渣磷肥(ca4p2o9.casio3)与钙镁磷肥(casio3和ca3(po4)2)等18。影响磷材料对重金属修复效果的因素包括以下几个方面：首先是磷材料的类型，磷材料类型的不同其对重金属的修复效果是不一样的，其类型的不同，则磷的含量不同。一般地可溶性磷的含量越高，其对重金属的固定能力越强19；其次则是重金属的浓度与种类也会对修复效果产生影响，磷灰石对溶液中的重金属离子去除率顺序为： hg+ mn2+cu2+zn2+cd2+pb2+20。另外，重金属离子最初的浓度也会对修复的效果产生一定影响，重金属离子的最初浓度越高，其修复效果会越小，二者呈现的一种负相关关系21；还有反应温度也会影响，通常情况下，在水溶液中其反应温度定在3040之间比较恰当，而处理时间在24 h，就可以基本达到平衡，随着时间的增加修复效果也会更好一些22。其他影响因素还包括了ph值、反应时间等。目前在运用于重金属修复土壤方面的修复剂，主要以磷酸盐为主。磷酸盐作为一种修复剂加入到土壤后，并改变不了重金属的总量，而是通过降低重金属在土壤中的有效性或者毒性，促使重金属向残渣转化。尤其是以铅最为明显，根据gao23等人的研究，加入磷酸盐后有效铅的浓度极大的降低了，使其向残渣增加1155。磷酸盐稳定重金属的机理是特别复杂的，其中主要包括磷酸盐对重金属直接吸附、诱导吸附，或者是与磷酸盐发生沉淀反应三个方面。磷酸盐加入土壤后，也可能导致很多的环境问题。由于目前对磷的用量多少为最合适存在很大的分歧。mcgowen24等人认为，当为水溶性的磷p/m=1/15(磷与重金属的摩尔比)，而当为难溶性的磷时p/m=3/5的修复效果是最好的。大多数的学者认为p/m=3/5是最为恰当的，但是也有部分学者认为p/m=4.0时也可以25，如此大的变化幅度，的确让人担忧。磷酸盐的大量施入后，可能会造成磷的淋失、营养富集等环境问题，也该引起重视。未来的研究中可能会更多的注重磷与重金属的作用机理研究。1.1.6 蚕豆根尖细胞学实验的研究现状与进展蚕豆(vicia faba)又称胡豆、佛豆、川豆、倭豆、罗汉豆。蚕豆属于植物界、被子植物门、双子叶植物纲、豆目、豆科、大豆属。一年生或二年生草本。为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物。蚕豆一般认为起源于西南亚和北非。中国的蚕豆，相传为西汉张骞自西域引入。自热带至北纬63地区均有种植。中国以四川最多，四川攀枝花凉山州更是盛产蚕豆。次为云南、贵州、湖南、湖北、江苏、浙江、青海等省。蚕豆株高30180厘米。茎直立，四棱，中空，四角上的维管束较大。羽状复叶。总状花序，花蝶形。荚果，种子扁平，略呈矩圆形或近于球形。蚕豆花期一般是35月。蚕豆为长日照作物。喜温暖湿润气候和ph6.28的粘壤土。蚕豆子粒蛋白质含量约25%28%，含8种必需氨基酸。碳水化合物含量47%60%。可食用，也可制酱、酱油、粉丝、粉皮和作蔬菜。蚕豆是一种广为种植，营养价值很高的经济作物26。蚕豆根尖细胞分裂明显，并且其蚕豆的染色体由六组较大的染色体组成，这些特征使得蚕豆易于在显微镜下观察其细胞分裂情况。蚕豆根尖细胞还是一种很好的细胞遗传学研究材料。放射生物学家们早在1959年就已经用蚕豆的根尖细胞来进行x射线的遗传损伤研究。到了70年代的时候，蚕豆根尖细胞染色体畸变技术就发展得相当成熟。作为一种检测化学品遗传学毒性的方法为人们所知，并且被广泛的应用。在染色体畸变实验的基础上，1982年由 degrassi和rizzoni正式介绍蚕豆的微核实验27。该实验则是用微核出现的颁率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度28。显得更为简单方便。我国则是在1985年发表了首篇用蚕豆根尖微核试验直接检测淡水湖泊水质污染的论文29。而目前建立在染色体畸变实验基础上的微核实验也得到广泛的应用。蚕豆根尖的细胞学试验也被美国的国家环保局肯定了在环境突变性检测中的作用，许多的环境致癌物都用蚕豆根尖细胞做了标准化试验，并且建立了巨大的相关数据库，同时建议在全球范围推广30；其又被国际上推荐作为为检查诱变剂、致癌剂常用遗传学毒理方法之一。染色体形态的畸变是因为染色单体或染色体的断裂造成了染色单体或染色体的丢失，或者是导致了各种重排现象，进而出现了结构异常的染色体。重金属引起染色体形态畸变的原因是多种多样的，其中主要有：1.直接对dna造成损伤；2.通过扰乱dna和有关蛋白质合成，以及干扰rna转录的过程，进而使与染色体移动的相关物质几乎不能合成或者是合成量远远的减少，不能满足正常的活动的需要；3.染色体造成损伤过后不能修复，重接形成新的染色体31。29攀枝花学院本科毕业设计（论文） 攀枝花学院本科毕业设计（论文） 实验方案与过程 2 实验方案与过程2.1 实验药品与仪器药品：无水乙醇ar、冰乙酸ar、盐酸ar、碱性品红ar、甲醛ar、石炭酸ar、次氯酸钠ar、氯化锰ar、磷酸二氢钾ar、山梨醇br。仪器：医用托盘、培养皿、电热恒温培养箱、冰箱、水浴锅、医用脱脂棉、普通光学显微镜、数码显微镜nikon200，数码相机三星es55、常规玻璃仪器。2.2 实验试剂的配制500ml4mmol/lmncl2溶液的配制：首先称取四水氯化锰0.3598g于100ml小烧杯中溶解，在用500ml容量瓶定容，最后转入500ml试剂瓶保存备用。100ml26mmol/lkh2po4溶液的配制：首先称取0.3538gkh2po4溶于100ml小烧杯中。再用100ml容量瓶定容。最后转入试剂瓶保存备用。卡洛氏固定液的配制：取无水乙醇三份与一份冰乙酸混匀即可，现配现用。染液的配制：依次如下配制a液、b液、c液，最后才配成染液。a液，首先称取3g碱性品红溶于100ml70%乙醇配制成a液，可以长期保存；b液，取a液10ml加入90ml的5%的石炭酸水溶液配制成b液，在两周内使用；c液，取b液55ml加入冰乙酸和福尔马林各6ml配制成c液；染液，取c液20ml加入45%的乙酸70ml，再加入山梨醇1.8g则配制成染液，5天后使用着色效果较好。2.3 实验材料攀枝花当年产蚕豆2.4 实验方法在本次实验中设置一个对照组，5个试验组。其中1号为蒸馏水对照组，即只用2mmol/lmncl2溶液。2、3、4、5、6号为分别用13mmol/l、1.3mmol/l、0.13mmol/l、0.013mmol/l、0.0013mmol/l的kh2po4溶液与2mmol/lmncl2溶液共同处理的实验组。每一个不同浓度组镜检5个根尖，而每一个根尖计数1000个的分生区细胞，则一组计数共5000个分生区细胞，共进行三次平行试验。2.5 实验过程 2.5.1 浸种 选取蚕豆颗粒饱满，大小形状几乎一致的蚕豆70粒用0.5%的naclo溶液200ml浸洗10min。然后用蒸馏水冲洗三次，最后于1000ml烧杯中加水500ml在20条件下浸泡2427h待其吸胀。2.5.2 催芽于医用托盘上先铺盖两层医用脱脂棉，然后用150ml蒸馏水使其浸湿，在整齐摆放已吸胀蚕豆于医用脱脂棉上，最后盖上一层医用脱脂棉保湿，并在24培养箱中催芽42h待根长长至1.52cm左右，且24h 后补充水分100ml。2.5.3 染毒将6个100ml洗净的小烧杯编号为1、2、3、4、5、6，在1号烧杯加入20ml蒸馏水，2号烧杯加入20ml26mmol/lkh2po4溶液，用5ml的移液管将已经配制好的kh2po4溶液移取3ml于3号烧杯中稀释10倍；取3号已稀释液3ml于4号烧杯中稀释10倍；取4号稀释液3ml于5号烧杯中稀释10倍；最后取5号稀释液于6号烧杯中稀释10倍，则配制成5个浓度梯度的kh2po4溶液。将3、4、5、6号烧杯中的稀释液分别量取20ml于3、4、5、6号烧杯中，最后在1、2、3、4、5、6号烧杯中分别加入20ml4mmol/l的mncl2溶液配制成所需培养液。将洗净的12个培养皿分成6组，预先垫放两层医用纱布，按下表1.1进行处理分组，每个培养皿整齐摆放5粒蚕豆，并且盖上一层纱布保湿，在24条件下进行染毒24h。2.5.4 固定将已经染毒24h的6组蚕豆根尖截取1cm左右于6个小烧杯中用20ml蒸馏水浸洗5min后，在用蒸馏水冲洗一次后于6个已经编号为1、2、3、4、5、6的塑料杯中进行固定，每个塑料杯加10ml现配固定液，最后盖上盖子在室温条件下固定59h后分，用95%乙醇浸洗10min后转入70%乙醇中保存备用。2.5.5 解离取蚕豆根尖5个先用蒸馏水浸洗两次，每次用10ml蒸馏水浸洗5min，再切去根冠后于100ml小烧杯中加入10ml1mol/l盐酸在60水浴条件下解离34min，至根尖酥软。2.5.6 染色取已经解离根尖先用蒸馏水浸洗两次，每次用10ml蒸馏水浸洗5min，然后取出根尖切取分生区部位0.51mm左右于载玻片上滴35滴染液染色4050min。2.5.7 制片用蒸馏水洗去染液，然后于载玻片上滴上一滴蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，用滤纸在一边吸去蒸馏水后，用大拇指适当用力压盖玻片后，在用中性笔尾轻轻敲片，直到细胞均匀分散为止。表1.1 实验处理以及分组一组二组三组四组五组六组1122334455661号液(ml)2020_2号液(ml)_2020_3号液(ml)_2020_4号液(ml)_2020_5号液(ml)_2020_6号液(ml)20202.5.8 镜检计数将已经制好的装片于显微镜下镜检计数，首先在40倍镜下找到视眼，在100倍镜下找到着色均匀，细胞分散均匀，且细胞多数为正方形或者圆形同时有较多分裂象的视眼。然后转在400倍镜下进行计数。2.5.9 照相本实验拍照分为实验过程拍照和显微拍照。实验过程拍照主要是针对在实验过程中的一些重要实验步骤进行拍照，显微照相主要是对染色体畸变细胞进行照相，准确展示染色体畸变形态。同时还要进行一些实验步骤的录像，记录实验的操作过程。2.6 数据统计计算公式：细胞分裂指数（m）=分裂的细胞总数/总细胞数平均细胞分裂指数（）=（m1+m2+m3）/3染色体的畸变率（z）=染色体畸变的细胞总数/分裂的细胞总数平均染色体的畸变率（）=（z1+z2+z3）/3攀枝花学院本科毕业设计（论文） 第三章 结果与分析 攀枝花学院本科毕业设计（论文） 结果与分析 3 结果与分析3.1 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数与染色体畸变率的影响 表1.2 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数（）与染色体畸变率（）的影响染色体短片细胞数染色体粘连细胞数落后染色体细胞数染色体桥细胞数染色体环细胞数畸变分裂细胞总数正常分裂细胞数镜检细胞总数m3z3一组57411200110102500042.451.9二组64112017882500032.048.6三组48921161101500032.437.7四组383220072180500050.428.6五组482850081109500038.042.6六组38475109170500032.256.5表1.2是反应的第一次平行试验蚕豆根尖有丝分裂指数与染色体畸变的情况。对照一组用蒸馏水做对照，在2mmol/lmncl2溶液的处理下，有丝分裂指数为42.4，而此时的染色体畸变率为51.9，已经有半数的有丝分裂细胞发生了染色体畸变，表明在此浓度下其染毒效果较好，并且比较容易观察比较。由表二可知道在此次平行实验中染色体畸变的主要类型为染色体断片，其次是染色体粘连，再是落后染色体，而染色体染色体桥与染色体环则很少。表1.2也表明了磷对重金属锰的修复效果有明显的剂量效应关系，其中实验四组所用磷的修复浓度为0.13mmol/l，此时为修复效果最好的，其中染色体畸变率已经下降至28.6，同时此时的有丝分裂指数达到了50.4，均高于其他5个组。实验六组所用磷浓度为0.0013mmol/l，此时染色体畸变率高达56.6，比对照组的染色体畸变率还要高，这可能说明了较低浓度的磷不但不能对锰有修复作用，反而增加了蚕豆根尖对重金属锰的吸收。当实验三组用0.013mmol/l的磷修复时，随着磷浓度的增加，其染色体畸变率也下降到42.6。从实验四、五、六组可知在磷浓度0.13mmol/l以后随着磷浓度的升高，其修复效果反而越来越差。表明不是磷浓度越高修复越好。表1.3 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数（）与染色体畸变率（）的影响 染色体短片细胞数染色体粘连细胞数落后染色体细胞数染色体桥细胞数染色体环细胞数畸变分裂细胞总数正常分裂细胞数镜检细胞总数m3z3一组45490009463500031.459.9二组32482108374500031.452.8三组2963620100136500047.242.4四组403211074134500041.635.6五组343321070113500036.638.2六组34392007550500025.060.0表1.3是反应第二次平行实验的蚕豆根尖有丝分裂指数与染色体畸变的具体情况。由表三可知，本次水平实验在磷浓度为1.3mmol/l时细胞分裂指数最高达到47.2，而在磷浓度为0.13mmol/l时细胞分裂指数为41.6，比上一组略低一些。但是任然明显高于对照组，表明了磷的加入对蚕豆根尖的细胞分裂时有促进作用的。本次实验染色体畸变的形态同样主要是染色体断片和染色体粘连，而落后染色体次之。其中对照一组的染色体畸变率达到59.9，而有丝分裂指数为31.4。从实验二组到六组，随着磷浓度的逐渐从13mmol/l、1.3mmol/l、0.13mmol/l、0.013mmol/l、0.0013mmol/l顺次下降的时候，其中染色体畸变率任然呈现一种先减小后增大的趋势，并且也是在磷浓度为0.13mmol/l时，修复作用最强，染色体畸变率减小至35.6。而同样在磷浓度为0.0013mmol/l时，染色体畸变率为60.0，完全不能修复。而染色体畸变率比对照组搞了0.1。 表1.4 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数（）与染色体畸变率（）的影响 染色体短片细胞数染色体粘连细胞数落后染色体细胞数染色体桥细胞数染色体环细胞数畸变分裂细胞总数正常分裂细胞数镜检细胞总数m3z3一组29452318094500034.846.0二组306402096113500041.845.9三组25363006493500031.440.8四组194340066113500035.836.9五组31432007696500034.444.2六组433830084124500041.640.4表1.4是反应第三次平行实验的蚕豆根尖有丝分裂指数与染色体畸变的具体情况。本次实验在磷浓度为13mmol/l、0.0013mmol/l时有丝分裂指数分别为41.8、41.6都明显高于对照组的34.8，而在磷浓度为1.3mmol/l、0.13mmol/l、0.013mmol/l时，其有丝分裂指数与对照组较为接近。但是从总体趋势来分析，磷的加入任然是促进蚕豆根尖有丝分裂的。本次实验从表中数据也可以直接看出，染色体畸变的形态仍然主要以染色体断片、染色体粘连与落后染色体出现，而以染色体粘连更为明显。磷的加入对重金属锰的确有修复效果的。仍然是随磷浓度的递减呈现出一种先减后增的趋势，同样在磷浓度为0.13mmol/l时染色体畸变率最小为36.9 。表1.5 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞平均分裂指数（） 一组二组三组四组五组六组m1 42.432.032.450.438.032.2m2 31.431.447.241.636.625.0m3 34.841.831.435.834.441.6 36.235.137.042.636.332.9表1.5是对前面三次水平实验的整体反应，反应了磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞平均分裂指数的影响 。其中对照一组的平均分裂指数为36.2，实验二至六组分别用13mmol/l、1.3mmol/l、0.13mmol/l、0.013mmol/l、0.0013mmol/l的磷修复后，随着磷浓度的逐渐降低，平均分裂指数从35.1、37.0、42.6、36.3至32.9呈现除了先增后减的趋势，并且在磷浓度为0.13mmol/l是达到最高位42.6。由此则表明磷的加入对细胞分裂确实有影响，而且剂量效应关系特别明显。而且在磷浓度过高或者过低的时候都会抑制细胞的有丝分裂。只是因为磷浓度的不同而影响的程度不同，这可能与磷在蚕豆根尖细胞内的作用机理密切相关。表1.6 磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞平均染色体畸变率（%）一组二组三组四组五组六组z1 %51.948.637.728.642.656.5z2 % 59.952.842.435.638.260.0z3 %46.045.940.836.944.240.4 % 52.649.140.333.741.752.3磷对重金属锰的修复作用同样也是反应的比较明显，如表1.6所示。在对照一组时平均染色体畸变率为52.6，从实验二组至六组，平均染色体的畸变率是随着磷浓度的递减而呈现出由49.1、40.3、33.7、41.7至52.3的先减后增的趋势，并且在磷浓度为0.13mmol/l时减至最低为33.7。由此也反应了磷对重金属锰有一定的修复作用，并且呈现出了明显的剂量效应关系，并且在磷浓度为0.13mmol/l时的修复能力最强。但是修复效果仍然不是特别明显，只能说明磷对锰污染的确有缓解作用。3.2 蚕豆根尖的细胞染色体畸变的主要形态用配置的培养液处理蚕豆的根尖，经过镜检后发现了大量的畸变染色体，其中包括了染色体短片、染色体粘连、落后染色体、染色体环、染色体桥以及非二极分裂等情况。而其中以染色体断片和染色体粘连最为明显。正常有丝分裂前期细胞如图(附录a图一)。染色体断片是指由于染色体断片化产生的染色体断片如图(附录a图二)所示，一个染色体可以进行一处或者两处断裂，更甚者就是发生多处断裂。染色体断片是染色体畸变的主要形式之一。一个细胞内可以有一个染色体发生断片，也可以有两个以上的染色体发生断片的现象。染色体断片后含有着丝粒和不含着丝粒的两种情况，其断裂后的行为是不同的。含有着丝粒时，在核分裂后期断片具有向两极移动的能力，所以往往能在细胞内长期存在，这也是混倍体和非整倍体产生的原因。不含着丝粒的断片通常在核分裂时被排出核外，不久即消失，也是与其它染色体发生融合、易位和插入等的原因之一。消失的染色体断片如果上面存在着生活上的重要基因(群)时，对核分裂后的细胞是致死的。染色体断片少数发生在有丝分裂的后期如图(附录a图五)所示，其中主要为中期断片如图(附录a图六)所示。染色体粘连如图(附录a图八)所示，主要形成的情况有两种：一是在细胞有丝分裂的前期，已经高度螺旋化的染色体不能正常排列到赤道板上。二是在有丝分裂的中期已经排列在赤道板上的染色体，不能正常的移向细胞的两极形成新的子细胞核。当然也有发生在后期的染色体粘连现象如图(附录图a九)所示。它也是染色体畸变的主要形式之一。落后染色体形成的主要情况有两种：一是在其细胞有丝分裂的中期发生，即当染色体从不规则的排列逐步地整齐排列在赤道板上的时候，其中有个别的染色体、多个染色体或者是因为染色体的断片导致没有及时的排列到赤道板上如图(附录a图十)所示；另一种则是在细胞的有丝分裂的后期，正常的细胞染色体都会移向两极，但是个别染色体或者是染色体的片断则滞留在两极之间，和染色体主体部分向两极移动的速度与进程不同如图(附录a图十一)。 染色体桥，是细胞异常分裂和染色体的畸变的又一特征，因为染色体在断裂后再融和，当两个染色单体着丝粒分别移向相两极后，其臂仍然粘连一起，则两极之间被拉紧而形成染色体后期桥如图(附录a图十四)所示。在观察细胞染色体畸变的同时，也观察到了细胞微核如图(附录a图十七)所示。微核是染色体断片后或者是染色体浓缩形成的，它是独立于主细胞核的微小核体。攀枝花学院本科毕业设计（论文） 总结与展望 攀枝花学院本科毕业设计（论文） 总结与展望 4 总结与展望 4.1磷在锰的胁迫下对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响通过本次实验可以发现通过磷的加入可以对蚕豆根尖细胞有丝分裂产生影响。通