脂肪细胞脂质代谢对肝细胞营养感应信号的影响机制论文1.doc

脂肪细胞脂质代谢异常及其对肝细胞营养感应信号的影响和机制一、立项依据（项目所面向的我国经济、社会、国家安全和科学技术自身发展的重大需求，项目研究的科学意义，对解决国家重大需求问题的预期贡献等） 近20年来我国高脂血症或脂质代谢异常发生率明显升高，伴随的人群心血管疾病发生率也显著增加。高脂血症主要是指胆固醇和(或)甘油三酯升高，脂质代谢异常还包括高密度脂蛋白-胆固醇(hdl-c)降低。高脂血症发生的原因诸多，对机体所产生损害的作用机制也非常复杂。目前认为，脂肪和肝脏是高脂血症和脂质代谢紊乱发生密切相关的组织。所以，脂肪细胞脂质代谢异常及病理性脂肪因子分泌增多，必然会对肝细胞内营养感应信号产生重要的作用，这也是当前研究的热点。而脂肪细胞是如何影响肝脏的脂质代谢，也将是未来几年的研究方向和重点，这些研究可为探索高脂血症的发病机制及防治措施提供新的思路。二、国内外研究现状和发展趋势 （国际最新研究进展和发展趋势，国内研究现状和水平，在相关研究领域取得突破的机遇等） 目前认为，脂肪组织已不仅是能量储存器官，还具有分泌瘦素、脂联素、抵抗素等脂肪因子，调节糖、脂代谢等功能。但是，在肥胖状态下，脂肪细胞可发生功能失调，主要表现为胰岛素抵抗，分泌功能紊乱和病理性脂肪因子分泌增多1,2。然而，有关脂肪细胞功能失调的原因及其机制尚待深入探讨。虽然，我们对脂肪细胞的能量代谢有较为深入地了解，但对脂肪细胞参与胆固醇的代谢过程及机制却知之不多。有研究表明，胆固醇稳态对于维持脂肪细胞正常的生理功能具有重要意义。脂肪细胞肥大，胰岛素抵抗，分泌功能紊乱，胆固醇稳态失衡可能是其中的关键机制3。脂肪细胞内胆固醇稳态失衡主要表现为胞内胆固醇聚集，而细胞膜胆固醇含量降低。有研究表明，细胞内胆固醇失稳态可能是脂肪细胞功能异常的关键所在：用环糊精介导脂肪细胞膜胆固醇流出，模拟肥大脂肪细胞胞膜胆固醇相对减少状态，可导致细胞表现出胰岛素抵抗，分泌功能异常4；反之，纠正细胞胆固醇失衡，则可一定程度改善脂肪细胞的功能5。但是，目前，胆固醇失稳态致细胞功能异常的机制尚不明确。内质网应激是一种重要的细胞应激反应，过强或过长时间的激活会影响细胞的代谢及功能。内质网是细胞内进行蛋白合成、修饰、折叠和亚基组合的重要场所，蛋白是否被折叠成正确构像有赖于内质网的功能。当不利因素干扰内质网的功能时，未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集，引起非折叠蛋白反应（unfolded protein response, upr），即促发内质网应激6。游离胆固醇具有显著的细胞毒性，有研究发现，在胆固醇过度负荷的巨噬细胞，随着胆固醇转运至内质网，巨噬细胞则出现明显的内质网应激7。近期已有研究证实肥胖小鼠脂肪细胞内存在增强的内质网应激，并与其胰岛素抵抗有关8,9。对其他类型细胞的研究发现，内质网应激能诱导内皮细胞及巨噬细胞表达分泌il-6、il-8和tnf-等炎症因子；与此同时，在炎症因子表达分泌的调节中发挥重要作用的ikk/nf-b通路在发生内质网应激反应时可被激活10。因此，基于以上证据，我们推测：脂肪细胞内胆固醇过度负荷，过多的胆固醇转移至内质网，触发细胞内质网应激，继而导致细胞分泌功能异常，而其中ikk/nf-b通路可能在其中起介导作用。脂肪因子的影响包括全身（内分泌）和局部作用（旁分泌）。近来研究提示，内脏周围的脂肪积聚可对其临近的器官产生损害，例如，心脏、血管及肾脏的周围脂肪组织堆积能增加相应器官的损害并增加心血管病的危险11，提示脂肪组织的作用与其旁分泌效应密切相关。而肝脏紧邻腹部脂肪，所以腹型肥胖对肝脏的影响可能与脂肪细胞旁分泌有关。临床中也观察到，腹型肥胖特别是合并脂肪肝的患者血清hdl-c水平降低及tg升高更突出，因此，肥胖时，脂肪细胞分泌功能紊乱，分泌增多的病理性脂肪因子对肝细胞hdl及tg代谢可产生影响。肝脏是hdl代谢的关键器官，其代谢过程包括两大方面：首先，肝脏合成apoai并在atp结合盒转运体a1（abca1）作用下使apoai脂化形成hdl，abca1介导的apoai向hdl转化可发生在肝脏及肝脏外组织，但研究证实，选择性敲除肝脏abca1可使hdl-c下降80%以上12，提示肝脏abca1（而不是肝外组织abca1）是决定体内hdl-c水平的关键。另外，肝脏还通过高密度脂蛋白受体（b类i型清道夫受体)sr-bi摄取循环hdl中的胆固醇，促进hdl中的胆固醇向胆汁及肠道排泄。以上两方面作用均有利于外周组织的胆固醇向体外排泄，即所谓的“胆固醇逆转运”，这也是hdl抗动脉粥样硬化的首要机制。最近，我们通过比较正常及饮食诱导的肥胖小鼠体内胆固醇逆转运功能，结果发现在注射荷载3h-标记胆固醇的巨噬细胞后，与对照小鼠比较，肥胖小鼠血清及粪便3h-胆固醇放射活性在不同时间点均有降低，表示肥胖小鼠体内胆固醇逆转运下降。同时，48小时粪便3h-胆固醇放射活性在两组的差异大于48小时血清3h-胆固醇放射活性在两组的差异，说明肥胖小鼠从血清到粪便的胆固醇转运受损更加严重，提示肥胖对肝脏参与的胆固醇逆转运影响更突出。而肥胖状态下，脂肪细胞是通过何种脂肪因子，如何影响肝脏hdl代谢尚不清楚。wueest等人的研究发现，选择性敲除脂肪组织中的凋亡信号通路ras基因，能减少高脂饮食诱导的细胞因子（如il-6）升高，更重要的是显著减轻脂肪肝和明显增加肝脏对胰岛素的敏感性13，提示高脂饮食导致的脂肪细胞凋亡通路激活是体内炎症反应和肝脏胰岛素抵抗的关键因素之一。无独有偶，另外一项近期发表在science的研究也证实，选择性敲除脂肪组织中的应激信号通路jnk1基因，能阻断高脂饮食诱导的脂肪组织炎症反应（il-6升高）和肝脏的胰岛素抵抗14，提示肝脏是脂肪组织作用的主要靶点，支持脂肪细胞与肝细胞之间存在交互作用，而il-6是重要的介导之一。综上所述，我们推测：肥胖状态下，脂肪细胞可通过旁分泌脂肪因子影响肝脏hdl代谢相关蛋白的表达和对hdl胆固醇的摄取，从而影响胆固醇逆转运。除hdl代谢外，肝脏也是tg代谢的主要场所之一。肥胖状态下，过多的tg沉积在肝脏，致脂肪肝形成，但其分子机制尚不完全清楚。近年来研究发现，dna断裂因子相似蛋白(cide)家族是机体能量平衡及脂质代谢的重要调节因子，与代谢综合征、肥胖及脂肪肝等脂类代谢相关疾病密切相关15。cide家族包括三个成员：cide-a、cide-b 和cide-c。研究显示，敲除了cide-a、cide-b、fsp27的动物都表现出了能量释放增多，且能够抵抗饮食导致的肥胖、ir及肝脂肪变性16。cide家族定位于内质网、脂滴和线粒体，参与甘油三酯的储存、水解以及分泌等代谢过程。在生理情况下，肝脏主要表达cide-b，然而发生肝脂肪变性时，cide-a和cide-c的表达则上调。在肝细胞中，cide-b基因敲除后，固醇调节元件结合蛋白(srebp1c)的表达明显下降，同时影响该蛋白下游的多种酶类的活性，从而增强线粒体氧化，降低了脂肪的合成16。此外，cide-b敲除鼠分泌vldl-tg水平减少17。同样，cide-a或cide-c基因敲除可增强肝细胞的氧化，增加胰岛素的敏感性16,18。目前关于cide蛋白的上游调节因子的研究很有限。有研究表明，ppar-可上调cide-a和cide-c的表达19,20，而正常的肝细胞仅表达低水平的ppar-，当其发生脂肪化时，ppar-水平则显著上调。因此，除影响hdl代谢外，脂肪因子作用于肝细胞后，使肝细胞的ppar-表达上调，从而升高cide的表达，进而通过影响其下游的信号通路促进肝细胞脂质合成、降低氧化和胰岛素敏感性，最终导致脂肪肝。参考文献1 guilherme a, virbasius jv, puri v, czech mp. adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. nat rev mol cell biol，2008，9：367-772 hanauer sb. obesity and visceral fat: a growing inflammatory disease. nat clin pract gastroenterol hepatol，2005，2：2453 yu bl, zhao sp, hu jr. cholesterol imbalance in adipocytes: a possible mechanism of adipocytes dysfunction in obesity. obes rev，2010，11：560-74 le lay s, krief s, farnier c, et al. 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总体目标和五年预期目标应从对解决国家重大需求的预期贡献，在理论、方法、技术等方面预期取得的进展、突破及其科学价值，优秀人才培养等方面分别论述。五年预期目标要求有较为具体的量化考核指标。）本课题为临床基础研究，其成果将进一步阐明肥胖状态下脂肪细胞代谢失衡及分泌功能异常的机制，揭示肥胖时肝细胞hdl和tg代谢异常的分子机制，明确cide家族在调控肝细胞脂质代谢中的作用，并证实其相关作用通路。为探讨代谢综合征及脂肪肝等疾病的发病机制及防治策略提供新的思路。同时，本项目的开展有利于学科的建设和人才的培养，预计可完成有价值的论文8篇，培养博士研究生5名，硕士研究生7名。五、总体研究方案（结合主要研究内容阐述学术思路、技术途径、与国内外同类研究相比的创新点与特色、取得重大突破的可行性分析等。）本课题拟探讨肥胖状态下脂肪细胞分泌功能紊乱的机制，并以脂肪细胞和肝细胞相互作用为切入点，通过体外共培养及体内基质胶种植技术，研究肥胖时肝细胞hdl和tg代谢异常的分子机制。主要技术路线如下：第一部分 肥大脂肪细胞胆固醇代谢失衡机制探讨(1) 肥大脂肪细胞胆固醇代谢率的改变 成熟脂肪细胞诱导分化：选择小鼠3t3 ll前体脂肪细胞，采用经典的激素鸡尾酒方法诱导分化至成熟脂肪细胞。具体方法为：将3t3 ll置于含10%胎牛血清的dmem培养液中培养，待细胞生长至完全融合后48 h开始诱导分化。将原培养液换成含115 ng/ml 3-异丁基1-甲基黄磦呤（ibmx）、1mol地塞米松和10g/ml胰岛素的完全培养液。细胞孵育48h后，撤去ibmx和地塞米松，使培养液中只含有胰岛素10g/ml。再孵育48 h后，撤去胰岛素，用含10%胎牛血清（fbs）的dmem培养液培养细胞，每48 h换液一次，直到95%的细胞都为成熟的脂肪细胞。诱导分化时间约1周。肥大脂肪细胞诱导分化：脂肪细胞促分化至第21天，即为肥大脂肪细胞。（方法参考：arterioscler thromb vasc biol. 2005;25:2062-8.） 两种脂肪细胞的胆固醇代谢率比较（胆固醇代谢实验）：1) 按（1）、（2）所述方法，将3t3 ll前体脂肪细胞分别诱导分化为成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞。2) 用含ac-ldl 50mg/l的10% lpds-dmem诱导48 h后，加入0.5 ci/ml 3h标记的胆固醇（3h-胆固醇）7.4107bq/l继续孵育24 h，收集培养液并离心，射线计数仪测定放射活性，即为培养液的3h-胆固醇放射活性，计算细胞胆固醇流出率，为培养液的3h-胆固醇放射活性占总放射活性的百分比。3) pbs漂洗细胞，0.1 mol/l naoh 1ml反复冻融3次裂解细胞，收集溶解后的细胞用射线计数仪测定放射活性，即为细胞所摄取的胆固醇的量，该值所占总放射活性的百分比，为细胞胆固醇摄取率。4) 比较两组细胞的细胞胆固醇流出率和摄取率，可知两种脂肪细胞的胆固醇代谢率差异。5) 比较两组细胞的胆固醇代谢相关因子表达差异：按照步骤3) 裂解细胞，抽提细胞rna及其蛋白，分别通过rt-pcr和western blotting，测定细胞中胆固醇摄取相关因子（如ldlr1、ldl受体相关蛋白、小窝蛋白caveolin、ppar、ppar）和胆固醇流出相关因子（如abca1、abcg1、sr-bi、lxr）的基因和蛋白表达水平，以明确两种脂肪细胞的胆固醇代谢差异的机制（图1）。3t3 ll前体脂肪细胞三周一周诱导分化比较两组细胞的胆固醇代谢相关信号表达差异比较两组细胞的胆固醇代谢率差异肥大脂肪细胞成熟脂肪细胞胆固醇代谢实验 图1（2）肥大脂肪细胞胆固醇失衡的分子机制探讨1）利用sirna技术，分别构建lxr和srebp2的sirna腺病毒载体，分别转染人成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞中；不同时间点检测lxr和srebp2的表达，明确基因沉默效果；2）合适的时间点（根据上一步确定的时间点）检测脂肪细胞内胆固醇的代谢率以及胆固醇代谢相关因子表达，以明确lxr和srebp2在脂肪细胞胆固醇代谢失衡中的作用。第二部分 胆固醇负荷对脂肪细胞内质网应激和内分泌功能的影响及机制探讨（1） 胆固醇过负荷对脂肪细胞内质网应激及分泌功能的影响及其机制1）在含10胎牛血清的dmem培养基中培养小鼠3t3-l1前脂肪细胞；2）培养3t3-l1前体脂肪细胞，促分化为成熟的脂肪细胞；3）用ac-ldl及acat抑制剂处理脂肪细胞，使之为胆固醇过负荷的脂肪细胞；4） 在ac-ldl及acat抑制剂的基础上应用u18666a，抑制胆固醇向内质网转运；5）干预结束后用测定脂肪细胞胆固醇含量，分离内质网并测定内质网胆固醇含量；western blot法检测脂肪细胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk与eif2的蛋白水平，评价是否诱导产生内质网应激；用定量rt-pcr法检测各种脂肪因子的mrna表达，用elisa法测定上清液脂肪因子的分泌；检测脂肪细胞ikk/nf-b通路活性，包括用western blot法测定胞浆蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表达水平，并用emsa法测定nf-b活性（图2）。6）构建腺病毒载体，转染入脂肪细胞，sirna沉默nf-b p65后，再次重复上述实验。（2） 肥胖小鼠脂肪细胞胆固醇负荷、内质网应激、脂肪因子表达分泌情况及活性蛋白伴侣的作用探讨1）建立两种肥胖小鼠模型：遗传性ob/ob肥胖小鼠及饮食诱导的c57bl/6营养性肥胖小鼠，并设正常c57bl/6小鼠为对照；2）将各组小鼠分别予以口服活性化学蛋白伴侣pba和tudca共3周，并设立对照；3）测定血糖、血脂及血清脂肪因子浓度；4）麻醉处死动物，留取脂肪组织，分离成熟脂肪细胞并体外孵育培养24小时，检测各组脂肪细胞体积大小；测定脂肪细胞胆固醇含量，分离内质网并测定内质网胆固醇含量；检测脂肪因子的mrna表达并测定上清液脂肪因子的分泌水平；用western blot法测定脂肪细胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk与eif2的蛋白水平；测定脂肪细胞ikk/nf-b通路的活性（图3）。 小鼠3t3-l1前脂肪细胞，诱导分化8天成熟ac-ldl acat抑制剂ac-ldl acat抑制剂u18666a对照组干预结束，收集细胞及上清液检测脂肪因子mrna表达及上清液脂肪因子浓度western blot法测定胞浆蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表达水平，用emsa法测定nf-b活性。测定细胞内及内质网内胆固醇含量western blot法检测脂肪细胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk与eif2的蛋白水平 图2 正常c57bl/6小鼠c57bl/6营养性肥胖小鼠ob/ob肥胖小鼠tudca干预pba干预对照组取脂肪组织，分离成熟脂肪细胞并体外孵育24小时测定血糖、血脂及血清脂肪因子浓度western blot法测定胞浆蛋白ib及磷酸化ikk、核蛋白nf-b表达水平，用emsa法测定nf-b活性western blot法检测脂肪细胞grp78/bip、xbp-1及磷酸化 perk与eif2的蛋白水平检测脂肪因子mrna表达及上清液脂肪因子浓度测定各组脂肪细胞体积大小及内质网胆固醇含量 图3 第三部分 脂肪细胞因子影响肝脏hdl代谢（1） 观察 体外脂肪细胞/肝细胞共培养对肝细胞hdl代谢相关蛋白的影响1) 通过脂肪细胞与肝细胞共培养，比较不同分化程度（未分化、成熟和肥大）和应激状态（ox-ldl负荷和fas配体刺激）的脂肪细胞对肝细胞lxra、apoai、abca1及sr-bi蛋白及mrna表达的影响。同时观察不同脂肪细胞对肝细胞摄取hdl中胆固醇的差异。2) 比较不同脂肪细胞共培养下培养液介导巨噬细胞胆固醇流出能力的差异。（2） 观察体内脂肪组织对基质胶皮下种植肝细胞的hdl代谢相关蛋白的影响采用基质胶注射和回收模型，将肝细胞悬浮于基质胶中注射到腹部皮下脂肪周围，比较肥胖与非肥胖小鼠对基质胶种植的肝细胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达的影响。（3） 探讨 脂肪细胞对肝细胞hdl代谢影响的相关通路和分子机制1) 通过sirna沉默脂肪细胞jnk1及fas基因后，观察延长分化（诱导肥大脂肪细胞）、胆固醇负荷及fasl刺激的脂肪细胞共培养对肝细胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达的影响及肝细胞对hdl中胆固醇摄取的影响。2) 在脂肪细胞肝细胞共培养时，加入不同脂肪因子中和抗体（如il-6、tnf-a及瘦素抗体），观察其对肝细胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达的影响及其对肝细胞摄取hdl中胆固醇的影响。(3) 在脂肪细胞/肝细胞共培养时，加入nf-kb拮抗剂，阻断肝细胞的nf-kb通路，观察其对肝细胞lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达的影响及肝细胞对hdl中胆固醇摄取的影响。（4） 体内验证脂肪细胞因子对肝细胞hdl代谢影响1) 观察对照与肥胖小鼠（基因敲除和饮食诱导）肝脏lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达差异及血清apoai和hdl-c水平差异，同时观察体内注射不同脂肪因子中和抗体（如il-6、tnf-a及瘦素抗体）后肥胖小鼠肝脏lxra、apoai、abca及sr-bi蛋白及mrna表达及血清apoai和hdl-c水平变化。2) 观察体内注射不同脂肪因子中和抗体（如il-6、tnf-a及瘦素抗体）对肥胖小鼠体内胆固醇逆转运各环节（从巨噬细胞到血清以及从血清到粪便）的影响。第四部分 脂肪细胞因子影响肝脏tg代谢（1）肝细胞与脂肪细胞共培养对肝细胞脂质蓄积的影响1) 建立脂肪细胞与肝细胞的共培养模型，检测肝细胞内tg含量 2) 肝细胞与脂肪细胞共培养后，检测肝细胞ppar-以及脂肪细胞相关特异基因ap2、adiponectin等的表达（肝细胞发生脂肪化时，上述基因表达增加）。（2）探讨脂肪细胞对肝细胞cide表达的影响及相关通路和分子机制1) 肝细胞与脂肪细胞共培养后，检测肝细胞cide的基因及蛋白表达水平的变化。2) 检测共培养后肝细胞srebp1c蛋白及其磷酸化水平的改变，以及其下游多种酶类的表达变化，包括蛋白乙酰辅酶a 羧化酶2 (acetyl-coa carboxylase2, acc2)、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthetase, fas)和乙酰辅酶a 去饱和酶1 (stearoyl-coenzyme a desaturase 1, scd1)。3) 检测共培养后肝细胞ampk蛋白及其磷酸化水平的改变，检测线粒体的氧化功能，包括nrf1、pgc1a、vlcad、cox1和coxii线粒体相关基因的表达变化。4) 检测共培养后肝细胞对胰岛素的敏感性，包括irs-1、akt-2蛋白及其磷酸化水平的变化等。5) sirna分别沉默cide-a、-b、-c后，重复2-4的检测 ，明确其关键作用的cide蛋白。六、年度计划按年度提供研究内容及预期目标（5年）年度研究计划（1） 2012.1至2012.12 脂肪细胞胆固醇代谢失衡机制探讨。前体脂肪细胞的培养及诱导分化，并进行体外干预 。（2） 2013.1至2013.12 检测脂肪细胞内质网应激并进行相关动物实验，探讨内质网应激与分泌功能异常的关系。 （3） 2014.1至2014.6 建立脂肪细胞/肝细胞共培养体系，探讨脂肪细胞/肝细胞共培养对肝细胞表达hdl代谢相关蛋白及hdl-c摄取的影响。（4） 2014.7至2014.12 建立基质胶种植与回收模型，观察体内脂肪组织对种植肝细胞hdl代谢相关蛋白表达的影响。（5） 2015.1至2015.6 探讨jnk1、ras信号通路、细胞因子及nf-kb在介导脂肪细胞对肝细胞hdl代谢影响中的作用。（6） 2015.7至2.15.12 体内观察不同肥胖小鼠对肝脏hdl代谢相关蛋白的影响，同时观察脂肪因子中和抗体对肥胖相关hdl代谢异常及胆固醇逆转运影响。（7） 2016.1至2016.6 建立的脂肪细胞与肝细胞的共培养模型，检测肝细胞内tg含量和ppar-以及脂肪细胞相关特异基因的表达。（8） 2016.7至2016.12 探讨脂肪细胞对肝细胞cide表达的影响及相关通路和分子机制。整理数据，发表论文。七、创新点与特色（1）探讨脂肪细胞胆固醇代谢的机制，以胆固醇代谢失衡为靶点，研究脂肪细胞的功能异常，具有原始创新性，国内外尚未见该类报道；（2）从内质网应激方面入手，探讨肥大脂肪细胞内胆固醇代谢失衡致功能异常的机制，这是脂肪细胞功能异常的全新机制探讨，能为脂肪肝等疾病的防治提供新的干预策略。（3）以脂肪细胞与肝细胞共培养模型为切入点模拟体内脂肪细胞旁分泌作用，基质胶皮下种植和回收技术模拟体内脂肪组织对种植肝细胞的作用，探讨脂肪因子对肝细胞的作用尚属首创。（4）利用共培养模型，探讨cide家族对肝细胞内脂质代谢及胰岛素敏感性的影响并明确cide作用通路具有原创性。八、取得重大突破的可行性分析（1）在血脂代谢及脂肪细胞研究领域均具有良好的工作基础：课题组从1989年开始致力于血脂与动脉粥样硬化的研究，在脂质代谢研究方面积累了丰富的经验。2004年和2007年分获卫生部重点项目资助（批准号30470705，30770857），对高密度脂蛋白系列（包括apoai、apoe及其模拟肽）展开了广泛、深入的研究。多篇有价值的学术论文发表在atherosclerosis、am heart j、int j cardiol.等国外sci期刊上，引起国外同行关注；近5年来，课题组一直从事脂肪细胞脂质代谢及内分泌功能研究，熟练掌握脂肪细胞培养、胆固醇流出检测、基因沉默等技术，已获得多个有关脂肪细胞的国家自然科学基金课题（“脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体调节脂蛋白代谢”（批准号39970296 ）；“高密度脂蛋白和apoai模拟肽对脂肪细胞分泌功能调节和机制”（批准号30470705 ）；“内源性大麻系统对脂肪细胞脂质代谢的调节及其机制” （批准号30600498），“载脂蛋白av对细胞胆固醇转运的影响及其机制探讨” （批准号30971266），及其省科技厅课题 “女性内源性雌激素变化对血管内皮功能影响及其机制研究”、“雌激素对内皮细胞衰老的作用及机制（项目编号03ssy3080）” ，在脂肪细胞脂质代谢及其调控领域的研究处于国内外领先地位。本课题在前期研究的基础上制定，立题理论科学，依据充分，设计方案合理，理论上有可行性。（2）研究方法先进、可靠，且部分方法已建立：本课题的关键技术，包括脂肪细胞的培养和诱导分化、脂肪细胞与肝细胞共培养模型的建立、内质网应激检测、动物模型建立、胆固醇流出检测、激光共聚焦检测，基质胶种植和回收技术等都已建立成熟，为课题的顺利进行奠定基础。（3） 拥有成熟的实验技术、先进的设备和优秀的研究人员：申请人所在的研究所为卫生部重点项目资助的实验室，配备有齐全且先进的分子生物学设备及常规实验设备，并有专门的分子生物学技术人员从事基础实验工作，具有完善的细胞培养及动物实验的条件和技术，能独立完成western免疫印迹、同位素检测、脂蛋白超速离心和激光共聚焦检测等相关实验；研究所具有一支研究经验丰富，创新能力强的研究团队，且多数曾有海外研究经历。该课题的申请成员多人曾在国外知名实验室从事博士后研究，积累了丰富的研究经历。（4） 具有良好的支撑平台：与美国远泰生物技术有限公司建立了长期合作伙伴关系。能共享我校国家遗传学重点实验室、肿瘤研究所等重要资源。九、课题设置本课题旨在阐明肥胖状态下脂肪细胞脂质代谢失衡及内分泌紊乱的机制，揭示肥胖时脂肪细胞炎性脂肪因子对肝细胞hdl代谢的影响，明确cide家族调控肝细胞内脂质代谢的分子机制。为研究代谢综合征及脂肪肝等疾病的发病机制及防治策略提供依据。（1）研究脂肪细胞内胆固醇失衡的机制： 培养成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞（3t3-l1细胞促分化至21天），分别检测其对胆固醇的摄取和流出能力以及与摄取和流出有关的蛋白表达； 构建腺病毒载体，分别沉默srebp2和lxr，探讨srebp2在脂肪细胞胆固醇代谢失衡中的体制。（2）研究内质网应激介导胆固醇负荷所致脂肪细胞分泌功能异常：培养成熟脂肪细胞，观察胆固醇过负荷对内质网应激和脂肪因子表达分泌的影响，探讨其机制；建立肥胖小鼠模型，在体观察脂肪细胞胆固醇负荷、内质网应激与脂肪因子分泌变化之间的联系；（3）研究炎性脂肪因子影响肝脏hdl代谢：用脂肪细胞与肝细胞共培养模型和基质胶皮下种植/回收技术，分别观察不同状态的脂肪细胞及脂肪组织对肝细胞hdl 代谢的影响及分子机制，并探讨脂肪细胞因子及其调节通路在介导脂肪细胞和肝细胞相互作用中的价值。最后通过不同模型肥胖小鼠观察肥胖对肝脏hdl 代谢的影响并探索体内注射脂肪细胞因子拮抗剂干预的作用。（4） 研究炎性脂肪因子影响肝脏tg代谢：观察肝细胞与脂肪细胞共培养对肝细胞脂质蓄积的影响，探讨脂肪细胞对肝细胞cide表达的影响及相关通路和分子机制，运用sirna技术分别沉默cide-a、-b、-c后明确关键作用的cide蛋白。十、现有工作基础和条件（一）主要承担单位的相关工作基础和研究成果（含重点实验室情况）1、工作基础（1）课题组自2003年起开始关注脂肪细胞及其胆固醇转运，成功培养原代和3t3-l1脂肪细胞，并建立了成熟的诱导分化技术。研究发现脂肪细胞可通过细胞表面的清道夫受体cd36摄取脂蛋白中的胆固醇（atherosclerosis.2004;177:25562,），并对脂肪细胞的胆固醇流出途径、分泌功能等进行了深入探讨（int j cardiol. 2008;128:42-7）。（2）本课题组初步观察发现肥胖小鼠体内胆固醇逆转运受损，为本研究的立题打下了基础。1） 肥胖导致小鼠体内胆固醇逆转运受损：采用高脂肪饮食喂养c57bl/6小鼠12周，使其体重超过同龄低脂肪饮食c57bl/6小鼠20%以上，然后进行了体内胆固醇逆转运检测。结果提示：在注射荷载3h-标记胆固醇的巨噬细胞后，与对照小鼠比较，肥胖小鼠血清及粪便3h-胆固醇放射活性在不同时间点均有降低，表示肥胖小鼠体内胆固醇逆转运下降。同时，48小时粪便3h-胆固醇放射活性在两组的差异大于48小时血清3h-胆固醇放射活性在两组的差异（图-7），说明肥胖小鼠从血清到粪便的胆固醇转运受损更加严重，提示肥胖对肝脏参与的胆固醇逆转运影响更突出。2）初步观察了基质胶皮下种植与回收的可行性：基质胶为细胞膜基质蛋白，其特点是在4时呈液态，在22时呈胶状，因此，我们可将肝细胞悬浮于4的液态基质胶中，然后注射到皮下脂肪组织周围，进入体内后变为胶状，便于回收。3）证实基质胶中的细胞可与外周组织进行正常物质交换：尽管基质胶遇热变为胶状的特性有利于细胞种植和回收，但必须明确固态基质胶中的细胞与周围组织的物质交换不会受阻。为证实这一关键点，我们通过将荷载3h-胆固醇的巨噬细胞悬浮于液态的基质胶中，然后注入皮下，同时采用培养基悬浮的荷载3h-胆固醇的巨噬细胞作为对照，比较体内3h-胆固醇逆转运情况，结果发现，基质胶中的巨噬细胞3h-胆固醇能正常进入血液和粪便，但在前24小时基质胶中巨噬细胞的3h-胆固醇进入血清的速度稍慢，48小时后基质胶注射组与培养基注射组无明显差异。提示基质胶中的细胞能与周围组织进行正常的物质交换。（3）本课题组致力于血脂与动脉粥样硬化的研究，在脂蛋白研究方面积累了丰富的经验。对载脂蛋白e的调脂和抗动脉粥样硬化作用进行了系列研究，曾获湖南省科技成果奖和中华医学奖。对血管内皮细胞功能的研究结果，曾发表在著名的心血管杂志circulation上（circulation. 2004;110(8):915-20.），引起国内外同行关注。2004年在国家自然科学基金（30470705）的资助下，开展了“高密度脂蛋白和apoai模拟肽对脂肪细胞分泌功能的调节和机制” 的研究，发表相关研究论文14篇（其中5篇sci文章），并已按时结题。2004年和2007年分获卫生部重点项目资助，对高密度脂蛋白系列（包括apoai、apoe及其模拟肽）展开了广泛、深入的研究，发表相关研究论文18篇（其中8篇sci文章）。2007年再获国家自然科学基金资助（30770857），开展“apoai/e嵌合肽的优选及其抗动脉粥样硬化机制研究”。（4）课题组成员已熟练掌握放射性核素标记和蛋白结合检测、胆固醇流出测定以及各种脂蛋白成分的超速分离方法，为本课题的顺利完成奠定了技术基础。2、工作条件（1）课题组所在研究所已有本项目所需大部分仪器设备，包括：二氧化碳细胞培养箱、荧光显微镜、射线计数仪、实时定量pcr仪、酶标仪、超速离心机、激光共聚焦显微镜、bio-rad电泳系统、bio-rad电转膜装置、流式细胞仪、分光光度计、高效液相色谱仪等，并具备专门的实验动物室，拥有专业的分子生物学技术人员，已开展western免疫印迹、实时定量pcr、脂蛋白超速离心等相关分子生物学技术。（2）内皮细胞、内皮祖细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、人外周血单核细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞培养技术成熟，并成功构建脂肪细胞与肝细胞共培养模型。（3）已建立细胞内胆固醇的测定和胆固醇流出的检测方法，并已建立在体胆固醇逆转运动物模型及其检测方法。（4）已具备完成本项目研究内容的其他各项条件。（二）技术平台本课题组与美国远泰生物技术有限公司建立了长期合作伙伴关系。能共享我校国家遗传学重点实验室、肿瘤研究所等重要资源。（三）近五年承担的与所申报项目直接相关的国家科技计划重大、重点项目的完成情况序号获基金资助项目基金名称时间完成或进展情况1高密度脂蛋白的基础与临床研究卫生部重点项目2004优2“十一五”攻关acs强化降脂干预研究科技部2007优 3hdl主要功能蛋白对心血管急性事件预警及危险分层评估的临床研究卫生部重点项目2007优十一、研究队伍（一）研究队伍的规模和结构提供课题负责人和学术骨干的人数、职称、头衔（杰青、长江特聘教授或其他）。（二）课题负责人介绍赵水平，男，中南大学湘雅二医院心血管内科主任，教授，博士后，主要从事血脂代谢与动脉粥样硬化研究。19801988：进行了“血脂与冠心病”、“枳实抗休克动物实验研究”、“高盐摄入与高血压”、“动脉粥样硬化动物模型建立”等研究。1989-1994：重点研究血脂脂蛋白氧化与动脉粥样硬化，其中有关载脂蛋白e基因变异、中间密度脂蛋白特性和氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化的实验研究结果引起国际同行的关注。19951997：建立了心血管病