降解丙烯酰胺菌的筛选及应用_本科毕业论文.doc

本科生毕业设计 (论文) 中文题目 降解丙烯酰胺菌的筛选及应用 外文题目 screening of acrylamide degradation bacteria and its application 学 号 0708180076 姓 名 * 学 院 生命科学学院 专 业 生物工程 指导教师 * 完成时间 2011 年 5 月 2 号 江西师范大学教务处制 摘 要1 abstract.2 1 前言3 1.1 丙烯酰胺的应用3 1.2 丙烯酰胺菌的危害3 1.3 降解丙烯酰胺菌的研究意义4 2.材料与仪器4 2.1 菌种来源4 2.2 主要药品和试剂4 2.3 实验仪器5 2.4 培养基6 2.4.1 选择性培养基 .6 2.4.2 葡萄糖氧化发酵培养基 .6 2.4.3 甲基红试验和 v-p 试验培养基.7 3. 实验方法及原理.7 3.1降解丙烯酰胺菌筛选流程7 3.2 菌株的富集7 3.3 菌株的分离纯化8 3.4 菌种的生理生化鉴定4-58 3.4.1 革兰氏染色 .8 3.4.2 接触酶试验 .8 3.4.3 甲基红试验 .8 3.4.4 v-p 试验.8 3.4.5 葡萄糖氧化发酵实验 9 3.5 重络酸钾法测 cod【6-8】9 3.6 丙烯酰胺降解率的测定9 3.7 丙烯酰胺含量的测定10 4. 结果与分析.11 4.1 降解丙烯酰胺菌的分离11 4.2 优势菌的菌体染色及形态鉴定11 i 4.2.1 菌体染色 .11 4.2.2 生理生化鉴定 .12 4.3 菌株生长条件优化12 4.3.1 降解时间的影响 12 4.3.2 接种量的影响 .13 4.3.3 培养温度的影响 13 4.3.4 初始 ph 值的影响14 4.4 污水 cod 值测定14 4.4.1 菌株对污水 cod 降解结果15 4.4.2 菌株对丙烯酰胺除去率结果 .16 5.结论.16 参考文献17 致 谢18 0 摘 要 微生物降解因其特有的无害化处理将成为解决丙烯酰胺引起环境污染问题的有 效手段。采用富集、选择培养分离的方法，从江西昌九农科化工有限公司厌氧池废 水中筛选分离得到能够降解丙烯酰胺单体的菌株，对菌株的培养基及生长条件优化， 得到一株降解效果较好的菌株,最后对该丙烯酰胺降解菌进行基本的生理生化特性测 试，初步鉴定属葡萄球菌属，最适生长温度为 33，最适生长 ph 为 7.0 左右，最 佳接种量为 2%，最适生长时间是 12h，菌株对污水 cod 降解率达到 66%，丙烯酰 胺除去率达到 34.4%。 关键词： 丙烯酰胺，降解，菌株，筛选，鉴定 0 screening of acrylamide degradation bacteria and its application *directed by professor * abstract due to its peculiar free-pollution disposal, microbial degradation will become the effective methods to solve environmental pollution caused by acrylamide. by enhanced medium plus selective medium, from anaerobic pond wastewater of jiangxi chang nine agricultural chemical co., ltd , obtain the bacteria which can degrade the acrylamide monomer, then optimized the biogenic and growth conditions. measure the degradation performance of strains, get a strain which has better degradation performance, finally, physiological and biochemical preliminary identified as saprophytic staphylococcus. the optimal primary degradation conditions on mixed of the strain were as follows: optimal growth temperature is 33 , optimum ph 7.0, 2%amount of inoculation, 12h of best degradation time，codcr degradation rate is 66%，the removal rate of am is 34.4%. key words: acrylamide, degrade, strains, screening, identification 1 1 1 前言 1.1 丙烯酰胺的应用 丙烯酰胺(acrylamide，简称 am)是一种无气味的白色晶体，在工业上主要用于 合成聚丙烯酰胺(pam)。pam 由于具有特殊的物理化学性质，因而广泛应用于石油 开采、污水处理、造纸、矿产、医药、农业、纺织等行业，享有“百业助剂”之称。 丙烯酰胺具有神经毒性，可损伤周围神经系统和中枢神经系统，常人每天允许的最 大暴露量不超过 0.0005mg/kg1。化工医药行业的废水中常含有丙烯酰胺，对环境造 成污染，危害人类健康。利用微生物的生命活动对废水中的污染物进行处理是目前 最重要，最有发展前途，也是最常用的废水处理方法2。 1.2 丙烯酰胺菌的危害 急性毒性：急性毒性试验结果表明，大鼠、小鼠、豚鼠和兔的丙烯酰胺经口 ld50 为 150-180 mg/kg，属中等毒性物质。 神经毒性和生殖发育毒性：大量的动物试验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒 性；此外，为生殖、发育毒性。神经毒性作用主要为周围神经退行性变化和脑中涉 及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性变；生殖毒性作用表现为雄性大鼠精子 数目和活力下降及形态改变和生育能力下降。大鼠 90 天喂养试验，以神经系统形态 改变为终点，最大未观察到有害作用的剂量（noael）为 0.2 mg/kg 天。大鼠生殖 和发育毒性试验的 noael 为 2 mg/kg 天。 遗传毒性：丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用，可引起哺乳动物 体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常，如微核形成、姐妹染色单体交换、多 倍体、非整倍体和其他有丝分裂异常等，显性致死试验阳性。并证明丙烯酰胺的代 谢产物环氧丙酰胺是其主要致突变活性物质。 致癌性：动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，包括乳腺、甲 状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体等。国际癌症研究机构 （iarc）1994 年对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为 2 类致癌物（2a）即人 类可能致癌物，其主要依据为丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为其致癌活性代 谢产物环氧丙酰胺。由于煎炸食品是我国居民主要的食物，为减少丙烯酰胺对健康 2 的危害，我国应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国人群丙烯酰胺的暴露 评估，并研究减少加工食品中丙烯酰胺形成的可能方法。对于广大消费者，专家建 议： 1、尽量避免过度烹饪食品（如温度过高或加热时间太长），但应保证做熟， 以确保杀灭食品中的微生物，避免导致食源性疾病。 2 提倡平衡膳食，减少油炸和高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜。 3、建议食品生产加工企业，改进食品加工工艺和条件，研究减少食品中丙烯酰 胺的可能途径，探讨优化我国工业生产、家庭食品制作中食品配料、加工烹饪条件， 探索降低乃至可能消除食品中丙烯酰胺的方法。 1.3 降解丙烯酰胺菌的研究意义 丙烯酰胺既是化学试剂也是一种重要的工业原料，可以用它来聚合一种新型有 机高分子絮凝剂，用于可产生较少污泥的污水处理中，但在丙烯酰胺的共聚物产品 中，由于反应率不是 100%,有少量的丙烯酰胺的单体（原料）残存在产品中，在制 造应用丙烯酰胺聚合体的工业中，都会排出含有丙烯酰胺单体的废水，丙烯酰胺单 体难于分解，且具有毒性，为避免环境污染，就需要寻找去除丙烯酰胺单体的方法。 目前，降解有机污染物的处理技术中，应用具有特殊分解能力的微生物的投菌法具 有广阔的前景。本研究就是从从自然界中分离筛选降解丙烯酰胺的微生物菌种，并 达到了试验预期的目标。 2.2. 材料与仪器 2.1 菌种来源 从江西昌九农科化工有限公司厌氧池废水中筛选分离得到能够降解丙烯酰胺单 体的菌株 2.2 主要药品和试剂 实验中使用的药品和试剂如表 1 表 1 使用试剂名称，规格及厂家 3 table 1 chemical reagents consumed in experiment 名称规格生产厂家 磷酸氢二钾分析纯成都市科龙化工试剂厂 浓氨水分析纯天津市永大化学试剂开发中心 氯化铵分析纯天津市永大化学试剂开发中心 硝酸银分析纯天津市福晨化学试剂厂 硫酸亚铁分析纯天津市福晨化学试剂厂 氯化钠分析纯天津市永大化学试剂开发中心 重铬酸钾分析纯广东西陇化工厂 硫酸亚铁铵分析纯天津市永大化学试剂开发中心 盐酸分析纯南昌鑫光精细化工有限公司 浓硫酸分析纯南昌鑫光精细化工有限公司 蛋白胨生化试剂北京奥博星技术有限责任公司 肌酸生化试剂上海蓝季科技发展有限公司 甲基红生化试剂上海蓝季科技发展有限公司 琼脂粉生化试剂上海蓝季科技发展有限公司 牛肉膏生化试剂北京奥博星技术有限责任公司 营养琼脂粉生化试剂上海蓝季科技发展有限公司 氢氧化钠分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司 葡萄糖分析纯成都市科龙化工试剂厂 无水乙醇分析纯天津市福晨化学试剂厂 2.3 实验仪器 实验中所使用的仪器如表 2 表 2 使用仪器名称，规格及厂家 table 2 equipments used in experiment 名称规格型号生产厂家 隔水式电热恒温培养箱gsm-350-bs-上海新苗医疗器械制造有限公司 电热恒温鼓风干燥箱phg-9240a上海精密实验设备有限公司 电子天平mp502b上海精科天平 分析天平ja5003n上海精密科学仪器有限公司 不锈钢手提式灭菌锅dsx-280a上海申实医疗器械厂 全自动高压灭菌锅hve-50日本 4 洁净工作台sw-cj-if苏州安泰空气技术有限公司 可见分光光度计wfj7200 型龙尼柯（上海）仪器有限公司 ph 酸度计phs-25 型上海雷磁仪器厂 恒温培养摇床hwy-100b上海智城分析仪器制造有限公司 冰箱bcd-216yh海尔冰箱 2.4 培养基 2.4.1 选择性培养基 表 3 培养基的配制 table 3 medium compound 葡萄糖10g/l cacl20.1g/l k2hpo41.0g/l fecl30.01 g/l mgso40.5g/l nacl0.3 g/l 丙烯酰胺0.5g/l ph 控制在 7.0 2.4.2 葡萄糖氧化发酵培养基 表 4 培养基的配制 table 4 medium compound 蛋白胨10 g/l nacl5 g/l k2hpo40.2 g/l 葡萄糖10 g/l 琼脂6 g/l 1%溴甲酚紫3ml 蒸馏水1000ml 5 用氢氧化钠调 ph7.0-7.2，分装试管，115蒸汽灭菌 20min。 2.4.3 甲基红试验和 v-p 试验培养基 表 5 培养基的配制 table 5 medium compound 蛋白胨5 g/l 葡萄糖 5 g/l nacl5 g/l 蒸馏水1000ml 调 ph7.0-7.2，115灭菌 30min。 3.实验方法及原理 3.13.1 降解丙烯酰胺菌筛选流程 3.2 菌株的富集 实验样品采自江西昌九农科化工有限公司厌氧池带污泥废水，将所采集的带污 泥废水 1ml 接入 50ml 已灭菌的富集液体培养基中，在 30旋转式摇床（转速 从废水中富集培养菌株 菌种的纯化（反复划线培养进 行分离、纯化） 用选择性培养基筛选出优势菌株 优势菌生理生化性质测定 数据处理和结果分析 菌株生长条件优化及污染 物降解率测定 6 150r/min ）培养 1 天。 3.3 菌株的分离纯化 采用两次单细胞挑取法使初步分离的微生物得到纯培养3。 （1）观察菌落形态特征，发现初步分离的微生物大致有两种。用灭菌的竹签从 稀释涂布平板法得到的平板上挑取单菌落进行平板划线分离。 （2）用灭菌的竹签从第一次划线分离得到的平板上再挑取单菌落进行平板划线 分离。 （3）待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检 查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培 养。 （4）将已经纯化的两株菌种分别接种于试管斜面，做好标记。 3.4 菌种的生理生化鉴定4-5 实验参照简明第八版伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册对筛 选的细菌进行生理生化性质测定，将细菌初步鉴定到属。鉴定方法主要有革兰氏染 色法、接触酶试验、甲基红试验、v-p 实验、葡萄糖氧化发酵实验。 3.4.1 革兰氏染色 挑取少量菌苔涂布在载玻片上，风干，在火焰上固定涂片，滴加结晶紫染色 1-2 min，水洗，滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1 min，水洗。用滤纸吸去载玻片 上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用 95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫 色时，立即水洗。用番红液复染约 2 min，水洗。干燥后，用油镜观察。菌体被染成 蓝紫色的为革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。 3.4.2 接触酶试验 将培养 24 h 的斜面接种，以玻璃棒沾取少许涂在 3%过氧化氢的玻片上，如有 气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。 3.4.3 甲基红试验 培养基：蛋白胨，5 gl-1；葡萄糖，5 gl-1；k2hpo4，5 gl-1。在培养液 7 中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。 3.4.4 v-p 试验试验 培养基同甲基红试验。取培养液和 40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10 min 如培养液出现红色，即为试验阳性反应。 3.4.5 葡萄糖氧化发酵实验 取葡萄糖发酵培养基本试管 3 支，分别接入要鉴定的两株菌株，第三支不接种， 作为对照。接种后轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，将接种过 和作为对照的试管放置 30培养 2448h，发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色， 气体的产生可由试管中倒置的德汉式小管中有无气泡来证明。 3.5 重络酸钾法测 cod6-8 （1）方法原理 在强酸性溶液中，用一定量的重铬酸钾氧化水样中还原性物质，过量的重铬酸 钾以试亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴。根据硫酸亚铁铵的用量算出水样 中还原性物质消耗氧的量。 （2）干扰及消除 酸性重铬酸钾氧化性很强，可氧化大部分有机物，加入硫酸银作催化剂时，直 链脂肪族化合物完全被氧化，而芳香族有机物却不易被氧化，吡啶不被氧化，挥发 性直链脂肪族化合物、苯等有机物存在于蒸气相，不能与氧化剂液体接触，氧化不 明显。氯离子能被重铬酸钾氧化，并且能与硫酸银作用产生沉淀，影响测定结果， 故在回流前向水样中加入硫酸汞，使成为络合物以消除干扰。氯离子含量高于 1000mg/l 的样品应先做定量稀释，使含量降低至 1000mg/l 以下，再进行测定。 （3）方法的适用范围 用 0.25mol/l 浓度的重铬酸钾溶液可测定大于 50mg/l 的 cod 值，未经稀释 水样的测定上限是 700mg/l。 3.6 丙烯酰胺降解率的测定 取 1ml 菌株接入含 1.0mg/ml 丙烯酰胺的 5ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 培养 24h，再将菌体接入含 1.0mg/ml 丙烯酰胺的 5ml 无机盐培养基中，以丙烯酰胺 8 为唯一碳源，30培养 2 天，12000r/min 离心 5min，取菌上清液于紫外分光度计测 定紫外吸收值（a280）的变化，以 a280 的变化值代表丙烯酰胺的降解能力。 降解率=（未添加降解菌的 a280-添加降解菌的 a280）/未添加降解菌的 a280 3.7 丙烯酰胺含量的测定 为了确定丙烯酰胺的吸收波长，配制不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，在 unico uv-2100 紫外分光光度计上进行扫描，最终确定丙烯酰胺的吸收波长为 260nm，以 下研究实验中均采用 260nm 的波长测定丙烯酰胺的含量9-11。 丙烯酰胺标准溶液：准确称取 0.5g 丙烯酰胺（含量99.9），溶解在去离子 水中，定量转移入 100ml 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液为 5mg/ml 标准贮备液。 丙烯酰胺标准曲线：在 12 只具塞试管中，分别加入 0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和 2.0ml 标准溶液， 各加水至 5.00ml，配成 0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和 2.0mg/ml 标准系列。 在紫外分光光度计上 260nm 处测定不同浓度的丙烯酰胺溶液随吸光度变化的标准曲 线。测量数值如表 6 所示，标准曲线如图 1。相关系数 r2=0.9592，曲线方程为 y=0.7152x+0.5588。 表 6 标准浓度 am 溶液的吸光值 table 6 the light-absorbing values of standard concentration solution of am 浓度（mg/ml）吸光值浓度（mg/ml）吸光值 0.00.3611.01.242 0.050.4701.21.456 0.10.6721.41.575 0.30.8671.61.693 0.51.0261.81.815 0.71.2422.01.903 9 图 1 丙烯酰胺标准曲线 fig.1 standars curve of acrylamide 4. 结果与分析 4.1 降解丙烯酰胺菌的分离 经稀释平板涂布筛选了两种菌株 菌株 1 的形态特征：圆形规则，菌落较大，湿润，乳白色，透明 菌株 2 的形态特征：圆形规则，菌落小，干燥，白色，半透明 4.2 优势菌的菌体染色及形态鉴定 4.2.1 菌体染色 由图中可以看出，菌株 1 为革兰氏阳性杆菌，菌株 2 为革兰氏阴性菌。 丙烯酰胺标准曲线 y = 0.7152x + 0.5588 r2 = 0.9592 0 0.5 1 1.5 2 2.5 00.511.522.5 concentration(mg/ml) absorbence 10 (图 2)菌株 1 简单染色 (图 3) 菌株 2 简单染色 fig 2 simple stained fig 3 simple stained （图 4）菌株 1 革兰氏染色 （图 5）菌株 2 革兰氏染色 fig 4 gram stain fig 5 gram stain 4.2.2 生理生化鉴定 （1）接触酶实验，菌株 1 与菌株 2 均没有气泡产生，阴性； （2）糖氧化发酵，菌株 1 和菌株 2 均变黄，没有气泡； （3）甲基红试验，菌株 1 为红色，阳性，菌株 2 为黄色，阴性； （4）v-p 实验，菌株 1 与菌株 2 均不变红，阴性。 图 8 甲基红试验（右边为对照） 图 9 v-p 试验（右边为对照） fig 8 red-test (on right side for control) fig 9 v-p-test(on right side for control) 4.3 菌株生长条件优化 丙烯酰胺是具有毒性的有机物，需向培养液中添加营养元素以促进微生物生长 从而使丙烯酰胺降解。实验确定了外加碳源、氮源、磷源及其最佳浓度，优化了菌 株在纯培养条件下降解丙烯酰胺的最佳生长条件【12-14】。 11 4.3.1 降解时间的影响 将优势菌株进行斜面培养，再用无菌水洗，制成菌悬液，记录不同时间下菌株 的生长情况，取 6h、12h、18h、24h、30h、36h 六个时间点。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 010203040 时间(h) degradation rate % 图 8 降解率随时间的变化曲线 fig.8 the change of degrading rate in vegetation process of the bacteria 4.3.2 接种量的影响 将最优菌株向培养基中分别按不同的体积分数 1%、2%、3%、4%、5%接种， 在已优化的条件下培养 2 天后测定丙烯酰胺的降解率。 0 10 20 30 40 50 60 70 0123456 amount of inoculation/%(volume fraction) degradation rate % 图 9 降解率随接种量的变化曲线 fig.9 the degrading rate under different amount of inoculation 4.3.3 培养温度的影响 12 分别设定了不同的生长温度，在同等条件下培养。测定不同温度 20、25、 30、35、40下最优菌株对 1000 mgl-1am 溶液的降解效果。对丙烯酰胺溶 液的降解率进行了测定，从而确定了降解实验的最佳温度。 0 10 20 30 40 50 60 2025303540 temperature degradation rate % 图 10 降解率随温度的变化曲线 fig.10 the degrading rate under different temperature 4.3.4 初始 ph 值的影响 将优势菌株进行斜面培养 1 天，再用无菌水洗，制成菌悬液，用已灭菌的移液 管取等量分别倒入 ph 值为 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的液体培养基置于 30、200rpm 摇床培养进行，1 天后测其菌浓，从而确定最适 ph。 0 10 20 30 40 50 60 70 55.566.577.588.59 ph degradation rate % 图 11 降解率随 ph 值的变化曲线 13 fig.11 the degrading rate under different ph 4.4 污水 cod 值测定 具体操作如下【15-16】 （1）取 20.00ml 混合均匀的水样（或适量水样稀释至 20.00ml）置于 250ml 磨 口的回流锥形瓶中。于试料中加入 10.0ml 重铬酸钾标准溶液和几颗防爆沸玻璃珠 摇匀。将锥形瓶接到回流装置冷凝管下，接冷凝水。从冷凝管壁上端缓慢加入 30ml 硫酸银硫酸试剂，以防止低沸点有机物逸出。自溶液开始沸腾起回流 2 小 时。 注 1 对于化学需氧量高的废水样，可先取上述操作所需提及的 1/10 的废水样 和试剂，于 15150mm 硬质玻璃试管中，摇匀，加热后观察是否变成绿色。如溶液 显绿色，再适当减少废水取样量，直至溶液不变绿色为止，从而确定废水样分析时 应取用的体积。稀释时，所取废水样量不得少于 15ml，如果化学需氧量很高，则水 样应多次稀释。 注 2 废水中氯离子含量超过 30ml/l 时，应先把 0.4g 硫酸汞加入回流锥形瓶中， 再加 20.00ml 废水（或适量废水稀释至 20.00ml），摇匀。以下操作同上。 （2）冷却后，用 90ml 水自上冲洗冷凝管，取下锥形瓶，用水稀释至 140ml 左右。 溶液冷却至室温，加入 3 滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，颜 色由黄经蓝绿色变为红褐色为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液消耗毫升数 v2。 （3）测定水样同时，以 20.00ml 重蒸馏水，按同样操作步骤作空白试验。记录 滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。 （4）计算 cod （mg/l）=c(v1v2)8000/v0 c-标准溶液浓度，mol/l v2-试料测定时标准溶液消耗的体积，ml v1-空白实验标准溶液消耗的体积， v0-试料体积，ml 8000-1/4 o2的摩尔质量，以 mg/l 为单位的换算值 4.4.1 菌株对污水 cod 降解结果 表 3.两种菌株降解废水 cod 的能力 14 table 3 two strains of ability. cod degrading wastewater 废水 cod 浓度（mg/l） 降解前降解后降解率（%） 菌株菌株 24800200058.3 4.4.2 菌株对丙烯酰胺除去率结果 表 4.两种菌株降解丙烯酰胺的能力 table 4 two strains degradation of acrylamide ability 丙烯酰胺浓度（1.0mg/ml） 未添加降解菌的 a280添加降解菌的 a280除去率（%） 菌株 11.2420.81534.4% 菌株 21.2420.92625.4% 5.结论 (1)通过本实验的研究，可以知道：菌株 1 为革兰氏阳性杆菌，菌株 2 为革兰氏 阴性菌。其中菌株一的降解率要高，所以优势菌株可选菌株一. （2）最适生长温度为 33，最适生长 ph 为 7.0 左右，最佳接种量为 2%，最适 生长时间是 12h，菌株对污水 cod 降解率达到 66%，丙烯酰胺除去率达到 34.4%。 15 参考文献参考文献 1张学佳,纪巍,王宝辉等.丙烯酰胺生态毒理行为研究进展.生态毒理学报j,2008(3):217-223 2孔繁翔.环境生物学m.北京:高等教育出版社.2000,200-201. 3asano y, yamada h. a new enzyme nitrile hydratase which degrades acetonitrile in combination with amidase. agric biol chem ,1980 ,44 :2251.galzy p , arnaud a. fr 7333613. 1973. 4caulfield m j, hao x j, qiao g g, et al. degradation on 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