NG2与少突状胶质细胞ppt演示课件VIP

在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏 障改变、OPCs反应及DCs激活有关 1. Moransard 等人研究EAE在NG2KO mice 的作用，发现与WT mice并没有发现任何 差异 而本作者采用通过样的方法，发现NG2在 EAE中发挥着重要的作用 2. 实验方法 工具 n1.ELISA-酶联免疫吸附试验 n2.EAE 建模方法 n3.工具鼠 n4.bone marrow chimeramouse n5.血管内皮通透性试验 3. 1.ELISA-酶联免疫吸附试验 4. OD 5. 2.EAE 建模方法 nEAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润 及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化 （MS）的理想动物模型。 雌鼠 步骤： MOG35-55(200ug)+PBS水溶液100ul H37RA(结核分枝杆菌300ug)+ 然后300ul不完全弗氏佐剂超 声乳化 尾静脉一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液 400ng/ul) 用PBS稀释使用,每只老鼠腹腔注射0.1ml， 第2天注射。 皮下两侧 尾静脉 6. 利用同源重组技术 WT C57Bl/6J mice F1 NG2+/- Mice F2 NG2-/- Mice & NG2+/+ Mice WT Mice 纯合的 NG2KO mice 3.工具鼠 the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance 7. F1 8. WT 9. 4.bone marrow chimeramouse n骨髓嵌合体小鼠 =淋巴造血系统嵌合体 = 放射性嵌合体 n彻底破坏受者机体骨髓的造血系统，最大程度的杀灭肿 瘤细胞 n骨髓含造血干细胞，血液也有 n白血病 n同基因型 10. 5.FITC-dextran n血管内皮通透性试验 n 脑微血管内皮细胞（BMEC）拥有丰富的酶系统，但缺乏 收缩蛋白，故正常生理状态下组胺、5-羟色胺、白三烯C4 等血管活性物质较少影响血脑屏障 n而病理状态下因BMEC酶系统活性改变，活性物质将影响 BMEC，从而进一步影响血脑屏障的通透性。 n开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过 11. 在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏 障改变、OPCs反应及DCs激活有关 12. Introduction 1.NG2-硫酸软骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周细胞表达，NG2、 PDGFR 是OPCs（ NG2 cell ）的marker，当其分化成少突状 胶质细胞时，这两个marker不表达 CNS损伤时，OPCs反应性增殖，表达NG2的细胞在炎症部位聚集 EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中， 显著减少 OPCs分化为少突状胶质细胞，促进髓鞘的生成 CNS微血管中，周细胞促进血管生成，促进紧密连接的形成， 从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能； CNS损伤时，充当炎症传感器，免疫监视，执行中性粒细胞 巨噬细胞的功能 13. 2.表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关 胶质瘢痕 : 由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起脑组织的损伤而 导致星形胶质细胞增生。反应性星形胶质细胞增生是脑组织 损伤的修补反应 减弱星形胶质细胞增生，有利于改善脑缺血后神经功能恢复 胶质瘢痕形成是一个极其 复杂的病理生理过程，包括 组织水肿、炎症反应、局 部缺血、谷氨酸受体高反应性、脂 质过氧化作用、钙离子超负荷、自由基损伤、反应性星形胶 质细胞增生 14. EAE BBB渗透性改变的疾病 3.NG2 炎症浸润 CNS损伤有关 15. 4.NG2KO mice ，EAE的临床表现型更轻微 Unexpectedly，NG2有助于EAE的发病机制 OPCs及周细胞表达NG2 原因 免疫细胞也表达NG2 16. Abstract n在成年人的CNS中，OPCs表达NG2 n在病理情况下，NG2是周细胞激活的 marker EAE BBB渗透性改变的疾病 nNG2 炎症浸润 CNS损伤有关 17. ？ 研究思路 18. Results n1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微 n2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微 n3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的数量无改变 n4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续性分布与 BBB功能有关 n5.免疫细胞表达NG2 n6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少 n7. NG2KO mice，IL-12表达较少&NG2参与DC的激活 n8.NG2不参与巨噬细胞的极化 n9. NG2KO mice ,可调节的免疫反应&保守的BBB导致了EAE 轻微的表现型 19. 1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微 A representative of three independent experiments is presented 20. 26/33 100%=78.78% disease incidence (84 4.5 vs. 100 % in WT mice) Disease onset was delayed (13.06 3.66 vs. 8.16 1.71 days for WT mice) A representative of three independent experiments is presented 21. CD45：血管周浸润的炎性细胞，巨噬细胞 CoII IV :microvessel basal lamina TO-PRO-3：细胞核 22. 脊髓截面染色 小胶质细胞&巨噬细胞激活的星形胶质细胞 Stress marker-positive cells 浸润的T细胞 23. 大脑皮层脊髓 24. 2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻 微 EAE相关的促炎性基因的mRNA的表达情况 25. 3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的数量无改 变 nEAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中 ，显著减少（脱髓鞘过程中） Whether NG2 缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应？ 首先要证明NG2是不存在的或不生成 免疫荧光定量分析OPCs数量 确定PDGFR 确定NG2的确敲除了， 且在NG2KOmice中不表达 26. EAE 27. the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance 28. 在NG2KO mice中，NG2特异性的信号没有被发现（基于NG2敲除 的前提下，理解为没有生成），实验更加严谨-IFN- EAE 研究NG2缺失 29. 免疫荧光定量分析OPCs数量 30. MBP:神经纤维 APP:损伤的轴突 31. 4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续 性分布与BBB功能有关 n周细胞： 神经血管形成 BBB功能 NG2KO mice 中，是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性 改变有关 研究了内皮细胞的紧密连接蛋白 、claudin-5、 occludin（ 咬合蛋白）的结构和功能的分布 血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关 32. 33. 34. 35. Dextran-FITC experiments 血管内皮通透性试验 NG2KO mice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合 可替换信号 转导途径 36. 5.免疫细胞表达NG2 nNG2KO mice，巨噬细胞产生更少的炎性物质，浸润能力 减弱 nNG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关 ， whether NG2 is expressed in WT mice or not by cells of the systemic immune system. ? T Cell BMDDCs BMDMs 37. CD3:T Cell CD11c：BMDDs CD11b:BMDMs DAPI：核酸，DNA AT区 ? 38. 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应 ，炎症较少 n是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 n 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖， 加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE 39. 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应 ，炎症较少 n是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 n 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖， 加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE 40. 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应 ，炎症较少 n是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 n 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖， 加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE 41. 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应 ，炎症较少 n是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 n 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖， 加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE 42. 抑炎促炎 T 增 值 情 况 ConA-CD3-TCR ConA-NG2-NG2 43. 44. nDCs 髓系DCs：IL-12 Th0 Th1 BMDDCs 淋巴系DCs：IL-4 Th0 Th2 45. 7. NG2KO mice，IL-12表达减少 &NG2参与DC的激活 是否IL-12表达与NG2表达有关？ IL-12 WT 46. NG2-CD11c+ cells中，lL-12表达较