青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化的研究.doc

青枯雷尔氏菌青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病致病 力分化的研究力分化的研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物 研 究 生：程本亮 指 导 教 师：刘波 研究员 完 成 时 间：二 o 一 o 年四月 m.s. thesis of fujian agriculure and forestry university the study on differentiation of pathogenicity of ralstonia solanacearum discipline: science first rank discipline: biology second rank discipline: microbiology research field: applied microbiology supervisor: prof. dr. liu bo submitted time: april, 2010 独创性声明独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立 完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中 已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一 同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被 查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： i 目目 录录 中文摘要i abstract.ii 第一章 绪论1 1 青枯病1 1.1 青枯病的发生与危害.1 1.2 青枯病的防治.1 2 青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展2 2.1 青枯雷尔氏菌.2 2.2 青枯雷尔氏菌的致病机理.2 3 青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展3 4 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理4 4.1 eps i 合成相关基因.4 4.2 胞外蛋白及 ii 型分泌系统和 iii 型分泌系统的相关基因 4 4.3 网络状调节系统相关基因.5 5 研究目的及创新性6 第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化7 1 前言.7 2 材料与方法7 2.1 材料7 2.2 方法7 2.3 统计.8 3 结果与分析8 3.1 青枯雷尔氏菌的鉴定.8 3.2 青枯雷尔氏菌致病力的测定.9 3.3 番茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化.11 3.4 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化.12 3.5 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化.12 4 讨论13 第三章 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化的研究15 1 前言.15 2 材料与方法15 2.1 材料15 2.2 方法.16 2.3 统计.16 3 结果与分析16 3.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化.16 3.2 生防菌持续作用下青枯雷尔氏菌 rs91 的致病力分化 .18 3.3 青枯雷尔氏菌 rs91 和 rs1100 的继代培养过程的致病力分化19 ii 4 讨论20 第四章 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理22 1 前言.22 2 材料和方法.22 2.1 材料22 2.2 方法.22 2.3 统计.23 3 结果与分析23 3.1 青枯雷尔氏菌的转化.23 3.2 青枯雷尔氏菌 tn5 突变株 kmr基因的验证24 3.3 青枯雷尔氏菌 tn5 突变株的遗传稳定性 .25 3.4 青枯雷尔氏菌突变株致病力测定.26 3.5 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点.28 4 讨论28 第五章 青枯雷尔氏菌无致病力突变株与原始菌株的生物学异质性研究30 1 前言.30 2 材料和方法.30 2.1 材料30 2.2 方法.30 2.3 统计.32 3 结果与分析32 3.1 初始 ph 值对无致病力突变株生长的影响32 3.2 培养温度对无致病力突变株生长的影响33 3.3 无致病力突变株生长曲线异质性33 3.4 无致病力突变株胞外多糖含量异质性34 3.5 无致病力突变株 ttc 液体培养基分光光度计吸收峰分析35 4 讨论36 第六章 结论与展望38 参考文献40 附录45 个人简历48 致 谢49 i 中文摘要中文摘要 通过对青枯病不同发病时期不同部位的番茄、花生和生姜植株的青枯雷尔 氏菌进行分离，从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病后期的病株茎 中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分离到少量无致病力的菌株， 从生姜病株的茎上分离到的青枯菌全都是无致病力的菌株。 通过生防菌 anti-8098abc-0711 和青枯雷尔氏菌 1：1 共培养试验，表明生 防菌 anti-8098abc-0711 对供试青枯雷尔氏菌均有抑制作用，但是对不同菌株的 抑制率有所差异，生防菌对 rs466 菌株的抑制率仅为 4.6，对 rs91 和 rs1447 的抵制率较高，分别达到 78.3和 79.9，对其他菌株的抑制率介于 43.559.6之间。对强致病力青枯雷尔氏菌 rs91 和 rs1100 连续 5 代的继代 培养后发现 rs91 未出现致病力分化，而 rs1100 在第五代时出现致病力分化。 生防菌 anti-8098abc-0711 对 rs91 连续处理 3 代后，未出现致病力分化，对 rs1100 第一次处理后即出现无致病力菌株的分化。 通过 tn5 转座子随机插入青枯雷尔氏菌(rs91)获得 1004 株转座子随机插入 突变株，其中有 13 株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征，通过对其 中 5 株突变株在 ttc 平板上的形态特征和番茄盆栽苗生物测定结果确定为无致 病力菌株。经反向 pcr 测序和序列比对，分析鉴定出这 5 株无致病力青枯雷尔 氏菌突变株中有 4 株的插入位点分别位于 phca 基因，有 1 株突变株的插入位点 位于 phcs 基因上，并比较了这 5 株突变株与原始菌株的生理生化特性，这 5 株 突变株的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于 rs91，这 5 株突变株的 ttc 液 体培养基在紫外-可见分光光度计上于 400-450nm 波长上进行扫描，通过聚类分 析，这 5 株突变株与 rs91 分别聚为三类，插入位点位于 phca 基因上的菌株聚 为一类，插入位点 phcs 基因上的突变株为一类，原始菌株为另一类。 关键字：关键字：青枯雷尔氏菌，致病力，分化，tn5 转座子，突变 ii abstract ralstonia solanacearum were isolated from different parts of tomato, peanut and ginger in the different stages of bacterial wilt disease. the isolated strains included not only virulent strains but also avirulent strains in the root of tomoto in the early stage of bacterial wilt disease, the stem of tomoto in the late stage of bacterial wilt disease. the strains isolated from the stem of ginger both were the avirulent strain. the inhibitons of the biocontrol bacterium strain anti-8098abc-0711 (bacillus cereus) against ten ralstonia solanacearum virulent strains were investigated.but the inhibitions were diverse in different ralstonia solanacearum virulent strains. the inhibitons of anti-8098abc- 0711 against rs466 was only 4.6%,and significantly different from rs91 and rs1447,which respectively was 78.3 and 79.9, and the others were between 43.5%-59.6%.after subculturing 5 generations , differentiation of pathogenicity didnt appeare in rs91, but appeared in rs1100 when it was subcultured to the fifth generation. anti-8098abc-0711 and rs91 were co-clutured for three generations, and its differentiation of pathogenicity still didnt appear. but rs1100s differentiation of pathogenicity appeared after co-clutured with anti- 8098abc-0711 in the first generation. mutants of ralstonia solanacearum(strain rs91) were constructed by using tn5 transposon mutagenesis. and there were 1004 mutants being obtained. there are five avirulent mutants were identified by ttc medium and bioassay of potted tomato.and their insertion site flanking sequences were amplified by inverse pcr and sequenced. there were 4 avirulent mutants whose insertion sites were located in phca gene. and there was 1 avirulent mutant whose insertion sites were located in phcs gene.the growth curve and the relative content of epsi of this 5 mutants are significantly lower than strain rs91.this 5 avirulent mutants and rs91 were cultured in ttc liquid medium in the condition of 200rpm and 30 for 48h. and the supernatants of their culture were scanned by uv-spectrophotometer in the wavelength of 400- 450nm.the result of scanning were analysed by upgma dendrogram.it indicated that this 5 avirulent mutants and rs91 can be separated into 3 groups,the 4 avirulent mutants whose insertion sites were located in phca gene in a group,the avirulent mutant whose insertion sites were located in phcs gene in a group and rs91 in another group. keyword: ralstonia solanacearum; pathogenicity; differentiation; tn5 transposon; mutantion. 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 1 第一章第一章 绪论绪论 1 关于作物关于作物青枯病青枯病 1.1 青枯病的发生与危害青枯病的发生与危害 细菌性青枯病（bacteial wilt）是由其病原菌青枯雷尔氏菌（ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的土传病害，它广泛分部于热带、亚热带和温 带地区，在我国南方各省发病严重。由于温室效应，气温升高，其分布范围向 更高纬度的地区扩展1,2,3。青枯雷尔氏菌可以适应不同的环境，使得被侵染的寄 主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有种子植物和被子 植物，有双子叶植物和单子叶植物等，给青枯病的防治带来很大的困难4。它所 危害的宿主植物超过 50 个科，包括番茄、茄子、辣椒、烟草、马铃署、花生等 重要农业经济作物5及桉树、木麻黄、桑树等树木6，造成较严重的经济缺失。 1.2 青枯病的防治青枯病的防治 青枯病的防治在国内外均有广泛的报道，主要通过农业措施、化学药剂、 先育高抗品种和生物制剂等进行防治，其中生物防治得到最广泛的关注。由于 我国耕地有限，轮作等7农业措施受到很大的限制。利用化学农药如：康地蕾得、 青萎散、青枯灵、硫酸链霉素等对青枯病进行防治面临环境污染，而且存在青 枯雷尔氏菌对化学农药产生抗药性，防效不高等诸多问题8,9。而选育作物抗病 新品种，虽然已筛选获得部分抗原材料和高抗品种10-15，但是由于对抗病性能 高的抗源材料的获得较难，且由于青枯雷尔氏菌的高度种下分化，使抗病品种 无法大面积推广及抗病性能的退化的原因，制约了选育抗病新品种的发展。因 此，研究采用无毒，环保的微生物（细菌、真菌和放射线菌）农药防治青枯病 越来越受到关注。它们主要是从土壤中分离、从内生菌中筛选及构建基因工程 菌等方法获得。朱育菁等（2004）研制的 anti-8098abc-0711 制剂对连作重病区 的茄子青枯病具有良好的防治效果，同时对茄子植株具有显著促长作用16。徐 玲等（2006）利用从番茄根际分离到的一株多粘类芽孢杆菌防治青枯病，获得 很好的效果17。朱红惠等（2004）测定了 am 真菌对青枯菌的抑制作用，结果表 明，在接种青枯菌前 4 天接种 am 真菌，可以明显降低青枯菌在番茄根面和木 质部的数量18。潘文道等（2008）测定了放线菌 st-145 对番茄青枯病的防效， 结果表明在先接种放线菌 st-145 后再接种青枯菌，其防治效果达到 73.8319。 对于利用无致病力青枯雷尔氏菌菌株防治青枯病国内外做了大量的研究， 并有广泛报道，为防治青枯病提供了新的研究思路。肖田等(2008)初步研究了青 枯雷尔氏菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用，取得较好的控病效果，两 株无致病力青枯雷尔氏菌 20 天后的相对防效分别达到 58.4%和 97%20。无致病 力青枯雷尔氏菌可通过物理诱变、自发突变和基因工程等手段获得。frey et al. 福建农林大学硕士学位论文 2 (1994)，杨宇红等(2008)利用基因工程法获得了无致病力的 hrp-突变体21,22， trigalet et al.(1990)、康耀卫等(1995)利用 tn5 插入突变法获得青枯雷尔氏菌胞外蛋 白分泌缺失的突变株23,24、罗宽等(1983)、陈庆河等(2003)利用 co60辐射和紫外光 诱变25,26、王羽等（2004）利用分离自发突变株27等方法获得了许多无致病力青 枯突变株。关于无致病力青枯雷尔氏菌在防治青枯病方面的机理研究主要集中 在无致病力诱导宿主植物产生抗性和无致病力青枯雷尔氏菌所产细菌素的抑菌 作用两方面。何礼远等(1990)研究了通过无致病力青枯雷尔氏菌诱导花生植株产 生抗病性，结果表明经花生茎部毛细管滴注接种,可诱导花生茎部产生抗病性,并 可维持 10 天以上,且具有一定传导性，而花生种子接种无致病力青枯雷尔氏菌 菌株后不能诱导花生地上部分的抗病性,但可以有效地防止土壤中青枯菌对花生 根部的浸染,种植 42 天后的青枯病防治效果仍可达到 66.628；董春等(1999)利 用产细菌素的无致病力青枯雷尔氏菌株防治番茄青枯病，并认为细菌素的抑菌 作用和无致病力菌株诱导宿主产生抗性这两方面都对防治青枯病上起作用29。 张赛群等（2008）研究表明在接种无致病力青枯雷尔氏菌以后，植物抗病反应 中的关键物质（h2o2）和酶类（pod）均有显著上升，而分解 h2o2的 cat 活性 处于被抑制状态，并推测接种后抗病蛋白产量也相应增加30。 2 青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展 2.1 青枯雷尔氏菌青枯雷尔氏菌 青枯雷尔氏菌的菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，具有极生鞭毛，有运动 性，不形成荚膜和芽孢，菌体大小为 0.50.7 1.52.5m。菌落在 ttc 培养基 上有两种形态特征：一种为菌落流动性强，白边较宽，中心呈浅红色，这是强 致病性的野生型菌株；另一种为菌落干燥，扁平，白边很窄，中心呈暗红色， 这是致病性弱或丧失致病性的变异型菌株3。 2.2 青枯雷尔氏菌的致病机理青枯雷尔氏菌的致病机理 目前世界上对青枯雷尔氏菌的致病机理已进行了广泛的研究，青枯雷尔氏 菌经过植物根部的受损部位和根冠部位侵染植物，随后由维管组织扩散进入茎 部31。青枯雷尔氏菌的致病性是多方面的且复杂的现象。青枯雷尔氏菌的产生 多种致病因子包括胞外多糖（eps i） ，多聚半乳糖醛酸酶32和内切葡聚糖酶33等 植物细胞壁降解酶类及生长素、细胞分裂素和乙烯34等植物激素。对其致病机 理的研究主要集中在它的胞外多糖，果胶酶和纤维素酶上。hussain 和 kelman（1958）首次报道了青枯雷尔氏菌发酵液离心后的上清液能够使番茄枝条 萎蔫，而缺乏 epsi 的自发突变株没有这种现象发生35。因此认为植物体内的青 枯雷尔氏菌分泌的胞外多糖，堵塞导管，阻碍植物的水分运输，从而表现出萎 蔫的症状。另外，epsi 还可能掩盖了菌体表面的菌毛和脂多糖等结构，从而使 寄主植物的免疫系统无法识别和攻击青枯雷尔氏菌36-39。遗传学研究也已证明 eps i 是青枯雷尔氏菌关键的致病因子40。 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 3 3 青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展 青枯雷尔氏菌是一个非常复杂的类群，呈现出高度的种下分化的多态性。 buddenhagen 等41根据青枯雷尔氏菌对不同寄主致病性的表现进行划分为称为生 理小种（race） ，至 60 年代，已命名了 4 个生理小种（见表 1） 。何礼远等42将不 同于国外报道的部分桑青枯雷尔氏菌菌株命名为 5 号生理小种。 表 1 青枯雷尔氏菌生理小种（卢同，1998）43 table 1. race of ralstonia solanacearum（lu，1998） 小种侵染作物烟草过敏反应l-酪氨酸培养基产生黑色素的情况 小种 1烟草及多种茄科植物产生坏死枯斑产生大量黑色素 小种 2只侵染香蕉与海里康产生过敏反应不产生黑色素 小种 3能侵染马铃薯和番茄产生黄化斑产生少量黑色素 小种 4能侵染马铃薯和茄子产生过敏反应对酪氨酸酶活性中等 hayward（1964）根据青枯雷尔氏菌对 3 种双糖（乳糖、麦芽糖和纤维二糖） 和 3 种醇（甘露醇、甜醇和山梨醇）的氧化能力，将青枯雷尔氏菌分为 4 个生 化型(biovariaty)即生化型 i、ii、iii、iv44。我国的何礼远（1983）认为部分桑青枯 菌不属于上述 4 种生化型，应属于新的生化型 v45（见表 2） 。生理小种和生化 型之间没有绝对的相关性，但是研究表明 3 号生理小种均属于生化型 ii。 表 2 青枯雷尔氏菌生化型鉴定（根据 hayward，1964 和何礼远，1983） table 2. biovar of ralstonia solanacearum（hayward，1964he，1983） 生化型乳糖麦芽糖纤维二糖甘露醇甜醇山梨醇 生化型 i- 生化型 ii+- 生化型 iii+ 生化型 iv-+ 生化型 v+- 除了上述两种青枯雷尔氏菌的种下分化的分类方法以外，还有血清型、溶 原型、致病型和菌系等方法对青枯雷尔氏菌致病力分化进行研究43。其中青枯 雷尔氏菌的致病型和菌系的分化是根据青枯雷尔氏菌对鉴别品种的反应性进行 划分的。姚革等（1990）分析了四川省青枯雷尔氏菌的菌系及其分布后，发现 在青枯雷尔氏菌生理小种 i 型中存在着互不侵染的现象46。帅正彬等（1997）对 成都地区番茄青枯雷尔氏菌的生理小种进行分析后发现，同属一个生理小种的 青枯雷尔氏菌接种番茄品种的结果表现出不同的致病力，研究结果表明在同一 生理小种中的菌株，存在不同致病力分化47。 另外，前人的研究表明，青枯雷尔氏菌存在着不同致病力的分化即强致病 力菌株和无致病力菌株，前者侵入寄主植物，可导致寄主的发病；后者可以侵 福建农林大学硕士学位论文 4 染寄主植物，但不引起寄主发病48。有研究表明，在特定条件下，强致病力菌 株，会散失致病性，弱化形成无致病力菌株；kanda et al.研究表明（2003)营养条 件和极端气候引起的病原菌基因突变等原因可使强致病力菌株产生弱化49；但 在自然条件下，青枯雷尔氏菌的强致病力菌株具有保持致病性相对稳定的机制， 抵抗外界条件，侵染寄主植物，引起植物病害50。 4 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 青枯雷尔氏菌致病过程中的某些基因的突变，都会影响到青枯雷尔氏菌对 寄主植物的侵染和致病力。其中包括调控和编码 eps i 的基因，编码胞外蛋白的 基因及 ii 型分泌系统和 iii 型分泌系统的相关基因，以及形成网络状结构的调节 系统等。 4.1 eps i 合成相关基因合成相关基因 eps i 是青枯雷尔氏菌的主要致病因子。eps i 生物合成途径的大部分蛋白 质是由大小为 16kb 的 eps 操纵子调控和编码的。该操纵子由 12 个以上的基因构 成，它的转录由一个启动子控制，且需要有 10 个调节基因的产物和 3 种以上的 信号相互作用才能被完全的激活，eps 操纵子上的任何一个基因的突变都会阻碍 eps i 的产生51,52。hussain 报道了青枯雷尔氏菌缺乏 eps i 的自发突变株的发酵 液离心后的上清液不能使番茄枝条萎蔫35。 4.2 胞外蛋白及胞外蛋白及 ii 型分泌系统和型分泌系统和 iii 型分泌系统的相关基因型分泌系统的相关基因 青枯雷尔氏菌的胞外蛋白主要有 10 种，且都能较容易地从发酵液的上清液 中检测出来53。其中包括果胶溶解酶类和纤维素水解酶类等。果胶溶解酶类由 果胶甲基脂酶和三种多聚半乳糖醛酸酶构成，三种多聚半乳糖醛酸由 peha、pehb、pehc 基因分别编码，研究表明 pehb 的缺失突变株仅少量的降低青 枯雷尔氏菌致病力，而 peha 基因的突变株的可使青枯病发病时间比野生型菌株 推迟 1 倍47,54。青枯雷尔氏菌能够产生 2 种胞外葡聚糖酶，egl 能够水解可溶性 的纤维素，cbha 则能够降解结晶纤维素的末端55,56,egl 缺失突变的青枯雷尔氏 菌使寄主植物发病的时间也有所延迟。 与其他许多病原菌一样，青枯雷尔氏菌也存在 2 种分泌系统。由 eep 基因 编码的 ii 型分泌系统，能够分泌包括细胞壁裂解在内的大部分的重要胞外蛋白 57,58。由 hrp 基因编码的 iii 型分泌系统可直接向寄主植物细胞释放毒性蛋白因子,诱 导宿主细胞产生各种生理效应，如超敏反应等59-62。研究表明，iii 型可能横跨 了细胞膜的内膜和外膜，并将各种各样的致病因子及非致病性的蛋白运输到细 胞外，抑制植物的免疫反应63。hrp 基因簇包含了 20 多个基因,可能位于病原性 基因岛内，其中任何一个基因的失活，似乎都会使青枯雷尔氏菌完全失去对寄 主植物的致病力和在植物体内增殖的能力，以及在抗性品种植物体中引起过敏 反应的能力64,65。 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 5 4.3 网络状调节系统相关基因网络状调节系统相关基因 前人研究发现由于青枯雷尔氏菌适应植物体外的生存环境，它需要一个精 细的调节网络来控制 epsi 或其他致病因子（植物细胞壁降解酶类）等的表达51。 因此青枯雷尔氏菌对 epsi 的分子调控是严格且复杂的过程。根据 huang 等66对 epsi 的分子调控机制的综述，整个调控网络至少包括了 3 个明显的信号传导机 制,每个传导机制都具有独一无二的双组分系统即 vsrad、vsrbc 和 phcsr。每个 系统包含一个与膜结合的传感器激酶和一个特异感应调控因子。传感器激酶 vsra、vsrb 或 phcs 通过对其相应的特异感应调节因子 vsrd、vsrc 或 phcr 磷酸 化从而对某一环境信号作出响应，进而激活或抑制致病基因的表达。eps 基因最 大量的转录需要激活整个网络的所有组分。 图 1 青枯雷尔氏菌控制 eps 和其他基因表达的调控网络（huang，1998） fig. 1.organization of the regulatory network controlling eps and othervirulence genes of r. solanacearum. 其中，青枯雷尔氏菌的表现型转换系统基因（phc）是调节青枯雷尔氏菌致 病力的复杂网络结构的核心部分。kelman 等报道了发生致病力丧失的青枯雷尔 氏菌自发突变株可能是由于 phca 基因的突变后形成的67。phc 系统包括 lysr-型 转录调控因子 phca68和控制 phca 基因表达水平以适应青枯雷尔氏菌密度的 phcbsrq 操纵子的产物组成69,70。phca 基因的表达水平的增强，使青枯雷尔氏 菌的毒性因子 epsi 和胞外酶等产量大量增加，从而使菌株具有很强的致病力。 当 phca 基因的表达水平降低时，青枯雷尔氏菌仅合成少量的 epsi 和较低活性 的胞外酶，从而使菌株丧失大部分的致病力71,72。此外 phca 基因还反向调控 5f2 基因的表达，位于 hrp 基因簇外围的 5f2 基因座的突变，会显著降低 hrp-纤 福建农林大学硕士学位论文 6 毛的产生、青枯雷尔氏菌的致病力等，而 hrp-纤毛是 hrp 基因编码的 iii 型分泌系 统的一个成分，它对青枯雷尔氏菌的运动、粘附等起着重要的作用，它被推测 可能是 hrp 基因编码的 iii 型分泌系统向外输送蛋白质的通道73-76。 5 研究目的及创新性研究目的及创新性 青枯雷尔氏菌菌落在 ttc 培养基上有两种形态特征的分化，即强致病力菌 株和无致病力菌株的分化。本实验室研究发现生防菌 anti-8098abc-0711 处理野 生强致病力青枯雷尔氏菌后，出现致弱现象。这种致弱现象与自发的致病力分 化是怎样的关系呢？生防菌是否促进了青枯雷尔氏菌的分化？什么因素的改变 影响了分化后的菌株致病力和菌落形态。 本研究通过青枯雷尔氏菌继代培养和生防菌 anti-8098abc-0711 处理青枯雷 尔氏菌，观察青枯雷尔氏菌菌株的致病力分化。研究青枯雷尔氏菌自发的分化 与生防菌引起的致弱现象之间的关系。通过进一步构建转座子 tn5 插入突变体 库，从中筛选出致病力和菌落形态发生分化的突变株，研究导致致病力和菌落 形态分化的相关基因。并尽量多的保存因不同基因突变导致的无致病力突变株， 用于研究利用无致病力青枯雷尔氏菌防治青枯病。 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 7 第二章第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 1 前言前言 作物感染青枯雷尔氏菌后，在青枯病发病初期，病株上部叶片出现萎蔫； 进入发病中期后，在温度较高的午间，病株上部茎和叶片自上而下萎蔫，清晨 和傍晚可恢复；到了发病后期，全株茎和叶片萎蔫枯死，枯死的病株在短期内 仍保持绿色。病株茎部切开后，维管束吃呈褐色，进行溢菌检验时有溢菌现象。 本研究采集青枯病不同发病时期（初期、中期、后期）的作物，对其不同 部位中的青枯雷尔氏菌进行分离，了解不同致病力青枯雷尔氏菌在病株中的分 布,及青枯雷尔氏菌在作物青枯病的不同发病时期的不同部位中的分布情况。 2 材料与方法材料与方法 2.1 材料材料 样本：从福建建瓯采集结果期的番茄（健康植株及青枯病初期和后期的植 株，见附图 2、3、4） 、结果期的花生（健康植株及青枯病初期、中期、后期， 见附图 5）以及从福建福安采集的一株生姜病株（见附图 6） 。 菌株：强致病力青枯雷尔氏菌 rs91 由福建省农业科学院农业生物资源研 究所于番茄病株上分离保存。 ttc 培养基：10g 蛋白胨，1g 酪朊水解物，5g 葡萄糖，17g 琼脂，1000ml 蒸 馏水，ph 值调节到约 7.4 左右，分装，121灭菌 20min。灭菌后当冷却至 55 左右加入已灭菌的 1%的 ttc（2，3，5氯化三苯基四氮唑）水溶液其终浓度为 0.005%，最终 ph 值为 7.2 左右。 spa 培养基：5g 蛋白胨，20g 蔗糖，0.5g kh2po4，0.25g mgso4，1000ml 蒸馏 水，ph 值调节到约 7.4 左右，分装，121灭菌 20min，最终 ph 值为 7.2 左右。 1m naoh：称取 4g naoh 溶于 100ml 去离子蒸馏水中，备用。2%sds：称取 2g sds 溶于 100 ml 去离子蒸馏水中，备用。taq 酶、dntp 购于海英竣生物技术公 司。引物 peha#3 和 peha#677由上海英竣生物技术公司合成。引物序列为： peha#3: 5-cag cag aac ccg cgc ctg atc cag-3；peha#6: 5-atc gga ctt gat gcg cag gcc gtt-3。仪器：thz-d 台式恒温振荡器、生化培养箱。 2.2 方法方法 2.2.1 青枯雷尔氏菌的分离青枯雷尔氏菌的分离 称样：称取不同发病时期的番茄的根、茎基、茎中、叶柄、叶；不同发病 时期的花生的根、茎基及生姜病株的根和块茎各5g。 组织块研磨：用流水冲洗干净，剪成小块组织，在无菌操作条件下，经 福建农林大学硕士学位论文 8 75酒精处理30s，再用10次氯酸钠消毒8min，取出用无菌水漂洗3遍，用榨汁 机将组织块打碎，加入45ml无菌水溶解即配成10-1浓度的组织液。 稀释：吸取 1 ml10-1浓度的组织液至装有 9 ml 无菌水的试管，即配成 10-2 浓度，依次稀释配置成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度的组织液。 平板涂布：超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡 10-20s，吸取 200 l 至相应标记浓度的 ttc 平板上，溶液滴至平板中央，用涂布棒涂匀。涂好的平 板正放静置一会，使溶液渗透进平板中。每个梯度重复 3 次； 培养：将涂好的平板用报纸包好倒置于 30恒温箱中培养 60h； 划线分离纯化：观察分离培养的菌落，将要纯化的青枯菌菌落标上标记， 无菌操作用接种环直接取平板上要分离纯化的菌落至相应标记的平板上，划线 后放在30温箱中培养48h，待鉴定保存。 2.2.2 青枯雷尔氏菌的鉴定青枯雷尔氏菌的鉴定 挑取 2 环纯化的青枯菌于 1.5ml 灭菌离心管中，加入 1l 1m naoh 和 2.5l sds（2%） ，再加入 16.5l 无菌水于 95煮 15min，然后加入 180l 无菌水，制备 出菌株 dna，于-20保存。利用特异性引物 peha#3 和 peha#6 进行鉴定，扩增 得到的片断大小为 504bp。25l 的反应体系为：dna 模板 10-20ng， taq 酶(5u/l) 0.3l，10pcr 缓冲液 2.5l，dntp（10mm）0.5l，引物 peha#3 和 peha#6（10m）各 1l 加无菌水至 25l。反应程序：首先 96 1min，然后按 96 30s、70 30s、72 1min 程序 2 个循环，再按 94 30s、70 30s、72 1min 程 序 33 个循环，最后 72下延伸 5min。 挑取已鉴定菌株，菌种库编号后，接种于 spa 培养基中，200rpm，30培 养 48h，与灭菌的甘油（甘油终浓度为 20-25）混合后于-80保存。 2.2.3 青枯雷尔氏菌致病力的测定青枯雷尔氏菌致病力的测定 根据 hayward（1976）的方法辨别无致病力菌株，将保存于80编号为 70、79、86、88 和 98 的菌株活化后，接种于 spa 培养基中，170rpm，30培养 48h，菌液浓度达到 108，稀释 100 倍后，灌根接种于番茄苗上，强致病力青枯 雷尔氏菌 rs91 做阳性对照，稀释后的未接种培养基做阴性对照。每盆灌根 40 ml，每天观察发病率。 （每株菌处理 10 株苗，番茄苗的生长状态为 4 叶期） 。 2.3 统计统计 含菌样品克数 稀释培数个平板上菌落平均数同一稀释度的 度每克样品中青枯菌的浓 3 3 结果与分析结果与分析 3.1 青枯雷尔氏菌的鉴定青枯雷尔氏菌的鉴定 挑取分离于番茄，花生和生姜上的菌株利用特异性引物对 peha#3 和 peha#6 进行鉴定，经 pcr 扩增鉴定，rs91 与待测菌株均扩增得到约为 504bp 大小的片 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 9 且均为单一条带（图 6）。并保存了 37 株分离于不同植株上的青枯雷尔氏菌菌 株。 图 7 37 株青枯雷尔氏菌的鉴定（m：marker；1-37：待鉴定青枯雷尔氏菌；：青枯雷尔 氏菌 rs91；：ck fig. 7. identification of the 37 strains of r. solanacearum(m:marker;1-37: unidentified r. solanacearum; +: r. solanacearum and :ck 3.2 青枯雷尔氏菌致病力的测定青枯雷尔氏菌致病力的测定 通过对青枯病发病植株的青枯雷尔氏菌分离实验结果表明，从番茄，花生 和生姜病株上均分离到了青枯雷尔氏菌，其中番茄和生姜病株中分离到的青枯 雷尔氏菌包括强致病力青枯雷尔氏菌和无致病力青枯雷尔氏菌,见图 812。对 无致病力青枯雷尔氏菌的致病力试验结果见附图 1319。结果表明，rs91 在灌 根接种后第 4 天部分番茄发病，接种后第 6 天番茄植株全部发病，发病率为 100%； 而无致病力菌株 70、79、86、88 和 98 接种 7 天后未发病，发病率为 0。表明菌 株 70、79、86、88 和 98 为无致病力突变株。 图 8 番茄病株上分离到的强致病力青枯菌图 9 番茄病株分离到的无致病力青枯菌 500bp 500bp 福建农林大学硕士学位论文 10 fig. 8.virulence strain isolated from tomatofig. 9.avirulence strain isolated from tomato 图 10 花生病株分离到的强致病力青枯菌 fig. 10.virulence strain isolated from peanut 图 11 生姜病株分离到的强致病力青枯菌 fig. 11.virulence strain isolated from ginger 图 12 生姜病株分离到的无致病力青枯菌 fig. 12.avirulence strain isolated from ginger 图 13 rs 91 阳性对照 fig.13.positive control 图 14 阴性对照 fig.14. negative control 图 15 70 号菌株致病性测定 fig.15. determination of pathogenicity of strains 70 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 11 图 16 79 号菌株致 病性测定 fig.16. determination of pathogenicity of strains 79 图 17 86 号菌株致病 性测定 fig.17. determination of pathogenicity of strains 86 图 18 88 号菌株致病 性测定 fig.18. determination of pathogenicity of strains 88 图 19 98 号菌株致病 性测定 fig.19. determination of pathogenicity of strains 98 3.3 番茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化番茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 不同发病时期番茄植株不同部位在 ttc 平板上分离到的青枯菌浓度及菌落 形态见表 3 及附图 8、9，其中部分菌株为无致病力青枯菌。番茄健康植株内没 有分离到青枯菌。在发病初期的植株体内只在根中分离到青枯菌浓度为 0.4106cfu/g。在发病后期的植株的根、茎基、茎中均有分离到青枯菌，其中茎基 的青枯雷尔氏菌浓度最高达到 3106cfu/g。其中，在初期的根部和发病后期的茎 中部位分离到少量无致病力青枯雷尔氏菌，分别占分离到的青枯雷尔氏菌总数 的 2.5和 2.2。 表 3 番茄不同发病时期不同部位分离到的青枯雷尔氏菌浓度（106cfu/g） table 3. the quantity of r. solanacearum in different part of tomato in different period of disease 根茎基茎中茎顶叶柄叶 健康植株000000 发病初期0.400000 发病后期1.331.25000 福建农林大学硕士学位论文 12 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 青枯雷尔氏菌浓 度（106cfu/g） 根茎基茎中茎顶叶柄叶 分离部位 健康植株 发病初期 发病后期 图20 番茄不同发病时期不同部位分离到的青枯雷尔氏菌浓度（106cfu/g） fig. 20. the quantity of r. solanacearum in different part of tomato in different period of disease 3.4 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 不同发病时期花生植株根和茎基在 ttc 平板上分离到的青枯菌浓度见表 4 及图 21。花生健康植株内没有分离到青枯菌。在发病初期、发病中期和后期的 植株的根、茎基均有分离到青枯菌随着发病程度的加重，病株中青枯菌的浓度 也随之增加，在发病初期和中期病株的茎基中的青枯雷尔氏菌浓度均低于根部， 而发病后期病株茎基中的青枯雷尔氏菌浓度显著高于根部。 表 4 花生不同发病时期不同部位分离到的青枯雷尔氏菌浓度（106cfu/g） table 4. the quantity of r. solanacearum in different part of peanut in different period of disease 健康植株发病初期发病中期发病后期 根013.47.8 茎基00.5313.2 0 2 4 6 8 10 12 14 青枯雷尔氏菌浓度 （106cfu/g） 根茎基 分离部位 健康植株 发病初期 发病中期 发病后期 图 21 花生不同发病时期不同部位分离到的青枯雷尔氏菌浓度（106cfu/g） fig. 21. the quantity of r. solanacearum in different part of peanut in different period of disease 3.5 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 生姜的根和块茎在 ttc 平板上分离到的青枯雷尔氏菌见图 11、12，其中部 分菌株为无致病力青枯菌。生姜病株的块茎和茎部均分离到青枯雷尔氏菌，块 青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)致病力分化的研究 13 茎中的含菌量显著高于茎基，浓度分别为 116106 cfu/g 和 16106 cfu/g。在生姜的 茎部位分离到的全都是无致病力青枯雷尔氏菌。 4 讨论讨论 （1）有研究表明，在番茄田中的青枯雷尔氏菌由一定比例的强致病力菌株 和无致病力菌株组成，且他们之间的比例与青枯病的发生有关47。刘波等对青 枯雷尔氏菌在不同寄主、不同发病状态以及不同生育期植株体内的分布及致病 力进行了研究，结果呈现出明显的生态位分化的特征。了解不同致病力青枯雷 尔氏菌的分化对研究不同致病力青枯雷尔氏菌之间的种群动态和微生态关系具 有重要意义1。为研究无致病力菌株在青枯病防治方面的作用机理提供试验菌株。 根据 hayward（1976）利用 ttc 培养基对强致病力青枯菌和无