线粒体基因组complexⅠ变异与甲状腺肿瘤相关性研究.pdf

温州医学院 硕士学位论文 线粒体基因组complex变异与甲状腺肿瘤相关性研究 姓名：曲建春 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：吕建新;白益东 20100501 温州医学院硕士学位论文 线粒体基因组c o m p l e xi 变异与甲状腺肿瘤相关性研究 中文摘要 目的： 1 、本研究通过直接测序的方法检测温州地区甲状腺肿瘤患者线粒体d n a c o m p l e xi 变异发生情况。 2 、分析线粒体d n ac o m p l e xi 突变与甲状腺肿瘤的相关性及其在甲状腺肿瘤发生 发展中的作用。 方法： 1 、标本采集：选取2 0 0 8 年9 月至2 0 0 9 年7 月期间在温州医学院附属第一医院 就诊的甲状腺肿瘤患者8 0 例，包括甲状腺恶性肿瘤6 0 例( 甲状腺乳头状癌 5 9 例和甲状腺滤泡状癌l 例) 和甲状腺良性肿瘤2 0 例( 其中有1 例石蜡病 理诊断为腺瘤型结节性甲状腺肿，其它1 9 例为甲状腺腺瘤) 。采集所选患者 经苏木素伊红( h e ) 染色的5 p m 手术冰冻病理切片3 张，同时采集患者的 外周静脉血标本及其临床资料。 2 、d n a 提取：光学显微镜下观察病理冰冻组织切片，区分肿瘤组织和肿瘤旁正 常组织。用试剂盒法提取血液标本的全基因组d n a ，蛋白酶k 法提取肿瘤组 织和肿瘤旁组织的全基因坌 i d n a 。 3 、p c r 扩增：设计1 l 对互相交叉的引物对线粒体d n a c o m p l e xi 进行p c r 扩增， p c r 产物直接进行测序。 4 、数据分析：以患者自身的外周静脉血序列为对照，应用软件c o d o n c o d ea l i g n e r 对测序结果进行线粒体d n ac o m p l e xi 变异情况分析。进一步分析氨基酸改变 并运用生物软件进行保守性分析，借助蛋白质数据库对二级结构进行预测， 探讨c o m p l e xi 突变致瘤的分子机制。 5 、统计学分析：结合患者临床资料，通过统计学方法分析其与线粒体d n a c o m p l e xi 突变的相关性，初步探讨线粒体d n ac o m p l e xi 突变在甲状腺肿瘤发 生发展中的作用。 温州医学院硕士学位论文 结果： l 、本研究共检n n 2 0 个线粒体d n ac o m p l e xi 突变，1 4 个为同质性突变( 7 0 ) ， 6 个为异质性突变( 3 0 ) ，其中观察n 2 个突变位点从血液到肿瘤旁组织， 再到肿瘤组织异质率变化，即由野生型向突变型的转变过程。 2 、本研究在6 0 例恶性肿瘤患者中的1 7 例检测到突变( 突变率为2 8 3 3 ) ，在2 0 例良性肿瘤患者中的2 例检测到突变( 突变率为1 0 ) ，对恶性肿瘤组和良性 肿瘤组两组突变率进行统计学分析，结果无统计学差异( p 值 o 0 5 ) 。 3 、在2 0 个突变位点中，2 个( 包括g 3 8 4 2 a 和g 4 9 7 4 a ) 为无义突变，5 5 “ 为移码 突变，1 3 个为错义突变。错义突变中7 个引起氨基酸极性改变，且多位于进化 上保守的位置，对二级结构进行预测，发现c 1 3 2 5 0 t 弓l 起了其编码多肽二级结 构的改变，对无义突变和移码突变的二级结构进行预测，发现也引起了多肽二 级结构的改变。 4 、检测到的突变位点在c o m p l e xi 的分布情况为n d i 基因4 个、n d 2 基因2 个、n d 3 基因1 个、n d 4 l 基因1 个、n d 4 基因6 个、n d 5 基因5 个、n d 6 基因1 个。碱基 改变情况，2 个为碱基颠换( 包括t g 和c a 颠换各1 个) ，1 3 个为碱基转换( 包 括g a 转换8 个，t c 转换4 个，c t 转换1 个) 。 5 、在c o m p l e xi 上共发现2 0 3 个多态性位点，其中1 9 7 个位点( 9 7 0 4 ) 为碱基之 间的转换( 包括5 5 个a g ，5 0 个g - a ，4 3 个t c ，4 9 个c t ) ，6 吟- 为碱基之间 的颠换( 包括3 个c a ，1 个t a ，1 个t g ，1 ；i g - c ) ，其中有8 个为未报道的。 6 、线粒体d n ac o m p l e xi 突变与甲状腺肿瘤患者的性别、年龄、家族史、肿瘤大 小以及甲状腺功能指标( 促甲状腺素、游离甲状腺素和游离三碘甲状腺原氨 酸) 均无统计学意义( 所有p 值均 o 0 5 ) 。 结论： 1 、在本研究发现的突变位点中，观察n 2 个突变位点从血液到肿瘤旁组织，再到 肿瘤组织异质率变化，即由野生型向突变型的转变过程，以现有数据来看， 可初步认为线粒体d n a 突变参与甲状腺肿瘤的发生。 2 、在本研究样本例数( 包括6 0 例恶性和2 0 f f 0 良性甲状腺肿瘤) 和地域( 温州地 区) 范围内，线粒体d n ac o m p l e xi 突变在恶性肿瘤组和良性肿瘤组两组间的 2 温州医学院硕士学位论文 突变率无统计学差异( p 值 0 0 5 ) ，但检测到的错义突变c 1 3 2 5 0 t 、移码突 变和无义突变二级结构预测能引起蛋白质结构的改变，推测其在甲状腺肿瘤 的发生发展中起一定作用。 3 、本研究范围内线粒体d n ac o m p l e xi 突变与甲状腺肿瘤患者的性别、年龄、家 族史、肿瘤大小以及甲状腺功能指标( 促甲状腺素、游离甲状腺素和游离三 碘甲状腺原氨酸) 无相关性。 关键词：线粒体d n a ；复合体i ；基因突变；甲状腺肿瘤 温州医学院硕士学位论文 a s s o c i a t e dw i t ht h ev a r i a n t so fm i t o c h o n d r i a ld n a c o m p l e x i a n d t h y r o i dt u m o r s a b s t r a c t o b j e c t i v e ： 1 t oa n a l y z et h ev a r i a n t so fm i t o c h o n d r i a ld nac o m p l e xii nt h y r o i dt u m o r si n w c n z h o u 2 t oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o n so fm i t o c h o n d r i a ld n ac o m p l e xim u t a t i o n sw i t ht h e t h y r o i dt u m o r sa n dt h e i rr o l e si nt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft h et h y r o i d t u m o r s m e t h o d s ： 1 s p e c i m e n sc o l l e c t i o n ：w er a n d o m l yc o l l e c t e dt h et h y r o i dt u m o r sa n dp a i r e d p e r i p h e r a lb l o o ds a m p l e so f8 0t h y r o i dt u m o r s ( i n c l u d i n g5 9p a p i l l a r yt h y r o i d c a r c i n o m a s ，1f o l l i c u l a rt h y r o i dc a r c i n o m a s ，1 9f o l l i c u l a rt h y r o i da d e n o m a sa n d1 n o d u l a rg o i t e r ) f r o mt h ef as ta f f i l i a t e dh o s p i t a lo fw e n z h o um e d i c a lc o l l e g e a l l o ft h e mw e r ec o n f w m e db y p a t h o l o g i s t 3 p a t h o l o g i c a ls e c t i o n s ( 5 岬) w e r c a s s e m b l e da f t e rt h es u r g e r y , a n dt h e nw e r es t a i n e dw i t hh e ( h e m a t o x ya n de o s i n ) t h ec l i n i c a ld a t ao ft h e8 a m cp a t i e n t sw e r ea l s oc o l l e c t e d 2 d n ae x t r a c t i o n ：t os e p a r a t et h et u m o rt i s s u e sa n da d j a c e n tt i s s u e sf r o mt h es e c t i o n u n d e ram i c r o s c o p e t h e nt h eg e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o mt h eb l o o dw i t h d n ae x t r a c t i o nk i t ，f r o mt h et u m o u rt i s s u e sa n dt h ea d j a c e n tt i s s u e sw i t hp r o t e a s e k 3 p e ra m p l i f i c a t i o n ：e l e v e np a i r so fo v e r l a p p i n gp m e 窍w e f cd e s i g n e df o ra a m p l i f y i n gt h ec o m p l e xi ，t h e nt h ep e rp r o d u c t sw e r es e q u e n c e dd i r e c t l y 4 d a t aa n a l y z e ：w ea p p l i e dt h eb i o s o f t w a r et oa n a l y z et h es e q u e n c eo ft h es a m p l e s u s i n gt h eb l o o ds a m p l e a s c o n t r 0 1 a p p l y i n gt h eb i o s o r w a r et oa n a l y z et h e c o n s e r v a t i o n ，a n a l y z et h es t r u c t u r eo ft h ep r o t e i na n da n a l y z et h ea m i n oa c i d 4 温州医学院硕士学位论文 c h a n g et op r e d i c tt h ea l t e r a t i o n si nm i t o c h o n d r i a lf u n c t i o n ，t h e nw ew i l le x p l o r e t h em o l e c u l a rp a t h o g e n e s i so ft h em u t a t i o n si nt h y r o i dt u m o r s 5 s t a t i s t i c a la n a l y s i s ：c o m b i n i n gt h ec l i n i c a ld a t ao fo u rp a t i e n t s ，s u c ha sa g e ，t u m o r s i z e ，t u m o rm e t a s t a s i s ，f a m i l yh i s t o r y ，e t c t oe x p l o r et h er o l eo fm u t a t i o n s 1 b s u l t s ： 1 i no u rs t u d y ，w es c r e e n e d2 0m t d n a c o m p l e xim u t a t i o n si nt h et h y r o i dt u m o r s 1 4 o f 2 0 ( 7 0 ) m u t a t i o n s w e r e h o m o p l a s m y ，6 o f 2 4 ( 3 0 ) m u t a t i o n s w e r e h e t o r o p l a s m y w ec a l lo b s e r v e dt h ec h a n g ef r o mt h eh e t e r o p l a s m yt oh o m o p l a s m y i nb l o o ds a m p l e ，a d j a c e n tt i s s u ea n dt u r n o u tt i s s u ei n2m u t a t i o n s ，t h e r eh a v ea p r o c e s sf r o mt h ew i l d t y p et ot h em u t a n t 2 i no u rs t u d y ，1 7o f6 0 ( 2 8 3 3 ) t h et h y r o i dc a i c i n o m ap a t i e n t sh a r b o r e dm u t a t i o n s a n d2o f2 0 ( 1 0 ) t h et h y r o i da d e n o m a sh a r b o r e dm u t a t i o n si nt h ec o m p l e xi t h e r eh a v en oc o r r e l a t i o nb e t w e e nr a t eo fm u t a t i o n si nt h y r o i dc a r c i n o m aa n dr a t e o f m u t a t i o n si nt h y r o i da d e n o m a s ( p 0 0 5 ) 3 ，h l2 0m u t a t i o n s ，2n o n s e n s em u a t i o n s ( g 38 4 2 aa n dg 4 9 7 4 a ) , 5f r a m e s h i f l m u t a t i o n s ，a n d13m i s s e n s em u t a t i o n sw e r ed e t e c t e d 7o f13m i s s e n s em u t a t i o n s c h a n g et h ec h a r a c t e r i s t i co fa m i n oa c i d , m o s to ft h e ml o c a t e di nt h ec o n s e r v a t i o n r e g i o n c 1 3 2 5 0 t ，n o n s e n s em u t a t i o n sa n df r a m e s h i f tm u t a t i o n sc a nc h a n g et h e s t r u c t u r eo ft h ep o l y p e p t i d e 4 i no u rs t u d y ，4o f2 0l o c a t e di nn d lg e n e ，2o f2 0l o c a t e di nn d 2g e n e ，1o f2 0 l o c a t e di nn d 3g e n e ，1o f2 0l o c a t e di nn d 4 lg e n e ，6o f 2 0l o c a t e di nn d 4 g e n e ，5 o f2 0l o c a t e di nn d 5g e n e 1o f2 0l o c a t e di nn d 6g e n e 2o f15p o i n tm u t a t i o n s w e r eb a s et r a n s v o r s i o n ( i n c l u d i n git ga n dic a ) ，13o f15w e 代 b a s e t r a n s i t i o n ( i n c l u d i n g8g - a , 4t ca n d1c t ) 5 t o t a l l y2 0 3p o l y m o r p h i s m sw e l “ cd e t e c t e di nm t d n ac o m p l e xi ，8o ft h e mw c r c n c f v c rr e p o r t e db e f o r e 19 7o f2 0 3p o l y m o r p h i s m s ( 9 7 0 4 ) w o r eb a s et r a n s i t i o n ( i n c l u d i n g5 5a g ，5 0g - a ，4 3t ca n d 4 9c - t ) ，6o f2 0 3w o r et r a n s v e r s i o n ( 3c 八 1t - 八1t - ga n d1g - c ) 5 温州医学院硕士学位论文 6 n oc o r r e l a t i o n sw e r ef o u n db e t w e e nm t d n a c o m p l e xim u t a t i o n sa n dg e n d e r , a g e ， f a m i l yh i s t o r y ，t u m o rs i z e ，t h et e s tf m d i n g so ft h ep a t i e n t sw i t ht h y r o i dt u m o r sp o 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1 i no u rs t u d y ，w cc a no b s e r v e dt h ec h a n g ef r o mt h eh e t e r o p l a s m yt oh o m o p l a s m yi n b l o o ds a m p l e ，a d j a c e n tt i s s u ea n dt u m o u rt i s s u ei n2m u t a t i o n s ，t h e r eh a v ea p r o c e s sf r o mt h ew i l d t y p et ot h em u t a n t f r o mo u rd a t a ，w ea r cc o n s i d e r i n gt h a t m i t o c h o n d r i a ld n am u t a t i o n sm a yb ep a r t i c i p a t e di nt h et h y r o i dt u m o r i g e n e s i s 2 i no u rp a t i e n t s ( i n c l u d i n g6 0t h y r o i dc a r c i n o m a sa n d2 0t h y r o i da d e n o m a s ) a n d w e n z h o ur e g i o n ，t h e r eh a v en oc o r r e l a t i o nb e t w e e nr a t eo fm u t a t i o n si nt h y r o i d c a r c i n o m aa n dr a t eo fm u t a t i o n si n t h y r o i da d e n o m a s ( p o 0 5 ) b u tt h e m u t a t i o n s ( n o n s e n s e ，f r a m e s h i f ta n dc 13 2 5 0 t ) e a nc h a n g et h ea m i n oa c i da n dt h e p r o t e i ns t r u c t u r ew h i c he n c o d e d , s ow c h a v es o m er c a s o i l st ot h i n kt h em u t a t o n sw c s c r e e n e di nt h et h y r o i dt u m o re f f e c tt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft h et h y r o i d t u m o r s 3 n oc o r r e l a t i o n sw e r ef o u n db e t w e e nm t d n ac o m p l e xim u t a t i o n sa n dg e n d e r , a g e ， f a m i l yh i s t o r y ，t u m o rs i z e ，t h et e s tf i n d i n g so f t h ep a t i e n t sw i t ht h y r o i dt u m o r s p 0 0 5 ) k e y w o r d s ：m i t o c h o n d r i a ld n a ；c o m p l e xi ：m u t a t i o n s ；t h y r o i dt u m o r 6 温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 一一 刖吾 甲状腺肿瘤是内分泌系统最常见的肿瘤，在所有癌症中所占的比例约为 1 o ，其发病率在不同地区不等，平均约0 9 1 0 万( 男性) 和2 4 1 0 万( 女性) ， 但近年来其发病有上升的趋势。 甲状腺肿瘤大多数为原发性的，发生于甲状腺上皮细胞，其中主要来自甲状 腺滤泡上皮，少数来自滤泡旁细胞。临床上，常按其组织发生学、细胞分化程度 和生物学特性等分为甲状腺良性肿瘤和甲状腺恶性肿瘤两大类。甲状腺恶性肿瘤 中有4 种病理类型最常见，其中甲状腺乳头状癌，甲状腺滤泡状癌和甲状腺未分 化癌来源甲状腺滤泡上皮，而甲状腺髓样癌来源于甲状腺滤泡旁细胞。在这4 种 类型中，甲状腺乳头状癌最常见，约占甲状腺恶性肿瘤的6 0 以上，乳头状癌分 化较好，生长缓慢，恶性程度相对较低，早期发现早期治疗，则生存期长、预后 较佳。甲状腺良性肿瘤中主要为甲状腺腺瘤，病理上分为滤泡状、乳头状和h i i r t h l e 细胞三种主要类型，其中滤泡状多见，甲状腺腺瘤由于退行性变出现坏死、纤维 化、钙化、出血和单个或多囊腔，可出现恶变，恶变率为l o 左右。甲状腺肿瘤 可发生于任何年龄，女性多见，治疗以手术切除为主。手术证明甲状腺肿瘤单个 结节者多数为良性病变，但有2 0 为恶性肿瘤，因此对于甲状腺肿瘤应予以重视， 特别应警惕癌的可能。 肿瘤一直是威胁人类健康的主要疾病之一，引起肿瘤发生的原因既涉及到外 界因素如化学致癌物质、电离辐射、病毒等环境致癌因素，又与机体细胞的d n a 改变、遗传特性、免疫功能、激素水平的变化等密切相关。恶性肿瘤是体内外两 方面各种因素之间共同作用的最终结果。近年来的多项研究表明，肿瘤的生物学 特征不仅与核内遗传物质有关，而且与核外的线粒体d n a ( m i t o o h o n d r i a ld n a , m t d n a ) 关系密切。 线粒体d n a 是真核生物细胞核外唯一存在的一条双链环状d n a 分子，人类 m t d n a 是由1 6 5 6 9 个碱基对组成的，由一个复制控制区即d 1 0 0 p 区及含有3 7 个编 码基因的结构基因区构成，3 7 个编码基因包括2 2 个t r n a 编码基因，2 f r r n a 编 码基因以及1 3 个编码呼吸链复合体亚基的基因。这些亚基分别为复合体i ( o o m p l e xi ) 即n a d h - 泛醌还原酶( n a d hd e h y d r o g e n a s e u b i q u m o n e o x i d o r e d u c t a s e ，n d ) 中的7 个亚基( n d l 、n d 2 、n d 3 、n d 4 l 、n d 4 、n d 5 、 n d 6 ) 一；复合体i i i ( c o m p l e xi i i ) 即泛醌细胞色素c 还原酶 ( u b i q u m o n e c y t o c h r o m eco x i d o r e d u e t a s e ) 中的1 个亚基( c y t b ) ；复合体 ( c o m p l e xi v ) s p 细胞色素c 氧化酶( c y t o c h r o m e co x i d a s e ，c o ) 中的3 个亚基( c o i 、 c o i i 、c o i i i ) ；复合体v ( c o m p l e xi v ) 即a 1 1 p 合酶( a t ps y n t h a s e ，a t p a s e ) 7 温州医学院硕士学位论文 中的2 个亚基( a t p a s e 6 和a t p a s e 8 ) 。 12 s r n a fd l o o p 图l 线粒体基因结构图 h e a , f y 对r a n d n d 5 l i g h t s t r a n d 1 9 5 6 年，w m j o u r g 首次提出线粒体功能不全可能在肿瘤发生过程中起作用 。线粒体作为细胞的“动力工厂”，通过氧化磷酸化( o x i d a t i v ep h o s v h a t i o n ， o x p h o s ) 产生细胞所需的9 0 以上的能量，活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， r o s ) 则是氧化磷酸化过程的副产物，在呼吸链功能减弱的病理条件下，r o s 生 成明显增加，造成m t d n a 损伤，与核基因( n u c l e m “ d n a ，n d n a ) 相比，m t d n a 突变估计是n d n a 的1 0 倍一。m t d n a 的突变率高是因为其复制的多聚合酶缺乏保 真性；更靠近线粒体内膜上高浓度的r o s ；其修复系统不完善以及缺乏组蛋白的 保护，使得m t d n a 更易出现损伤，发生基因变异，包括m t d n a 含量显著增加； m t d n a 缺失( d e l e t i o n ) 、突变( m u t a t i o n ) 和微卫星不稳定性( m t m s i ) 。研究证 实m t d n a 变异与神经退行性疾病、心肌病、糖尿病等多种线粒体疾病相关， m t d n a 突变以及线粒体结构和功能异常可能与多种肿瘤的发生有关一，近年来， 相继在结肠、胃、乳腺、前列腺、胰腺等 。脏器的恶性肿瘤中发现t m t d n a 突 变，其突变形式主要是单个碱基的突变、插入、缺失、大片段的缺失以及微卫星 温州医学院硕士学位论文 不稳定性，并且发现，肿瘤细胞m t d n a 突变频率明显高于正常组织细胞，亦明 显不同于其他线粒体疾病的m t d n a 突变。 线粒体基因组发生突变后可能对其编码的蛋白质的功能造成影响。如果突变 位于m t d n a 基因1 3 个多肽编码区，将直接影响各相关酶复合体的功能；如果突 变位于t r n a 基因，则将影响线粒体编码多肽的翻译。如果突变发生在d 1 0 0 p l x ， 那么将可能引起整个线粒体功能的紊乱，直接影响线粒体的功能，引起m t d n a 复制速率的变化，这与线粒体功能的异常也是紧密相关的。 而对于甲状腺肿瘤，a b u a j n e r o 等一检测了1 9 例甲状腺癌样本，结果在7 例 中发现了突变，它们大多数位- 于c o m p l e xi 上，同时在4 个甲状腺肿瘤来源的细胞 系中检测到4 个突变，全部位于c o m p l e xi _ 1 2 。r o g o u n o v i t c h 等一总结了甲状腺癌 m t d n a 变异的情况，认为其点突变倾向于在m t d n a 的c o m p l e xi 和c o m p l e x 上 聚集，但是与正常组织的分布则不同。因此，不可忽视m t d n ac o m p l e xi 点突变 在甲状腺肿瘤细胞癌变机制中的作用。 本研究随机选取温州地区经临床病理确诊的甲状腺恶性肿瘤和良性肿瘤患 者，通过对其肿瘤组织、肿瘤旁正常组织和外周全血的m t d n ac o m p l e xi 的基因 变异的研究，探讨其与甲状腺肿瘤的相关性，分析m t d n a 突变在甲状腺肿瘤发 生发展过程中的作用，对揭示甲状腺肿瘤的线粒体遗传学特征，以期为早期预测、 早期诊断甲状腺肿瘤提供遗传学分子标记。 9 温州医学院硕士学位论文 材料和方法 一、研究对象 本研究对象为2 0 0 8 年9 月2 0 0 9 年7 月在温州医学院附属第一医院就诊的甲 状腺肿瘤患者，共8 0 例，根据病理诊断分为两组，包括甲状腺恶性肿瘤( 甲状 腺乳头状癌5 9 例和甲状腺滤泡状癌1 例) 6 0 例和甲状腺良性肿瘤2 0 例( 其中 有l 例石蜡病理诊断为腺瘤型结节性甲状腺肿，其它1 9 例为甲状腺腺瘤) 。男 女比例约l ：3 7 ，恶性肿瘤组平均年龄为4 8 5 0 士1 1 4 9 ，良性肿瘤组平均年龄为 4 4 7 5 士1 5 0 6 ，见表l 。采集所有患者经苏木素伊红( 砸) 染色的5 l x m 冰冻病理 切片3 张，低温冰箱保存，同时采集患者的外周全血标本和完整的临床资料 ( t b l 3 5 患者无外周全血标本) ，i 临床资料包括姓名，性别，年龄，家族史，病 理诊断结果，甲状腺功能检查结果等。标本编号甲状腺癌组以t c ( t h y r o i dc a n c t o t ) 开头，良性病变组以t b ( t h y r o i d b e n i g nd i s e a s e ) 开头，标本类型为血液的则以b 结尾，为肿瘤旁正常组织的以a 结尾，为肿瘤组织的以t 结尾。 表1 甲状腺恶性肿瘤组和甲状腺良性肿瘤组基本情况 二、主要仪器和试剂 1 主要仪器 ( 1 ) u n i v e r s a l3 2 台式高速冷冻离心机：德国h e t t i c h 公司 b e c 儿蝌低温离心机：美国b e c k m a n 公司 ( 2 ) m y c y c l a r t h e r m a lc y c l e r1 7 0 9 7 0 3p c r 扩增仪：美国b i o r a d 公司 ( 3 ) d y y i 8 b 稳压稳流型电泳仪：北京六一仪器厂 ( 4 ) x w 8 0 a 型微型漩涡混合仪：温州上塘教学仪器厂 ( 5 )电热恒温水浴箱：上海医疗器械五厂 ( 6 ) 真空干燥器：德国e p p e n d o r f 公 ( 7 ) w p 一2 0 0 a u v 紫外透射反射仪：温州奥利生物医学仪器厂 ( 8 ) n eg e n i u sb i oi m a g i n gs y s t e m 紫外凝胶分析系统：美国s y n g e n e 公司 ( 9 ) n i k o n 倒置生物显微镜：日本n i k o n 公司 ( 1 0 ) n i k o nd s 5 m - l 1 显微摄影系统：日本n i k o n 公司 ( 1 1 ) 可调式移液器一套( o 1 2 5 皿，o 5 1 0 止，2 - 2 0 止，1 0 - 1 0 0 皿，2 0 - 2 0 0 儿 1 0 0 - 1 0 0 0 儿) ：德 e p p e n d o r f 公 2 主要试剂 1 0 温州医学院硕士学位论文 2 1d n a 提取试剂盒( d n ae x t r a c t i o nk i tv e r 2 0 ) ，购自大连宝生物工程有限公 司 2 2 手工法提取d n a 试剂 ( 1 ) 细胞裂解缓冲液： 10 m m o l lt r i s h c l ( p h 8 o ) 1m m o v le d t a ( p h 8 0 ) 0 i ( m v ) s d s ( 2 ) 乙醇： 无水乙醇 7 5 乙醇( v ) ：水与无水乙醇l i3 混合 ( 3 ) 异丙醇 ( 4 ) 醋酸钾溶液( 1 0 0 m l 配制) ： 6 0 m l5 m o f l 醋酸钾，1 1 5 m l 冰醋酸，2 8 5 m l 去离子水定容至1 0 0 m l ( 5 ) 红细胞裂解液： 2 0 m m o f lt r i s - c lq h7 6 ) ( 6 ) 蛋白酶k ： 2 0 m g m l 的蛋白酶k ，购于宝生物工程( 大连) 有限公司 2 3p c r 试剂及引物 ( 1 ) e x t a q d n a p o l y m e r a s e 购自宝生物工程( 大连) 有限公司 ( 2 ) p c r 反应引物， 由宝生物工程( 大连) 有限公司合成 2 4 琼脂糖凝胶电泳试剂 ( 1 ) 5 0 t a e ( p h s 5 ) ：2 4 2 9 t r i s - c i 、3 7 2 9 n a 2 e d t a 2 h 2 0 置于l l 烧杯8 0 0 m l 去离子水充分搅拌溶解加入5 7 1 m l 醋酸，充分溶解去离子水定容至l l 调节 p h 为8 5 ，室温保存，使用时稀释5 0 倍 ( 2 ) 琼脂糖：购自b b i 公司 ( 3 ) 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ，e b ) ：称取0 1 9 e b ，；n a , 1 0 m l 去离子水中， 充分溶解，室温避光保存，e b 具有致癌作用，操作过程注意生物安全 2 5d n am a r k e r d l2 0 0 0d n am a r k e r ：购自宝生物工程( 大连) 有限公司 三、方法 1 肿瘤组织与正常组织的鉴别 温州医学院硕士学位论文 由病理科医师在显微镜下( 4 0 ) 观察患者h e 染色冰冻病理切片，寻找肿瘤 细胞区域标记为肿瘤组织区，并将其周围正常的甲状腺组织标记为正常组织区， 用l m l 注射器针头分别剥取肿瘤组织和肿瘤旁正常组织。 2 全基因组d n a 提取 2 1 手工法提取组织全基因组d n a ( 1 ) 分别选取己经过鉴别的肿瘤组织和正常组织，加入细胞裂解缓冲液6 0 0 1 h ( 2 ) 向裂解产物中加入3 1 12 0 m g m l 蛋白酶k ，以增加基因组d n a 的产量。消化 液置于5 5 水浴锅内消化过夜( 不得超过1 6 d , 时) ； 。 ( 3 ) 将样品降至室温，加入2 0 0 1 1 醋酸钾溶液，剧烈振荡2 0 s 使其充分混匀； ( 4 ) 将混合物置于冰上冰浴5 至l o m m ，用最高转速4 “ c 离，1 l , 3 m i n ，使蛋白s d s 复合物沉淀出来( 离心后，在管子底部应该可以看到一小片蛋白沉淀) ； ( 5 ) 将上清转移到加有6 0 0 1 1 异丙醇的新离心管中，充分混合，然后用最大转 速室温下离。l , l m i n 收集d n a 沉淀； ( 6 ) 吸去上清，i j d a 6 0 0 1 1 7 5 的乙醇，颠倒管子数次，用最大转速室温下离 心l m i n ； ( 7 ) 小心吸去上清，空气中干燥d n a 沉淀1 5 m i n ； ( 8 ) 将d n a 沉淀溶解于3 0 u l 灭菌蒸馏水中，置2 0 冰箱中保存； 2 2 试剂盒法提取血液全基因组d n a 血液标本：按照试剂盒中的使用说明进行，具体操作如下： ( 1 ) 取2 0 0 1 1 的静脉血( 含抗凝剂) 加入至c o l l e c t i o nt u b e 中： ( 2 ) 加入5 0 0 1 1 的s o l u t i o na ； ( 3 ) 加入l u l 的r n a s ea i ，激烈震荡1 5 秒钟后，冰浴5 分钟； ( 4 ) = c j d a 4 0 0 1 1 的s o l u t i o nb ，震荡混合； ( 5 ) 加入l m l 的4 “ c 预冷的s o l u t i o nc ，充分混合后，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟弃去 上层有机相； ( 6 ) 再加入l m l 的4 “ c 预冷的s o l u t i o nc ，充分混合后，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟： ( 7 ) 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于c o l l e c t i o nt u b c 上的f i l t e r c u p 中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟； ( 8 ) 弃f i l t e rc u p ，在滤液中加入4 0 0 i l l 的d bb u f f e r ，混合均匀； ( 9 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上。将上述混合液转移 至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟，弃滤液； ( 1 0 ) 将5 0 0 1 1 的r i n s ea 加a 至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离，1 二, 3 0 秒钟，弃滤液； ( 1 1 ) 将7 0 0 1 1 的r i n s eb 加入至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离，i = i , 3 0 秒钟，弃滤液； 温州医学院硕士学位论文 ( 1 2 ) 再次将7 0 0 1 a l 的r i n s cb 加入至s p i l lc o l u m n q b ，1 2 0 0 0 r p m 离- 1 1 , 3 0 秒钟，弃 滤液； ( 1 3 ) 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处 加入l o o p l 的灭菌水( 预热至6 5 “ c 有利于洗脱) ，室温静止1 分钟； ( 1 4 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟洗脱d n a 。 3 m t d n ao o m p l e xi 扩增 3 1 设计引物 参照w w w m i t o m a p o 唱网站上提供的m t d i n a 基因组序列- 修正剑桥参考序列 ( r e v i s e dc a m b r i d g er e f e r e n c es e q u e n c e ，r c r s ) ，设计了l l 对特异性引物扩增 m t d n ac o m p l e xi 的7 个基因( n d i 、n d 2 、n d 3 、n d 4 l 、n d 4 、n d 5 、n d 6 ) ， 扩增的位置从3 1 6 9 i i p 到6 0 3 1 n p ，从9 9 8 9 n p 至1 1 4 9 9 8 n p 。这些引物所扩增的区域相 互交叉以保证测序结果可以拼接，引物命名为5 、6 、7 、8 、1 5 、1 6 、1 7 、1 8 、1 9 、 2 0 和2 1 ，其中f 表示正向引物，r 表示反向引物，具体见表2 。 表2p c r 扩增所用的1l 对引物序列 基因引物名称 引物序列扩增位置片段长度 m 小j d l m t n d 2 m t n d 3 m t n d 4 3 1 6 9 3 9 6 1 7 9 2 b p 3 7 9 6 - 4 6 5 4 s s s b p 3 7 9 6 - 4 6 5 4 s 5 8 b p 4 4 8 5 5 4 2 0 9 3 5 b p 5 2 5 5 - 6 0 3 1 7 7 6 b p 9 9 8 9 - 1 0 8 3 7 8 4 8 b p 1 0 6 7 2 - 1 1 4 7 2 1 7 ft c a c t c t c a c t g c c c a a g a a1 1 3 1 4 - 1 2 0 7 6 7 6 2 b p 卯 嘏 卵 讯 卵 讯 仃 讯 卵 e 旨 | 薹 腿 | 皇 慊 | 兰 脉 温州医学院硕士学位论文 m t n d 5 m 心i d 6 1 7 rg g a g a a t g g g g g p 江a g g t g t 1 8 f 1 8 r 1 8 f 1 8 r 1 9 f 1 9 r 2 0 f 2 0 r 2 l f 2 l ra g aa t a t t g a g g c g c c 蛆1 g 1 1 9 4 8 1 2 7 7 2 8 2 4 b p 1 1 9 4 8 - 1 2 7 7 2 8 2 4 b p 1 2 5 7 1 - 1 3 5 0 7 9 3 6 b p 1 3 3 3 8 - 1 4