···分子生物学实验技巧.doc

平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？” 等等。然后仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。开设这样一个专贴，把平时实验室操作常用到的技术的一些小小的窍门说一说，如果有大牛觉得这些太简单了也请不要贬的太狠了，呵呵，先谢过了。相信肯定会帮到一部分战友，相信一定会有一定的意义的。当然也真诚的欢迎您的加入，把您的心得体会写出来。不论是关于什么方面的，不论你自己认为是多么的简单。因为总是有的战友也许还不知道这一点。能够帮到一个人您的回帖就是值得的。跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。 做western blot 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将pvdf膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。有关缓冲液和培养基配置1）将缓冲液配方中的成分分别以10100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配lb时的三个成分不记得到底哪个是5g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配lb时，在nacl瓶外注明10g/l, yeast 5 g/l, tryton 10 g/l等，很方便，不需要每次配之前临时翻书有关pcr主反应液配置:在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行pcr鉴定，每次配置pcr反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100主反应液（100次反应），其中含buffer，mg2，dntps，但不含引物和taq酶，然后可以10分装或一管储存在20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的pcr反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球2）避免每次反应加样不均的可能3）大大减少pcr假阳性的产生有关酶切反应液的配置:在做酶切时，也可以象pcr一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒dna的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒dna酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：1）各反应成分均一2）可大大减少限制型内切酶的使用3）节省时间有关sdspage：1）可将sdspage的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10ap，temed不加，切记！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入ap，temed即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可以提高电泳至150v，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省，不需1h即可看结果了灌蛋白胶的时候，先加水测试一下漏不漏，一定要加满。压分离胶的时候，用一个3毫升的针筒加70%的酒精，界面会很平.做单抗在融合过程中一定要使用无血清的培养基，因为融合中用到的peg可以使血清中的一些蛋白发生沉淀而导致培养孔中的一些沉渣的出现，这些渣子对任何细胞的培养都是不利的。实验中小窍门我想能够分成两类：一类是“非常规”操作；一类是常规操作过程中一些省时省事手段。前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（12毫米以上，bl21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基），50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升te抽提，上层te吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层te即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省68小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复-其实，其它的一些“小窍门”也是如此。后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的pcr,模板dna加量一样，配置pcr体系可以一起配制后分装-这点做过试验的都知道，但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点（如用100微升则配110微升），这样可以避免有时候分装不够的尴尬，因为不同特别是大小不同的枪，会有误差。再比如：楼上有站友说的sds-page胶预配（aps和temed、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定影响效果，如果要在一天内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配sds-page胶的时候，上层胶和下层胶可以只用一个大枪头：先取胶，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省时省料。蛋白透析的时候透析液的ph值很重要。除ph值外，做透析操作的时候一定要带手套，手上的一些油脂对透析袋的通透性以及整个透析的效果有很坏的影响。如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解dna，因为te里面的离子会影响酶切的效率。1，小提质粒：将amp浓度提高到200ug/ml，下班前接种，次日一早收获菌体，此时od虽然不高，质粒丰度却不一般！菌体量少些，操作体积（管数）也小（少）。2，质粒酶切：双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。3，tricine电泳做起来比较麻烦，有时试剂也不凑手。15%的sds-page用2x tris-gly 缓冲液跑，914kd的小蛋白分离效果也非常好。4，没有acta express的实验室，做蛋白层析纯化，采用医院输液的瓶子和输液软管，调整瓶子的高度和软管上的卡子，可以方便地控制流速。采用买来的注射用水（500ml/瓶）配制溶液（可以灭菌或超滤），还能较好地在普通实验室控制外源热源质的污染。（以上两条记得在我另外的帖子里也顺便提到过）5，我们原先实验室的pcr仪中，存有一个“懒汉”程序。94度40秒/63度90秒，专门用于从已知序列和丰度的模板（如质粒）上扩增500bp以下的片断。当然事先还得知道引物的tm是否适合在63度复性。6，用大离心机（非台式），比如大提质粒、大量提取包含体、离心蛋白溶液，可以比“分子克隆”上要求的时间稍短一些，因为大转子启动和停止的时间比较长。7，做等点聚焦电泳，胶浓度低容易破碎，剥胶时可以将其放在装有纯水的大培养皿内操作。呵呵，下班了。再次说明，“窍门”未必屡试不爽。当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60以上。做sds-page的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是wb。做法就是拿1x的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的。在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试蛋白透析时出现沉淀总是不可避免的，但是要想尽办法将沉淀降到最低。导致沉淀出现的主要原因就是ph值了。建议透析前先查一查自己目的蛋白的等电点然后在确定透析液的ph值，而且ph值最好是离蛋白等电点远一点，一次透析可以配制3个不同ph值的透析液，这样根据沉淀的多少确定最佳透析ph值，这样可以节省一点时间和精力。做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果现用8m urea重悬细菌再煮效果会有极大改善.注:不能用gu-hcl代替我也推荐几个偷懒的方法1 做sds-page跑胶通常都是现配现用,但配胶要1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.2 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响.3 推荐一个节约抗体/时间的做法:同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法.1 记得去年冬天的时候跑sds-page，不知怎么搞的，试剂没问题操作也没问题，就是感觉胶凝的慢，平时10分钟左右就凝了，那天等了将近1个小时，老板说可能是冬天温度低，胶凝的慢，可以放在烘箱里几分钟，我就试试，还挺管用的，当然了气温不是很低的时候就不用放了。2 我主要做活性蛋白的，有时候由于样品浓度低或其他原因总是有个别样品沉不到加样孔中往上漂，我就用枪加一两滴甘油混匀后再加样就沉下去了手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。转化时一定要做一个宿主菌的对照，即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于bl21可以在amp（+）的平板上面生长。sds-page配胶时，当注入浓缩胶并插入梳子后，在配胶装置外罩一保鲜袋，以防止梳孔中浓缩胶缩水。简单又好用！我也来说一条自认为的daily tip。做western blotting 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。作蛋白溶液的超滤时，如果用夹子控制回流液的流速，不仅要注意夹子的松紧度，更要注意夹子的位置，要夹在离液水口4厘米的位置，我试过，差0.5厘米，就会严重影响透过液的速度。作蛋白溶液的超滤时，如果用夹子控制回流液的流速，不仅要注意夹子的松紧度，更要注意夹子的位置，要夹在离液水口4厘米的位置，我试过，差0.5厘米，就会严重影响透过液的速度。超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的_ 关于western blot1）器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗23遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95酒精再擦一遍后晾干备用。2）配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加aps并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入12次即可。跑蛋白page的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用20ul枪+普通小白枪头点，非常省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎呀，爱惜自己。我来补充一条：垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。碱法提质粒时，如果要求不太高的话，用氯仿抽提就可以了，做酶切鉴定克隆完全没有问题。我也说一条：我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心管，这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子找，另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。我也说一条大家都知道pmsf有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的pmsf,其实也可以先称pmsf,称多少算多少,再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。说说个人认为跑好sds-page胶的一些体会。1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。3. ap分装成500微升一管保存放-20度，避免ap用太久失效。4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。8. 尽量在冰浴状态下跑。我也来说说我做实验时的一些小经验我做实验时做做的比较多，总结了几个小窍门：一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧剪一小段胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验结果 sdspage时,在灌胶之前,一般大家都会用凡士林封底, 在sdspage电 泳之前又必须把凡士林搽干净,很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加ap的分离胶,按比例加2倍量的ap,然后灌入板间,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶了.方面,效果好!刚入门分子生物学心得：在pcr的时候，开学总觉得加tap ploymerase多点为好，总是加的有点过量，结果总是不理想。后来尝试加少点，100l安0.51u的量加，效果很不错。pcr是模板也要适量，质粒pcr和菌落pcr可以用牙签蘸一下模板的量就足够了。而基因组pcr模板的量药加的足够多。看到大家在跑sds-page时，ap都是配好20度保存的。个人觉得临时配比较好，保证质量。而且多数时候只跑一块胶，10ap几十个ul就够了，配的时候只要挑一点点，1020mg,称多少就配多少，比如称出来是16mg,就加160ul,一点也不麻烦。另外，最近天气比较热，老板又舍不得一大早就开空调的话，胶凝得很快也不均匀，ap可以稍微少加一点，我一般5ml 15%的胶就加30ul,不影响凝胶。蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加pmsf，建议在上柱子洗脱的时候也加pmsf（蛋白降解抑制剂），一定要用之前再加。做透析的时候，拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在5ml枪头下端，扎紧得那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的麻烦，对同一个蛋白大量多次透析非常方便第一次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因为没分都没法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实验技巧给大家分享。1. 配sds-page胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。还有一条忘了说， 电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h到2h，脱色也要2h左右，麻烦的很。现在给大家说一个简单的方法，是我从一个师姐那里学到的。加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。看见大家都在献计，我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。1、配胶时一定要掌握好时间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大，压不成条带，且消耗很多试剂和时间。2、加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为sds的原因吧？3、对于大分子蛋白质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以适当减少。4、在跑样时同时加入marker有助于正确识别所需的蛋白位置，减少nc膜的消耗。5、一抗、二抗的浓度不要太高。6、做ecl显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以减少定影液变黄。7、和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流绝对有助于试验的成功。这是我目前的一点拙见。作western时候，用5ml得小平皿装一抗二抗，装一点刚没过膜就行，省的用膜或者塑料袋，也浪费不了多少，稀释后的抗体可以放在4度，一周没问题，用3，4次也没问题。推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。我也来说一条小经验：做蓝白斑筛选的时候，通常要用到x-gal 和 iptg，但是，我做了几次后发现，每次的蓝班的比例都非常低，不足（载体用的是pmd18-t）,所以我就想：到底有没有必要非得加x-gal 和 iptg？它俩的作用就是让阴性克隆显蓝色，既然阴性克隆的比例这么低，就不用非得加，它俩价钱较贵，还有毒（x-gal需要用二甲基甲酰胺来溶解，而二甲基甲酰胺毒性较大，还有致癌作用）所以，前几天做克隆的时候，我就没加x-gal 和 iptg，挑单菌落的时候就只挑了最先长出来的个大菌落，结果这四个全都是阳性克隆！所以，做克隆的时候，x-gal 和 iptg可以不必加（我用的载体是pmd18-t，估计对其他类型的载体也适用），大不了多挑几个单菌落，小量快提质粒鉴定的时候也不会增加多少工作量我也来一个:做wb时,样品比较多, 又怕放时间长了对蛋白样品不好,而且确定以后肯定要做某个抗体,只是一时没有决定.那么你可以选择先做sds-page,并转膜. 然后把pvdf膜凉干, 放四度保存. 以后拿出来封闭后,加抗体就行了. 蛋白在膜上,且已经分离, 比保存在buffer里面的蛋白肯定更可靠。呵呵 今天作his纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较多，几百ml，而柱子不够大，只有10几ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太麻烦了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了，没有问题，现在调低速度，过夜上样：）我们实验室的电泳仪年头久了，制胶板的垫子铺不平等种种原因，导致胶总是缓慢的渗漏，我从一位老师处学来用胶封底，很好用。封底胶：水800ul30%或40%的丙烯酰胺 800ul10%aps 40-50ultemed 8ul加好temed后，迅速混匀，用枪一面加700或800ul，不出1-2分钟，肯定凝。然后，再依次加分离胶和积层胶。不影响电泳，和蛋白的移动，我试过n次。 能导致page胶不凝的原因主要有三个：1、配胶中用到的主要试剂的配置。主要就是30的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page胶不凝。2、温度。温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。3、氧气。氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和nc膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%sds，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的nc膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。我也说两句吧关于sdspage染色，我们实验室的通常做法也是加热（和piaorumeng_1的做法相似），一般是将其放置于70左右的水浴中，染色半小时，脱色半小时。基本上和正常染色效果一样。我做2维蛋白电泳，也有些心得：1、向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。2、 能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。凑个热闹说两句吧1、sds-page胶如果配好装好倒入内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪费已经加进去的内槽液2、至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇20分钟；如果染液不是新配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可脱色也一直是用去离子水煮两三次即可3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎100%。可以第一个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度20min）然后直接向里面补第二个酶或者第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白最彻底前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了俺也来说说关于bradford法蛋白浓度定量和dtnb法巯基浓度定量的一点体会：我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来，也有半年有余；最大的体会就是不要急于求成，直接实验，首先检测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在595nm和412nm下有特定的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响，其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（anal biochem. 1998 dec 1;265(1):8-14），而dtnb本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干扰是最佳的了。考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的kimwipes纸（国外实验室常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造），由于染料吸附到纸纤维上，脱色加速。 待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会溶掉。半贴壁细胞如sp/0或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适当拍打培养瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。注意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧剪一小段胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验结果做单克隆抗体时千万不要目测，一定要细胞计数wb加一抗二抗时，可将膜放于一次性手套里，用封口器封口，置于摇床上，而且只把抗体加到有蛋白的一面上即可，非常节省我也推荐几条：1、关于20021108战友的说法，我觉得我们制备好了一批感受态，最好马上转化一种已知质粒，与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因为我也曾经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功，但是当时不知道，结果费时费力。2、做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点一下，标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。3、抽提质粒时，加入sloution ii和iii后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。4、抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以30min，否则8-10min也可以。至于温度，个人觉得-20度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好！今天想到这些，先写到这里，以后想到了在上来与大家分享。希望我的小经验对大家有所帮助！ 首先声明：实验中的一些技巧要用在首先对基本的操作有深刻了解的基础上，在力求省时、省力、节约成本等的同时，实验的准确性是最重要的。对大多数做蛋白的战友们来说，培养细胞应该是不陌生的，我这里谈一个培养细胞的小技巧，大家知道，对于一定的空间（如某种尺寸的细胞培养瓶）来说，细胞数目太多或者太少都不利于其生长，太多了就要消化，太少了要换一个小点儿的培养瓶，我的做法是：如果细胞数目太少，可以不必去找小一点儿的培养瓶，可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放，这样底部的空间就小了，有利于细胞的生长，当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过来，避免了来回换培养瓶而增加污染的机会（对没有小培养瓶的更实用）。个人体会，仅供参考。 1） 可将sdspage的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10ap，temed不加，切记！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入ap，temed即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。2） 说说个人认为跑好sds-page胶的一些体会。1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。3. ap分装成500微升一管保存放-20度，避免ap用太久失效。4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。8. 尽量在冰浴状态下跑。3） . 配sds-page胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。4） 推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。5） 我们实验室的电泳仪年头久了，制胶板的垫子铺不平等种种原因，导致胶总是缓慢的渗漏，我从一位老师处学来用胶封底，很好用。封底胶：水800ul30%或40%的丙烯酰胺 800ul10%aps 40-50ultemed 8ul加好temed后，迅速混匀，用枪一面加700或800ul，不出1-2分钟，肯定凝。然后，再依次加分离胶和积层胶。不影响电泳，和蛋白的移动，我试过n次。6） 能导致page胶不凝的原因主要有三个：1、配胶中用到的主要试剂的配置。主要就是30的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page胶不凝。2、温度。温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。3、氧气。氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。7） ）可将sdspage的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10ap，temed不加，切记！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入ap，temed即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可以提高电泳至150v，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省，不需1h即可看结果了8） 斑竹楼主均赠我以高帽，天气虽然热，受之也欣然。虽然不做实验久矣，略作回忆，信手再拈上几条“窍门”，作为回馈。1，小提质粒：将amp浓度提高到200ug/ml，下班前接种，次日一早收获菌体，此时od虽然不高，质粒丰度却不一般！菌体量少些，操作体积（管数）也小（少）。2，质粒酶切：双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。3，tricine电泳做起来比较麻烦，有时试剂也不凑手。15%的sds-page用2x tris-gly 缓冲液跑，914kd的小蛋白分离效果也非常好。4，没有acta express的实验室，做蛋白层析纯化，采用医院输液的瓶子和输液软管，调整瓶子的高度和软管上的卡子，可以方便地控制流速。采用买来的注射用水（500ml/瓶）配制溶液（可以灭菌或超滤），还能较好地在普通实验室控制外源热源质的污染。（以上两条记得在我另外的帖子里也顺便提到过）5，我们原先实验室的pcr仪中，存有一个“懒汉”程序。94度40秒/63度90秒，专门用于从已知序列和丰度的模板（如质粒）上扩增500bp以下的片断。当然事先还得知道引物的tm是否适合在63度复性。6，用大离心机（非台式），比如大提质粒、大量提取包含体、离心蛋白溶液，可以比“分子克隆”上要求的时间稍短一些，因为大转子启动和停止的时间比较长。7，做等点聚焦电泳，胶浓度低容易破碎，剥胶时可以将其放在装有纯水的大培养皿内操作。呵呵，下班了。再次说明，“窍门”未必屡试不爽。9） 我也发一条，呵呵，在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试10） 我也推荐几个偷懒的方法1 做sds-page跑胶通常都是现配现用,但配胶要1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.2 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响.3 推荐一个节约抗体/时间的做法:同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果