国家自然科学基金青年基金项目研究方案抑郁症肝气郁证患者抑郁眼神识别与关键指标探索.doc

/sundae_meng国家自然科学基金青年基金项目研究方案项目名称：抑郁症肝气郁证患者抑郁眼神识别与关键指标探索项目编号： 项目负责人： 一、研究目标（一）初步揭示抑郁眼神与抑郁情绪体验关系（二）初步揭示抑郁眼神与肝失疏泄深层关系二、研究内容（一）抑郁症患者抑郁眼神的模式识别研究（二）抑郁症患者抑郁眼神与体内关键指标关系研究三、研究方案（一）抑郁症患者抑郁眼神的识别研究1. 抑郁症患者眼动研究1.1研究对象1.1.1 对象来源 病例组：150例来自山东省精神卫生中心、济南市中心医院情志病研究中心对照组：50例来自山东中医药大学学生、教师健康志愿者。1.1.2诊断标准抑郁症诊断标准采用抑郁症国际疾病分类第十次修订本（ICD-10）诊断标准；汉密尔顿抑郁量表( HAMD) 24项评分20分；中医证候诊断标准中医辨证标准依据课题组前期研究制定的辨证标准。1.1.3病情严重程度标准依据ICD-10关于抑郁症的分类与诊断标准，分为轻度（F32.0）、中度（F32.l）、重度（F32.2不伴精神病性症状）1.1.4纳入标准抑郁症组 符合上述抑郁症西医诊断标准； 符合上述抑郁症中医证候辨证标准；年龄在18-65岁；躯体检查未发现脑、心、肝、肾等系统明显异常者；色觉正常、裸眼或矫正视力正常；文化程度为初中以上；经专家判别后有抑郁表情及眼神；自愿签署进入研究知情同意书；对照组年龄在18-65岁；目前精神状况良好，既往无精神疾病史；无严重躯体疾病；色觉正常、裸眼或矫正视力正常；文化程度为初中以上；自愿签署进入研究知情同意书；年龄、性别、文化程度分布与抑郁症组相匹配；1.1.5排除标准无法合作者或不愿合作者；排除器质性脑疾病排除精神发育迟滞排除任何动眼神经功能障碍排除双相情感障碍、精神分裂症等严重精神病者；排除药物依赖或酒精依赖者；1.2仪器设备实验采用SMI公司生产的iView X RED 500眼动仪，采用瞳孔+角膜反射模式记录。采样率达500HZ，可追踪水平平位置40，垂直位置60范围内的眼球运动变化，追踪分辨率为0.03 (typ) ，凝视精度 0.4 (typ.)，系统延迟=512x424;USB 3.0;水平视角=70度;垂直视角=60度。 相机分辨率1000w像素，摄像机视频记录分辨率1080P，大于等于30fps。音频采集使用Kinect附带设备。被试的头部与采集设备等高，被试对象与相机距离：深度相机100cm130cm，相机和摄像机120cm150cm，实验环境光照充足，蓝色背景，实验程序用VC编制。设备布置方案：Kinect位于被试正前方，角度5度，距离100cm130cm。摄像机和相机位于被试前方，角度10度。2.3 刺激任务2.3.1 模仿表情播放中立表情以及六种基本表情，要求被试模仿其表情，由相机拍摄记录。2.3.2回答特定问题每个被试均完成HAMD量表问题，并记录其回答问题时地面部表情和头部姿态，同时录音。2.3.3观看情感图片每个被试均完成国际情感图片系统测试，选取愉悦度评估为 1 3 (负性情绪图片 )、4 6(中性情绪图片 )、5 7(正性情绪图片 )图片各 10张。在每一次情绪诱发过程中, 每张负性、正性和中性情绪图片均呈现 18 s, 每一类图片随机呈现 2次, 每一类情绪刺激时间均为 6min。2.4实验流程分为三个阶段，第一阶段采集被试面部基本表情，第二阶段进行回答特定问题任务，第三阶段进行观看情感图片任务。2.4.1第一阶段采集被试面部基本表情实验前向被试讲解规则，通过提问确认被试理解,并签署知情同意书；被试进入实验室，适应实验室环境；被试坐在距离采集设备120cm处的被试椅上；播放中立表情以及六种基本表情，要求被试模仿其表情，由相机拍摄记录；2.4.2第二阶段回答特定问题任务被试坐在距离采集设备120cm处的被试椅上；医生对其进行HAMD测试，采集设备记录相应视频（包括深度相机）和音频。2.4.3第三阶段观看情感图片任务每个被试均完成国际情感图片系统测试，选取愉悦度评估为 1 3 (负性情绪图片 )、4 6(中性情绪图片 )、5 7(正性情绪图片 )图片各 10张。在每一次情绪诱发过程中, 每张负性、正性和中性情绪图片均呈现 18 s, 每一类图片随机呈现 2次, 每一类情绪刺激时间均为 6min。同时记录视频和音频，视频。以上各阶段实验任务完成后，给被试感谢和奖励。2.5数据处理2.5.1 图像和视频数据处理对采集的面部图像进行按FACS编码系统要求的特征点进行人工标定，标定后图像集使用AAM进行训练。对视频数据按10s一段进行分割，使用特定被试对象AAM模型对其进行自动匹配，确定每帧的FACS参数。确定每段内FACS参数变化和段间参数变化率。2.5.2 音频数据处理使用PRAAT对音频进行处理。2. 抑郁症患者抑郁眼神与与体内关键指标关系2.1抑郁症抑郁表情眼神患者脑功能活动状态2.1.1研究对象经专家判别及计算机识别为典型抑郁表情、眼神的抑郁症患者及正常对照各30例。患者及正常在年龄、性别等一般情况匹配。2.1.2 实验仪器fMRI数据拟在山东省医学影像研究所放射科Magnet Achieva 3.0TTX超导MR仪，颅脑八通道相控阵线圈(型号：Release ，荷兰Philips产品)。2.1.3 fMRI数据采集成像参数：重复时间（TR）/回波时间（TE）: 8.3/3.8；视野（FOV）:240mm240mm160mm(FH=240mm，AP=240mm，RL=160mm)；翻转角（flip anger）：8；层数(slice)：160。2.1.4数据处理和统计基于matlab平台的SPM8软件以及rest软件进行图片处理，采用低频振幅ALFF分析。采用单样本t检验，每个簇块体积阈值（Cluster）大于389个连续体素，单体素阈值P0.05(校正后)的脑区定义为差异有统计学意义的区域，病例组和对照组采用双样本t检验。2.2抑郁症抑郁眼神患者外周血指标变化2.2.1研究对象经专家判别及计算机识别为典型抑郁表情及眼神的抑郁症患者及正常对照各30例。患者及正常在年龄、性别等一般情况匹配。2.2.2仪器设备高效液相色谱仪（Agilent1100）、色谱柱、进样针（20L）、LB4自动平衡微量离心机（北京医用离心机厂）、涡旋混匀仪、高速低温离心机、冰箱(4,20)、0.22m微孔滤膜、OLYMPUS显微镜（日本）、盖玻片、载玻片。2.2.3采血时间和方法 上午8:00-11:00，采集上肢静脉取血 4ml，放入离心机内以 3000r/min 转速离心 20min，取上层血清冷藏送检。2.2.4微观指标检测方法血清NE、DA、5HT含量的检测采用 HPLCECD 法测定。分别精密称取 NE、DA、5HT 及 GABA 的标准品适量，使用流动相（甲醇 18%(v/v)乙酸钠100mmol/l，柠檬酸85mmol/l，正二丁胺0.4mmol/l，辛烷基磺酸钠1.5mmol/l，乙二胺四乙酸(EDTA)0.2mmol/l，调 PH 值为 3.7。）将其稀释成 300g/ml 作为标准对照液。供试液的制备：1.5mlEP 管内加入采集的血清样品 200l，然后添加 5HClO4(v:v)溶液 200l，盖盖混匀，25保存 20min，待血清中的蛋白质完全沉淀后，于低温离心机中采用 4，10000r/min 离心 15min。然后将上清液使用 0.22m 微孔滤膜过滤。待检组织的制备：将精确称量的脑组织加入含有预冷的 1ml0.5%HClO4的玻璃匀浆器中，置于冰水浴中匀浆。取匀浆液放入低温离心机中，采用 43500r/min 离心 15min。色谱条件：参照文献并加以改进。采用 ZORBASBC18 柱(5m，4.6mm250mmAgilent)作为色谱柱；将柱温设为 18；工作电压设为 0.4mv；量程设为 1A；设置流速为 0.9ml/min；进样 20ul。2.2.5数据统计分析实验数据的统计分析采用 spss16.0。分析方法为：两样本平均值的对比采用t检验。平滑追踪眼动眼动特征正向眼跳和方向眼跳固视运动 静脉血脑功能活动状态NE/DA/5-HT关键部分微观机制功能fMRI四、质量控制（一）控制偏倚1、研究者调查前进行专业培训，充分理解调查表中指导语及各条目的含义，充分理解临床试验方案及其各项标准操作规程，所有参加测评的研究人员集中统一培训，实际操作评定一致率达85 ；2、主要调查者为本课题组研究生，并相对固定，主要研究者应具备副主任医师以上资格，并相对固定；3、应尽可能地保证受试者的依从性，做好受试者的工作使其理解此项工作的意义，如调查前向受试者讲明此项调查的意义、对个人隐私的保护、如何读懂指导语、如何填选答案等；4、填写量表一律使用钢笔或碳素笔，量表作为原始记录，不得更改，做任何更正时不得改变原始记录，只能采用附加叙述说明理由。5、调查完毕，当场逐项仔细检查量表，如有漏项，请受试者及时补齐，以保证每份量表的完整性与真实性；6、由未参加数据录入和核查的人员担任数据库的抽样核查工作，随机抽取不少于1的问卷，对其中内容进行100复查；7、对不完整问卷及明显填写不认真的问卷进行剔除；8、调查、核查、录入三者分离，防止每个环节发生主观干扰。（二）fMRI采集规范 1、fMRI采集有专人进行。2、正式实验前通知合格的受试者并对其详细说明fMRI的注意事项，如不要携带有金属的头饰、眼镜、耳钉、手链、腰带，不要穿有金属配件的衣服。介绍实验过程会有6min的3D结构图像扫描和 8min的静息态扫描时间。3、扫描前，让受试者熟悉扫描室环境，减少焦虑，以防止其实验过程中出现紧张恐惧等不良情绪或头动等影响实验结果；提醒受试者认真观看上方屏幕的指导语及图片，由于头动会严重影响图像质量，尽量提醒受试者避免头动；嘱受试者使用泡沫耳塞隔离实验过程中的噪音，降低其所受噪音侵扰程度。4、受试者采取仰卧位，头部放置于头线圈中央，并用海绵垫填充头部与线圈之间空间，以达到控制头动的效果。询问受试者头颈部在扫描允许条件下是否舒适，如果舒适，让受试者闭上眼睛，实验人员操作使其进入扫描仓。5、实验人员通过麦克询问受试者是否舒服，并告知受试者现在进行6min的3D结构图像扫描，请放松不要睡觉。6、3D结构图像扫描结束后，实验人员提醒受试者实验要开始了，请放松做好准备，进行8min的静息态扫描时间。11、扫描结束后，实验人员操作机器让受试者出仓，询问受试者是否有什么不适并表示感谢，安排其进行休息。（三）血样采集规范1. 采血管：BD真空采血管（Vacutainer， 5ml），采血管统一采用美国BD，Vacutainer金黄色头真空采血管（促凝剂，胶），北京美科美美科美(北京)生物医学科技有限公司提供。2. 采血时间：上午8:00-12:00；3. 在受试者的穿刺位以上约58厘米处紧紧地系上止血带，但不能太紧以至受试者不舒服，止血带的捆绑时间不应超过1分钟。4. 嘱受试者握紧拳头，选择合适的血管：当轻压或轻拍时能感觉其回弹的静脉即为合适血管。最常用的选择部位是血管丰富并且血管贴近皮肤表层的肘前区域。5. 消毒：以穿刺点为圆心，用碘伏消毒，消毒范围为直径大约3厘米，注意消毒过的地方不能重复涂抹，在涂抹的过程中棉签必须也要同时旋转。如果手臂皮肤不足够干净的则需重新擦拭。6. 穿刺部位干燥，在洁净后不要触摸穿刺部位。 7. 静脉穿刺，将针头斜面朝上，使针与手臂成约15度角，使其方向与血管一致。8. 迅速地刺穿已选定的静脉，若观察到回血现象,说明针已经准确地刺入血管。嘱受试者松开拳头。9. 将瓶塞穿刺针（不要将乳胶护套拔下）从采血管中心垂直刺入真空管内，管中预设的真空将使所需要的血液流入管中，应按管壁上的刻度值控制采血量，管中的负压可将管中残存的约0.4ml的血吸入管内。10. 采血至规定量后，将针头抽离静脉，轻轻地把注射器往上拉动，退针。防止血液从针头滴下。11. 请受试人自行轻压棉签35分钟。手臂需举至高于心脏水平位置以控制血流。12. 采样后立即轻轻倒置真空管五至八次，以保证血液与管内附加剂正确混合。13. 等待标本充分凝固需要放置30min, 至凝固后使用水平离心机进行血清分离，4低温离心，离心半径8cm，离心速度维持在3500r/min（离心力1000-1200g）离心10min。如凝固不完全或离心转速偏度会造成溶血。14. 血清与血凝块完全被分离胶分离,血清标本可直接检测，本课题要求分装至2个1.5ml的离心管中，但是必须注意由于血清制品的危险性，尽量采取必要的保护措施，采用预先经消毒处理的离心管，以Parafilm封口膜密封关口。15. 采样编码：为配合样品管理，采集的样品编码采用编号加姓名，编码打印纸要耐磨、在低温(-80)和高温(50)下粘贴牢固，且防水、防潮，编码打印纸的大小规格控制在0.5 cm3 cm，便于粘贴。标签纸外面要用透明胶带包裹，防止保存过程中标签脱落粘贴。采样编号时要注意方向，应使编码打印纸与采血管或离心管平行。16. 保存与运输：处理后的血样用标准冰