吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与冠心病的相关性研究.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与冠心病的相关性研究（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的探讨吸烟者内皮型一氧化氮合酶基因（eNOS）G894T多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的发生及其严重程度间的关系。方法 将203例吸烟者和182例非吸烟者根据冠状动脉造影结果分为冠心病组(196例)和对照组(189例)，以冠状动脉病变支数判定严重程度。以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测eNOS基因G894T多态性，按吸烟与否分析G894T多态性与冠心病的关系。结果 冠心病组GT+TT基因型分布与T基因突变频数明显高于对照组（24.26、6.21，P均0.05）；吸烟者基因GT+ TT 型及T 等位基因频率均显著高于非吸烟者(25.82、5.77，P均0.05)；冠心病组eNOS基因型分布在单支与多支病变组之间差异无统计学意义（23.36，P0.05），而吸烟的冠心病患者差异有统计学意义（26.48，P0.05），吸烟的GG+TT型者更可能发生多支病变，OR3.42，95CI（1.4404.400）。结论 eNOS894位点GT、吸烟与冠心病的发生及其严重程度间的关系密切。 【关键词】 冠心病 内皮型一氧化氮合酶基因 G894T多态性 吸烟 To investigate the relationship between the eNOS G894T polymorphism and the presence and the severity of coronary artery disease (CAD) concerning with smoking. Methods All patients were divided into two groups of CAD and non CAD, including 203 smokers and 182 cases without smoking by coronary angiograms. The severity of CAD was expressed by the number of affected vessels. Polymerase chain reaction (PCR) with restriction fragment length polymorphism analysis was used to detect the G894T variant of the eNOS gene in 196 patients with CAD and 189 controls. The relationship between CAD and G894T polymorphism was analyzed based on smoking or not. Results The frequency of the eNOS GT and TT genotypes in the CAD group was more than that in control group（24.26,P0.05）, allele frequency was significantly different（26.21,P0.05）;there were significantly differences between smokers and those without smoking too(25.82，5.77，P0.05); the frequency of the eNOS GT and TT genotypes between the different number of affected vessels was not significantly different in CAD（23.36，P0.05），but it was significantly different in smokers with CAD（26.48，P0.05）; the coexistence of the 894 GT or TT genotypes and smoking led to an increased risk of severe CAD, OR3.42，95CI 1.4404.400. Conclusions These findings suggest that the G894T polymorphism of the eNOS gene, smoking were associated with the presence and the severity of CAD. coronary artery disease；endothelial nitric oxide synthase gene；G894T polymorphism；smoking 高血压、高脂血症、吸烟、糖尿病等作为冠心病的危险因素已被广泛接受，但控制这些传统的冠心病危险因素并不能完全阻止动脉粥样硬化的发展，目前其一级预防和二级预防的成绩与逐年上升的发病率、死亡率相比不容乐观。因此，遗传因素和环境因素日益受到重视。本研究通过对吸烟者的内皮型一氧化氮合酶eNOS基因G894T多态性分析吸烟者eNOS基因G894T多态性与冠心病的关系，从而初步了解传统的冠心病危险因素、遗传因素在冠心病发生、发展中的相互作用。 1资料与方法 1.1一般资料入选对象385例均为2004年11月至2006年10月浙江大学医学院附属第二医院的住院患者，包括203例吸烟者和182例非吸烟者。所有患者之间无血缘关系。全部经冠状动脉造影检查，由两位有经验的心内科及放射科医师共同进行分析作出判断。左冠状动脉主干、前降支、旋支及右冠状动脉中任一支的内径变窄50%判定为狭窄性病变，并根据累及支数定义为单支、双支和三支病变, 累及左主干者记为双支病变，统计病变血管支数。根据造影结果分为冠心病组和对照组(非冠心病组)。两组一般资料见表1，两组在性别、年龄、血脂水平和高血压、糖尿病比例等方面比较，差异均无统计学意义（P均0.05）。 1.2标本收集及eNOS基因检测抽外周静脉血5ml, 用枸缘酸钠抗凝, 按快速盐析法提取eNOS DNA。采用PCR扩增eNOS基因的特异片段。引物参照Hingorani 等1设计,其核苷酸序列为引物A: 5- CATGAGGCTCAGCCCCAGAA C-3和引物B: 5-AGTCAATCCCTTTGGTGC TCAC-3。PCR 反应体系为25l,含10PCR 缓冲液 2.5l, 样本DNA 2.5l, Taq DNA聚合酶 0.25l (1U), dNTP 0.5l,MgCl2 1.5l,引物终浓度均为0.5mol/L 。PCR程序：95热启动5 min后,95变性45s, 60退火45s, 72延伸1min; 共30个循环后, 72延伸5min 后冷却至4。限制性内切酶分析: 取扩增产物10l, 加入10酶切缓冲液2l, 双蒸水7l,混匀后,加1lMboI酶(10U)混匀, 37酶切16h(上述引物与试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。 1.3统计学方法以直接计数法计算CAD组患者和对照组的基因型和等位基因频率。资料分析应用SPSS10.0软件包作统计学处理。遗传平衡吻合度2检验群体基因型分布是否符合Hardy- Weinberg平衡定律。组间均数间统计学差异用t检验,各组基因型和等位基因频率之间的比较用2检验，相对危险度以比值比（OR）的95的可信区间（95CI）来表示，设P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1PCR产物MboI酶切后电泳图谱GG基因型含206bp 1条带； GT型含206bp、119bp、87bp 3条带； TT型含119bp、87bp 2条带(见图1)。 2.2本研究中385例研究对象eNOS基因型分布 GG型314例、GT型66例、TT型5例。基因型频率经计算分别为0.8156、0.1714和0.01299 。G、T等位基因频率分别为0.9013 和0.0987。通过吻合度检验,eNOS基因型和等位基因频率的分布符合Hardy-Weinberg 平衡(20.12 , P0.05) ,说明样本具有良好的代表性,不存在选择偏倚。 2.3冠心病组与对照组基因型分布及等位基因频率比较见表2 由表2可见，基因型分布及等位基因频率在冠心病组与对照组间比较均有统计学意义（24.26、6.21，P均0.05）；在冠心病组吸烟者与对照组间比较差异有统计学意义（27.97、10.58，P均0.01）。 2.4吸烟者与非吸烟者基因型分布及等位基因频率比较见表3 由表3可见，吸烟者与非吸烟者基因型分布及等位基因频率比较差异有统计学意义（25.82、5.77，P均0.05）。 2.5单支病变与多支病变基因型分布对比见表4。 由表4可见，基因型分布在冠心病组单支病变者与多支病变者间比较差异无统计学意义（23.36，P0.05），而在吸烟的冠心病单支病变者与多支病变者间比较差异有统计学意义（26.48，P0.05），且与冠心病组比较，吸烟合并GT或TT的冠心病者患多支病变风险增高，OR(95Cl)为3.42(1.4404.400)，P0.01。 3讨论 冠心病的病理基础是冠状动脉粥样粥样硬化引起的冠状动脉狭窄、斑块的破裂和出血导致血栓形成,吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病等危险因素都可能引起血管内皮结构不完整和功能不完全, 使NO 生成和释放减少, NO抑制血小板和白细胞粘附功能减弱,血小板等有形成分大量粘附聚集形成血栓, 引起血管腔狭窄, 甚至急性闭塞； NO抑制血管平滑肌细胞增生作用减弱, 平滑肌细胞大量增生和迁移, 加速了动脉粥样硬化。因此,冠心病的发生、发展可能与eNOS 基因变异有关。而且，这种变异可能与前述各种传统的危险因素有密切关系。eNOS基因G894T多态性是指位于eNOS基因第7 外显子上894 位点的鸟嘌呤（G）转换为胸腺嘧啶（T），而出现不同于野生型GG的变异基因型GT、TT。G894T 突变使编码的第298位谷氨酸被天门冬氨酸所取代，引起eNOS 活性降低。国外对G894T多态性与冠心病相关性的研究较多26,但结果差异较大，不同种族被认为是世界范围内研究没有一致结果的最重要原因之一。然而，在以同一种族为对象的研究结果也不尽相同5，6，比较一致的是几乎相关研究都认为冠心病患者eNOS 基因G894T 突变频率在单支、双支和多支病变组之间差异均无统计学意义。 在本次研究中发现冠心病组与对照组比较eNOS 基因GT+ TT 型分布及T 等位基因频率有显著差异，且突变的纯合型TT仅发生在冠心病组，说明G894T基因突变可增加个体对冠心病的易感性。同时，本研究将所有吸烟者与非吸烟者进行比较，以了解吸烟与G894T基因突变间的相互关系，结果发现吸烟者基因GT+ TT 型及T 等位基因频率均显著高于非吸烟者（P0.05），提示吸烟可能诱发G894T基因突变。因此我们推断吸烟者可能通过增加G894T基因突变而更易患冠心病。为了证实这一点，本研究还将冠心病组中的吸烟者与对照组基因GT+ TT 型分布及T 等位基因频率分别进行比较，发现结果正如上述推测显示出更明显的差别（P0.01）。 在进一步对冠心病组单支病变组与多支（双支和三支）病变组基因型分布对比后，发现吸烟与G894T基因突变对冠心病的影响外。与大多数研究得出的结论一样，本研究冠心病单支病变与多支病变间基因型分布无显著性差异，但在冠心病吸烟者中GT+ TT 型在两组间分布表现出显著性差异，通过相对危险度的计算我们发现，与冠心病组比较，吸烟合并GT或TT的冠心病者患多支病变风险上升3.42倍。可见，吸烟与G894T基因突变同时存在可能使冠状动脉病变范围更广。 目前吸烟、eNOS基因G894T 突变与冠心病具体的作用机制还不明确，我们国家关于eNOS基因G894T 突变与其他传统冠心病危险因素关系方面的研究还比较少，且结果也不一致，魏丹宏等7认为它可能是中国人冠心病的一个独立的危险因素；而齐霁等8认为大量吸烟可能诱发eNOS基因突变；本次研究不仅支持吸烟可能诱发eNOS基因突变，而且还提示两者在冠心病的发生、发展过程中相辅相成、协同作用。但是由于方法和技术还很有限，冠心病作为受环境和遗传诸多因素影响的一类复杂疾病,本实验仅通过一个角度窥豹一斑。今后随着基因芯片等技术开发推广可能为eNOS基因与其他基因联合检测提供方便，深化冠心病易感性的研究，为同一种族中的不同研究结果做出合理解释。【参考文献】 Hingorami AD, Liang CF, Fatibene J. et al. 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