不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响

1 / 10 不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响 不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响 棉花的黄萎病为一种土传性病害，致病菌有大丽轮枝菌和黑白轮枝菌 1，早在 20 世纪 90 年代，张绪振等 2研究发现，中国棉花黄萎病的致病菌主要为大丽轮枝菌。大丽轮枝菌的寄主范围广，目前已达到 660 多种，且该病原菌的变异程度高，产生的微菌核的抗逆性非常强，可在土壤中存活超过 10 年 2，是棉花上的一种主要病害 3， 4，在中国的四大棉区都存在着较大的影响，目前尚未找到能够控制该病害发生的有效 措施。 笔者在进行菌株的致病力测定时本文由论文联盟，从华中农业大学张献龙实验室得到了一株纯合的对照菌株 养性状为黑色菌核型，致病力强。经过多次继代培养后，角变得到一株白色的菌株，为菌丝型，气生菌丝茂盛，经查氏培养基接种后致病力明显弱于 其性状可以得到稳定的遗传。经过 子鉴定发现弱毒株和强毒株的 列完全相同，但生物学特性及致病力完全不同。 由于大丽轮枝菌的变异性非常强，在常规的 养基上极易发生变异，经过多次继代培养后，菌株的致病力也会2 / 10 发 生减退。 养基作为一种半合成培养基，用于产孢或扩繁菌种较适合，但不适于研究培养条件对菌株的影响。查氏培养液作为组分已知的一种培养基，常用于黄萎病菌的扩大培养，继而对鉴别寄主进行根部接种。真菌的生长需要钾，在丛生真菌中，缺钾和钾过量对真菌的生长都不利 5。而且胞内 K+的大量积累对维持有机体的正常功能至关重要， K+的丢失会导致多种代谢途径如糖酵解和呼吸作用等受阻6。查氏液体培养基中钾、钠含量和钾钠比是已知的，因此本试验通过调整其中的 K+/对培养基组分进行改进，用于培养菌株，观察并记录其生理生 化特性以及菌株的致病性，阐明培养基中 K+、 其比值变化对目的菌株的影响，以及它们与菌株致病性的关系，为病原菌的致病机理提供理论依据。 1 材料与方法 供试菌株 大丽轮枝菌菌株 色突变株 华中农业大学实验室提供；对照菌株 中国农业科学院棉花研究所提供。 试验设置 试验设置以常规的查氏液体培养基为基础，钠盐和钾盐的用量及钾钠比见表 1，其中无钠培养基 等摩尔的硝酸钾代替硝酸钠；无钾培养基 等摩尔的磷3 / 10 酸氢二钠代替磷酸 氢二钾，以等摩尔的氯化钠代替氯化钾。其余成分均不变，分别为蔗糖 g、硫酸镁 g、硫酸亚铁、琼脂 g、去离子水 1 000 规的查氏培养液的成分参见文献 6，为减少沉淀将磷酸盐分别灭菌，冷却后在无菌条件下加入到培养基中 7，其中 K+/ 1 。 调查内容及方法 病原菌接种于 养基上培养 d，沿菌落外缘打孔，菌饼直径 转接到不同 K+/的查氏固体培养基中，分别标记为 于 培养箱中黑暗静置培养，每隔 1 d 观察菌落生物学 性状并用十字交叉法测量菌落直径。调查菌落质地、菌落形成特征、菌落颜色、色素有无、培养温度、培养基类型、测量时间和菌株生长速率，培养 1d 后，结束调查。 接种病原菌的制备 参照 “” 中的查氏培养基的成分，依次称重，将培养液 100 入 250 角瓶内， 121 、条件下灭菌 30 后将在 板中生长 1d 的供试菌株用的打孔器打成菌碟，接入到查氏液体培养液中，在 2黑暗条件下， 120 r/荡培养 1d。 棉苗的致病力测定 种子经硫酸脱绒后 ，每个品种挑选饱满的棉种，播种前用 70%的乙醇浸泡 5%的 泡 h，无菌水冲洗 2 3 遍。采用无土基质育苗技术育苗，将棉子播下 8。保证苗床的湿度和温度，培养棉苗 2d 至 2 34 / 10 片真叶时，即可接种。取每个品种 60 株棉苗，保持根部基本整齐一致，置于同一菌系的菌液中，使根充分接触菌液。裸苗浸根接种 30 移栽至营养钵中。在网室内放置最低最高温度表，记载每天的温度状况，均温 2 左右。观察和记录病害的发生情况，分别于 15、 20、 2d 调查发病率及病情指数。 数据分析 采用单因素方差分析和 s 新复极差测验的多重比较分析试验数据。 結果与分析 不同处理条件下培养基对不同菌株生物学性状的影响 不同处理条件下，对病原菌的培养性状表型的影响如图1、图 2 所示。 由图 1 可知， 低钾至高钾查氏固体培养基中均出现微菌核，但微菌核数量上有一定差异。从形态上看，无钾培养基上的菌落中的气生菌丝均匀分布于菌落表面，微菌核数量多，但生长受到了明显的抑制。不同钾钠比的查氏固体培养基上的 株气生菌丝明显减少，且菌丝非常稀疏，零星散布于菌落表面。 由图 2 可知， 低钾至高钾查氏固体培养基上均无微菌核产 生，气生菌丝在菌落表面均有分布，在不同钾钠比的查氏固体培养基上 株气生菌丝较短，且稀疏很多，仅在菌落表面产生很薄的一层菌丝。无钾条件下， 落生长5 / 10 抑制明显，几乎无气生菌丝，整个菌落呈膜状。 由表 2 可知， K+浓度高低对微菌核的产生有影响， K+/的固体培养基条件下， 微菌核产量最大，整个菌落都呈黑色，且对菌株的生长无显著影响。无钾处理中，菌落中同样存在微菌核，但菌落直径明显低于其他处理，只相当于其他处理菌株生长直径的 40%左右。说明在真菌生长 过程中钾离子对真菌生长有较大影响，对微菌核的产生也有影响，但非必要影响因素，在 K+/的固体培养基条件下， K+浓度对微菌核产量的影响最大。 +/查氏固体培养基对 微结构的影响 不同 K+/查氏固体培养基对 所示，主要表现在气生菌丝的浓密稀疏程度及培养基上菌丝的数量和微菌核的数量上。但从低钾到高钾培养基，能产生微菌核，对分生孢子大小、菌丝的分隔和微菌核的微观结构影响不大； 微观形态与常规 无明显差异，但无钾培养基对真菌产孢量影响较大 ，产孢量明显下降，菌丝体含量也明显下降。 +/查氏固体培养基对菌核型菌落产生微菌核时间的影响 由表 3 可知， 2 条件下， 不同 K+/查氏固体培养基上均能产生微菌核， 10 的微菌核出现在接种后 d， 微菌核出现在接种后 d，培养皿上均有明显的微菌核结构。 30 条件下，低K+/体培养基上未见微菌核结构， K+/以上的固体培养基上有部分出现微菌核，但总体上微菌核较少。 +/查氏固体培养基对菌落生长速 率的影响 在 2 条件下，从不同 K+/的查氏固体培养基菌落生长速率可以看出，菌落生长 d 达到最快生长速率。平均生长速率约 10 mm/d。 无钾培养基。从菌落直径上看，无钾培养基上菌株生长速率显著低于其他培养基，说明在真菌生长过程中，无钾条件会显著影响菌株生长直径。 在 30 条件下，除无钾培养基 ，其他不同 K+/查氏固体培养基的菌落生长速率无显著差异，可能是高温导致菌落的生长速度降低，使菌株之间的生长速率差异不显著。生长前期强弱毒株菌落的生长速率差异不明显，生长后期弱毒株 落生长速率高于强毒株 明 高温的耐受力强于 接种 2 周的菌落生长速率曲线可以看出，生长前中期， 长快于 置培养 2 周后， 长速率反而高于 +/氏固体培养基对菌落直径的影响 静置培养 1d，不同 K+/氏固体培养基上的菌落直径有一定的差异。对照 氏固体培养基上的菌落直径最7 / 10 大。在 2 条件下，高毒 株在低钾培养基与高钾培养基之间差异显著，高毒 低毒 株均与无钾处理 异极显著。高毒 低毒 25、 30 条件下，无钾处理 其 他处理间均差异极显著，说明无钾条件下， 够明显抑制真菌的生长，而无钠条件下， K+能够基本满足真菌生长的需求，弥足 缺失，使得真菌生长水平接近对照 +/氏液体培养基摇菌后对菌株致病力的调查 在温室条件下，将棉苗分成 3 组，进行组间显著性比较。3 种鉴别寄主 152025病指结果见表 8。 由表 8 可知，与对照 比，当 K+/较低水平时，随着 K+浓度的上升，菌株的致病力有所增强， 理中，强毒株 弱毒株 病指均高于对照 病指。当鉴别寄主接种 2， 病指高于 病指；病指与 病指相当。当 K+/于 20 以上时，菌株的致病力随着 K+浓度的升高而增强。 无 理中菌株的致病力有小幅度下降， 鉴别寄主接种 120 ，而 ； 鉴别寄主为 120 2，而 病指依次为、。 无 K+处理中菌株的致病力明显低于对照菌株， 10 在鉴别寄主为 120 2的病指依次为、，而病指依次为、和，分别低于 在 K+浓度不变的条件下， 病原菌的致病力初步呈正相关， 度升高， K+/低，病原菌的致病力表现为上升， 鉴别寄主为 120 2的病指分别为、，均高于 鉴别寄主为 120 2的病指分别为、，高于或近于 当 度下降， K+/上升，病原菌的致病力表现为下降。在 理中， 鉴别寄主为 2的病指为，明显高于 鉴别寄主为 2的病指为，高于 差异不显著。 小结与讨论 通过对不同 K+/氏固体培养基对菌株生物学特性的研究，结果表明，不同 K+/养条件对同一菌株的形态学无影响，但对同一菌株气生菌丝和微菌核的数量有影响。强毒株 +/的查氏固体培养基上，并且高于对照 在无 K+条件下同样有微菌核的产生。说明 K+浓度对微菌核的产生有一定影响，但非产生微菌核的必要影响因素， 在 K+浓度适中情况下会增加菌株微菌核的产量。 与 2 相比， 30 条件下不同培养基上微菌核数量有明显的下降，说明高温对微菌核的影响比培养基成分的影响更9 / 10 大。高温会抑制微菌核的产生，这与白应文等 9对轮枝孢微菌核特性的研究一致。 无 K+条件下， 25、 30 处理下强毒株 弱毒株 养皿的背面 的微菌核明显可见，气生菌丝稀疏且均勻散布在菌落表面； 落表面几乎无气生菌丝，整个菌落呈膜状。说明在无 K+条件下， 够明显抑制真菌的生长，而无 件下， K+能够基本满足真菌生 长的需求，弥足 缺失，使得真菌生长水平与对照 本相当。与对照 比，当 K+/较低水平时，随着 K+浓度的上升，菌株的致病力有所增强，在 理中，强毒株 弱毒株 病指均高于对照 病指。当K+/于 20 时，菌株的致病力依然会随着 K+浓度的升高而增强。而无 K+处理中菌株的致病力明显低于对照菌株，随着接种时间的延长，这种差异性更显著。 强毒和弱毒菌株造成致病力差异的原因有可能与菌株对鉴别寄主的侵染力或病原菌在植株体内的繁殖