己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能.pdf

中国环境科学 2016,36(5)：15141519 china environmental science 己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能 凌婉婷,徐冉芳,刘 娟,孙敏霞,李舜尧,朱雪竹,高彦征* (南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江 苏 南京 210095) 摘要：以海藻酸钠为包埋剂,制备了己烯雌酚(des)降解菌株 s(serratia sp.)的固定化菌剂,通过正交试验确定了菌株 s 的最佳固定化条件: 海藻酸钠质量分数为 4%,菌悬液与海藻酸钠重量比为 1:2,cacl2质量分数为 4%,交联时间为 6h.菌株 s 的固定化菌剂比游离菌株更有优 势;7d 时,固定化菌株 s 对无机盐培养基中 des 的去除率为 83.84%,较游离菌株高 22.84%.优化了固定化菌株 s 对溶液中 des 的处理条件: 固定化菌株 s 接入量为 300g/l,初始底物浓度为 2040mg/l.固定化菌株 s 对 des 浓度为 40.01,37.90 ,33.52g/l 3 个排污口污水中 des 的 去除率分别达 90.0%,96.0%,96.7%.利用固定化菌株处理实际污水中 des 等雌激素具有应用潜力. 关键词：雌激素；己烯雌酚；固定化；降解；污水 中图分类号：x703.5 文献标识码：a 文章编号：1000-6923(2016)05-1514-06 immobilization and degradation performance of diethylstilbestrol-degrading bacteria s (serratia sp.). ling wan-ting, xu ran-fang, liu juan, sun min-xia, li shun-yao, zhu xue-zhu, gao yan-zheng*. (institute of organic contaminant control and soil remediation, college of resources and environmental sciences, nanjing agricultural university, nanjing 210095, china). china environmental science, 2016,36(5)：15141519 abstract：diethylstilbestrol (des)-degrading bacteria s (serratia sp.) was immobilized using sodium alginate as the embedding agent. the optimum immobilization conditions, determined through orthogonal test, were as follows: 4% sodium alginate, bacteria: sodium alginate 1:2, 4% cacl2 and 6h crosslinking time. the des degradation performance of immobilized strain s was apparently superior to that of free strain. the degradation ratio of des by immobilized strain s was 83.84%, which was 22.84% higher than that by free strain s under laboratory culture conditions. the optimum inoculation of immobilized strain s was 300g/l, and the optimum initial des concentration was 2040mg/l. three water samples were collected from sewage outfalls with des concentrations of 40.01, 37.90 and 33.52g/l, respectively. immobilized strain s was added to these water samples, and 90.0%, 96.0% and 96.7% of des were removed by immobilized strain s after 7d. results of this investigation provide a new available technique for estrogen removal from polluted water systems. key words：estrogen；diethylstilbestrol；immobilization；degradation；sewage 近年来,世界各国很多水体中均发现不同程 度的雌激素污染,这对人群健康和生态安全产生 不良影响1 -2.我国长江,黄河流域水体中也有雌 激素检出.据报道,当水体中雌激素浓度为 1ng/l 时就会对鱼类的内分泌系统产生干扰,造成雄鱼 雌性化现象3 -5.如何去除水体中雌激素已成为 当前环境领域研究的热点之一. 雌激素性质稳定,单纯自然衰减无法消除雌 激素污染,其残存效应风险很大.利用功能微生物 来高效降解雌激素受到关注.研究者从污泥,土壤 等介质中分离获得了多株雌激素降解菌6 -8.杨 俊等6从制药污泥中分离了 1 株高效降解 17- 雌二醇(e2)的菌株 bacillus sp.,在最佳实验条件 下,7d 内该菌株可将初始浓度为 0.550mg/l 的 17-e2 完全降解.yoshimoto 等7从污水处理厂 活性污泥中分离了 1 株 rhodococcus zopfii 和 3 株 rhodococcus equi,其中 rhodococcus zopfii 对 雌激素具有强降解能力,24h 内可将浓度为 收稿日期：2015-11-16 基金项目： 国家自然科学基金(51278252,21477056);江苏省环保科研 课题(2015023);江苏省重点研发计划(社会发展)项目(be2015682) * 责任作者, 教授, 5 期 凌婉婷等：己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能 1515 100mg/l 的雌酮(e1),e2,雌三醇(e3)完全降解.从 环境中筛选出具有雌激素降解性能的菌株,有望 实现雌激素的高效降解.然而目前对于己烯雌酚 (des)降解菌的发现仍很少. 由于实际污水成分复杂,实验室筛选的功能 菌株往往因不适应环境造成活性抑制,与土著微 生物竞争处于劣势,且存在难以回用等问题,其应 用受到限制9.固定化微生物技术因具有生物密 度大,耐环境冲击,可回收利用,反应过程易于控 制,处理效率高等优点,弥补了游离菌株的不足, 目前已被应用于一些有机污染物的处理10 -11.微 生物固定化技术是在固定化酶技术的基础上发 展起来的一种技术.海藻酸钠常被用作微生物固 定化的包埋剂12 -13.须指出,迄今仍少有利用固定 化菌剂来处理水中 des 等雌激素的相关报道. 本研究在前期分离得到 1 株能够以 des 为 唯一碳源和能源的菌株 s(serratia sp.),在此基础 上以海藻酸钠为包埋剂,采用正交试验法,以固定 化菌株对 des 的去除效率为主要指标,确定了菌 株固定化条件;分析了固定化菌株 s 对无机盐培 养基和实际污水中 des 的去除性能.研究结果可 为发展雌激素降解菌的固定化技术,治理雌激素 污染等提供参考. 1 材料与方法 1.1 实验材料 实验所用 des 降解菌株 s 分离自南京某污 水处理站的活性污泥,经鉴定为沙雷氏菌属 (serratia sp.)细菌10.包埋剂选用海藻酸钠,为化 学纯;交联剂选用 cacl2,为分析纯.des 购自上海 阿拉丁试剂有限公司,纯度98%.c18为分析纯. lb 培养基,无机盐培养基(ms),des 降解培 养基参考文献8.固体培养基加入 2%的琼脂. 1.2 菌株 s 固定化菌剂的制备 以海藻酸钠质量分数(a),菌悬液与海藻酸 钠的重量比(b),cacl2浓度(c)及交联时间(d)为 试验因素,采用正交试验法12,设计 4 因子 3 水平 的正交表(表 1),以 des 去除率为衡量指标来评 价各固定化处理优劣.图 1 为固定化微生物小球 制备流程.制备固定化菌剂的方法:菌株 s 分别接 种于 lb 培养基,摇床 30,150r/min 振荡 24h 后, 调 d600=1.0;将含菌株 s 的菌悬液按一定体积比 混匀后,与海藻酸钠以一定的菌胶比充分混匀,匀 速滴入4的cacl2溶液后,于4交联一定时间, 得到直径为 35mm 的固定化颗粒.用无菌生理 盐水冲洗后使用. 表 1 正交试验因素水平表 table 1 factors and levels of orthogonal experiment 水平 因素 a 海藻酸钠质量 分数(%) 因素 b 菌液与海藻酸 钠重量比 因素 c cacl22h2o 质 量分数(%) 因素 d 交联时间(h) 1 3 1:1 3 4 2 4 1:2 4 6 3 5 2:1 5 8 取出固定化微生物小球,用自来水冲洗后备用 混合 按一定的重量比(b) 降解菌株一定浓度(a)的海藻酸钠 滴入一定浓度(c)的 cacl2中 交联 交联一定时间(d)后 图 1 固定化微生物制备流程 fig.1 preparation process of immobilized bacteria 1.3 菌株 s 固定化菌剂对溶液中 des 的去除 在 des 浓度分别为 20,40,60,80,100mg/l 的 无机盐降解培养基中,按 100,200,300,400,500g/l 的接入量分别加入上述制备的各固定化降解菌 剂,30,150r/min 摇床培养 07d 后测定溶液中 des 浓度,计算 des 去除率.以接入相等菌量的 游离菌剂的处理作为阳性对照,不接种微生物的 空白小球的处理作为阴性对照.每个处理重复 3 次.溶液中 des 浓度测定采用整瓶提取培养基的 方法8. 1.4 菌株 s 固定化菌剂对污水中 des 的去除 1516 中 国 环 境 科 学 36 卷 实际污水样品采自南京市区内某湖泊的三 个污水排水口.将采集的水样 1l 经固相萃取柱 富集浓缩(富集倍数 500),经 hplc 检测发现,3 个 生活污水排水口处的湖水中均检测到 des,浓度 分别为 40.01,37.90,33.52g/l. 按海藻酸钠质量分数 4%,菌悬液与海藻酸 钠之比 1:2,cacl2浓度 4%,交联时间 6h 的固定化 条件制备固定化降解菌株 s 菌剂.按 300g/l 的菌 剂接种量,在 1l 污水样中投入固定化降解菌株 s 菌剂,30,150r/min 摇床振荡培养 7d 后,测定水 样中 des 含量,计算去除率.每个处理重复 3 次. 处理后的水样以约为 58ml/l 的流速通过 已分别用 5.00ml 甲醇和 5.00ml 超纯水活化的 装填有 c18的固相萃取柱萃取,用 5.00ml 超纯水 淋洗柱体并继续抽吸 3.0min,淋洗后的萃取柱用 15.00ml 甲醇洗脱,洗脱液收集至玻璃试管中.试 管置于 40的恒温水浴并用氮气吹干,然后加入 50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至 2.00ml,过 0.22m 孔径滤膜后 hplc 分析8,14. 2 结果分析与讨论 2.1 菌株 s 最佳固定化条件 64 65 66 67 68 69 70 71 a1 a2 a3 b1 b2 b3c1c2c3d1d2d3 因子水平 des 去除率(%) 图 2 各因子水平对 des 去除率的影响 fig.2 effect of each factor level on des removal ratio a1,a2,a3 分别代表了因子 a 的 3 个水平(b,c,d 情况与此相同) 按照前述正交试验,制备了 9 种菌株 s 的固 定化菌剂,研究了其对无机盐培养基中 des 的去 除性能,以去除率为指标评价了菌株 s 最佳固定 条件.从图 2 可见,4 个因子均显著影响溶液中 des的去除.利用正交试验的直观分析法,对其结 果进行解析,得出 4 个因子对 des 去除的影响大 小顺序是:海藻酸钠浓度菌悬液与海藻酸钠重 量比cacl2浓度交联时间.根据无机盐培养基 中 des 的去除率,选用菌株 s 的最佳固定化条件 为:海藻酸钠浓度 4%,菌悬液与海藻酸钠之比为 1:2,cacl2浓度为 4%,交联时间为 6h.该条件下制 备的固定化菌剂形貌如图 3 所示.固定化菌株 s 呈球形,直径约为 35mm.实验中也发现,海藻酸 钠浓度为34%时,易成球;若海藻酸钠浓度为5% 时,则易发生拖尾现象,成球较困难;段海明等15 用海藻酸钠固定化细菌时发现类似现象. 图 3 菌株 s 固定化菌剂形貌 fig.3 photo of immobilized strain s 2.2 菌株 s 固定化菌剂对溶液中 des 的去除 2.2.1 固定化菌与游离菌去除 des 的比较 以 des 为唯一碳源,研究了菌株 s 的固定化菌剂和 游离菌株对溶液中des的去除作用,溶液中des 的起始浓度为50mg/l,游离菌株接入量与固定化 菌剂中菌株接入量相同.由图 4 可见,供试时间内 (07d),固定化菌剂对无机盐培养液中 des 的去 除率均显著地高于游离态菌株 s.1d 时,游离态菌 剂对溶液中 des 没有去除作用,这是因为开始阶 段(01d)des 对游离态菌株的生长和活性产生 一定抑制.1d 时,固定化菌剂则去除了溶液中 9.18%的 des,且与无菌株空白小球的去除率无 显著差异,这表明,01d 时固定化菌剂对溶液中 des 去除主要依赖于海藻酸钙凝胶小球对溶液 中 des 的吸附作用.随着处理时间延长(17d),固 5 期 凌婉婷等：己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能 1517 定化菌剂和游离菌株处理的溶液中 des 残留浓 度均降低,去除率则不断升高;经 7d 处理后,固定 化菌剂和游离态菌剂对溶液中 des 的去除率分 别达 83.84%和 68.25%,且远远大于无菌株空白 小球的去除率.17d,无菌株空白小球对溶液中 des 的去除率基本恒定,表明海藻酸钙凝胶小球 对 des 的吸附在 1d 时已达到饱和. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 01234567 时间(d) des去除率(%) 游离菌株s 固定化菌株s 空白小球 图 4 以 des 为唯一碳源时菌株 s 固定化菌剂对 des 的去除率 fig.4 removal of des in aqueous solution by immobilized strain s using des as the sole source of carbon 从去除机制来看,菌株 s 固定化菌剂对无机 盐培养液中 des 的去除主要包含两种作用,一是 固定化小球(海藻酸钙)自身吸附 des,这可以从 无菌空白小球对 des 的去除得到证明,二是固定 化小球中菌株 s 降解 des9,16.01d 时,固定化菌 剂和无菌空白小球的处理能力一致,表明此时固 定化菌剂对溶液中 des 的去除主要归因海藻酸 钙的吸附作用;17d,固定化菌剂去除溶液中 des 性能不断提高,且与无菌空白小球的去除率 间差距增大,而无菌空白小球的去除率则在 17d 保持不变,说明随着时间延长(17d),固定化菌剂 对溶液中 des 的去除从海藻酸钙吸附为主演变 为固定化菌株s的降解为主;7d时,无菌空白小球 处理的去除率仅为 15.58%,而固定化菌剂处理的 去除率则为 83.84%,吸附机制所占贡献为 15.58%,而菌株 s 降解则贡献了 68.26%. 菌株 s 固定化菌剂比游离菌株有更好的处 理效果,这一方面是因为形成固定化菌剂的海藻 酸钙凝胶小球内部呈多孔道结构,对 des 具有吸 附作用,另一方面,固定化载体对菌株起到了保护 作用,同时增加了菌体与 des 的接触机会.des 在由固定化载体表面扩散至载体内部过程中,生 长在载体孔道表层的菌落形成了一层保护屏障, 增强了菌株抵抗能力,从而使得菌株能更好地生 长和增殖9,13,而游离菌株 s 在溶液中易受到 des 毒害,生长受到抑制17 -18,故其降解 des 的 效率较低. 2.2.2 固定化菌剂接入量的影响 研究了固定 化菌剂接入量对无机盐培养液中 des 去除的影 响,结果见图 5.随着固定化降解菌接入量由 0 增 大至 300g/l,溶液中 des 去除率显著增大;菌剂 接入量为300g/l时,固定化降解菌对溶液中des 的降解率达 85.2%.但当菌剂接入量继续增大(由 300g/l 增大至 500g/l),溶液中 des 去除率无显 著提高.因此,固定化降解菌籍最适接入量为 300g/l,该接入量既能保证溶液中 des 较好的去 除效果,也减少了固定化降解菌的使用量,从而可 降低实际应用的原料成本.试验过程中,当固定化 降解菌接入量较大时,降解体系较混浊,这可能是 因为固定化降解菌以 des 为碳源和能源物质,接 入量较大时,细胞因缺乏足够营养而活性较低,出 现了菌体自溶死亡现象,死亡的细胞物质渗出造 成培养基浊度增加15. 74 76 78 80 82 84 86 88 100200300400500 固定化降解菌接入量(g/l) des去除率(%) 图5 固定化降解菌剂接入量对溶液中des 去除的影响 fig.5 effects of inoculation amounts of immobilized strain s on the degradation ratio of des in solution 1518 中 国 环 境 科 学 36 卷 81 82 83 84 85 86 87 88 20406080100 初始底物浓度(mg/l) des降解率(%) 图 6 初始底物浓度对固定化降解菌剂去除溶液中 des 的影响 fig.6 effects of initial des concentrations on the degradation of des by immobilized strain s in aqueous solution 2.2.3 des 初始浓度的影响 图 6 为 des 初始 底物浓度对固定化降解菌去除溶液中 des 性能 的影响.当 des 浓度较低时(20mg/l 和 40mg/l), 固定化降解菌对无机盐培养液中 des 的去除率 较高,分别为 86.8%和 86.2%.随着底物浓度升高 (20 到 100mg/l),固定化降解菌对 des 的去除率 下降.表明高浓度 des 对菌株生长产生抑制作用, 进而使得 des 去除率减小.在实际使用中,应适 时检测环境中 des 的实际污染浓度,据此来进一 步科学地确定固定化降解菌剂的使用量,进而节 约成本并提高处理效能. 2.3 菌株s固定化菌剂对实际污水中des的去除 固定化菌株 s 对实际污水中 des 去除见图 7,3 个污水排水口处湖水中 des 浓度分别为 40.01,37.90,33.52g/l.经固定化菌剂处理后,排 水口 1,排水口 2,排水口 3 水样中 des 去除率分 别为 90.0%,96.0%,96.7%.固定化降解菌株对实 际污水中 des 有较好的去除效果(去除率 90.0% 以上),可能是因为实际污水中 des 浓度较低,且 固定化载体对菌株具有一定的保护效果,菌株受 到外界环境的毒害作用很小,故而表现出较好的 降解效果. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 排水口1排水口2排水口3 des浓度(g/l) 处理前 处理后 (a) des 残留浓度 82 84 86 88 90 92 94 96 98 排水口1排水口2排水口3 去除率(%) (b) des 去除率 图 7 固定化菌株对实际污水中 des 的去除作用 fig.7 the degradation of des in natural polluted water by immobilized strain s 本研究中固定化菌剂包菌量偏低,海藻酸钙 吸附能力也不强,导致了处理无机盐培养液和污 水中 des 时菌剂投加量偏多,该问题仍需要进一 步针对性地完善.研究结果表明,构建雌激素固定 化菌剂,可高效地去除水中des.固定化后菌株具 有相对封闭和稳定的空间,能保证细菌正常代谢, 屏蔽外界土著微生物恶性竞争,防止噬菌体吞噬 等8.固定化菌剂在治理污水中 des 等雌激素方 面有一定可行性和优越性,可为无害化处理污水 中雌激素提供新思路和基础依据. 3 结论 3.1 以海藻酸钠为包埋剂,制备了菌株s的固定 化菌剂,通过正交试验确定了菌株 s 最佳固定化 条件:海藻酸钠质量分数为 4%,菌悬液与海藻酸 钠重量比为 1:2,cacl2浓度为 4%,交联时间为 6h. 5 期 凌婉婷等：己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能 1519 3.2 菌株 s 的固定化菌剂比游离菌株更有优 势.7d 时,固定化菌株 s 对无机盐培养基中 des 的去除率为 83.84%,较游离菌株高 22.84%.优化 了菌株 s 的固定化菌剂对溶液中 des 的处理条 件:固定化菌剂接入量 300g/l,初始底物浓度 20 40mg/l. 3.3 菌株 s 的固定化菌剂对 des 浓度为 40.01, 37.90 ,33.52g/l 3 个排污口污水中 des 去除率 分别达 90.0%,96.0%,96.7%;利用固定化菌株处 理污水中雌激素具有应用潜力. 参考文献： 1 付银杰,凌婉婷,董长勋,等.应用 ue-spe-hplc/fld 法检测养 殖业畜禽粪便中雌激素 j. 应用生态学报, 2013,24(11): 32803288. 2 lange i g, daxenberger a, schiffer b, et al. sex hormones originating from different livestock production systems: fate and potential disrupting activity in the environment j. analytica chimica acta, 2002,473(1/2):2737. 3 purdom c e, hardiman p a, bye v v j, et al. estrogenic effects of effluents from sewage treatment works j. chemistry and ecology, 1994,8(4):275285. 4 kuch h m, ballschmiter k. determination of 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