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资深ELISA Kit研发专家BJEIA和简简单单2006与您在线交流ELISA实验技术我现在正在做间接竞争ELISA的标准曲线,我已经做了好多次了,但是线性总是不好.具体过程如下:抗原包被:0.2g/ml;一抗稀释度:1:3200(方阵滴定求得)竞争抗原稀释:10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0g/ml结果：竞争抗原在10-0.2g/ml之间线性还行，到0.1g/ml时OD值应该上升的，但是却下降了。好几次的结果都是如此。竞争抗原浓度：1050.010.0010g/mlOD值：0.3690.4370.6020.690.7440.8020.7880.8150.7910.86请多指教，谢谢！不胜感激！ 如此热心的战友，我鼓掌欢迎！请教BJEIA战友：半对数曲线应该是什么样的？感谢BJEIA 战友支持，很好的学习机会，请大家踊跃提问。请教：ELISA试剂盒如何挑选？BJEIA战友起了个好头,我也来顶一下!为什么没有人回答问题呢?急切期盼各位战友回复我是第一个提问题的,如上(ghbu)多谢您的答复!ghbu的问题：0.1ug/ml处己经到达竞争法的灵敏度极限，0.1-0.001ug/ml处的OD值变化是随机误差。酶标板的包被量CV在4%左右。加上实验的加样等的变异，一般夹心法的CV在5-10%，竞争法的CV在7-15%。所以在竞争法进行定量检测时，一般以0ug/ml的OD值的80%为线性上限。所以你的模型线性系列首点应设在0.5ug/ml或1ug/ml。=抗原包被:0.2g/ml;一抗稀释度:1:3200(方阵滴定求得)竞争抗原稀释:10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0g/ml结果：竞争抗原在10-0.2g/ml之间线性还行，到0.1g/ml时OD值应该上升的，但是却下降了。好几次的结果都是如此。竞争抗原浓度：10 5 2 1 0.5 0.2 0.1 0.01 0.001 0g/mlOD值：0.369 0.437 0.602 0.69 0.744 0.802 0.788 0.815 0.791 0.86dingyanning:在进行定量曲线拟合时，可以有多种方式。半对数曲线是指对浓度取对数，吸光度则不进行处理。方程为：OD = A*log(浓度）+BELISA试剂的选择，定性试剂考虑：阳性符合率，阴性符合率，灵敏度，精密度。定量试剂需要考虑：准确性，精密性，曲线区间，灵敏度等。具体到什么指标最为重要，要看具体的检测项目与目的。如定量科研试剂要求可以放宽，主要看拟合曲线斜率要大，使测定准确度高一些。用于临床的试剂盒当然是临床符合率最为重要。如果做过多次都是这样的情况,那么很简单,通过你的实验恰恰说明了,在10-0.2g/ml之间呈线性关系,并且半数抑制在5-10g/ml.各位大侠，我有个疑问想请教一下。血液标本在-80度冰箱放了2年，请问用ELISA 法测血浆中某个因子的浓度，冻存样本会不会对测量值有影响？不用新鲜样本可不可以？大家好！谢谢各位高手的指点。还有点问题如下：1.我还想问一下10-0.2g/ml之间呈线性关系,这个范围是不是太高了，我看好多资料的线性范围都在0.1-0.01g/ml或0.01-0.001g/m这样一个比较低的区间。 我觉得线性范围太高没有实际意义，因为以后检测样品时其中的抗原浓度低的话就不好检测了。2.标准品在较低浓度下（0.1 0.01 0.001g/ml），OD值没有显著的变化，有人说是因为抗原和标准品（竞争抗原）之间没有很好的竞争关系，可能是包被浓度大了，但是我的包被浓度已经降到了0.2g/ml，比较低了。3.请问一下半数抑制是什么意思，怎么计算？谢谢您！恳请详细回复！请问BJEIA大侠，你的联系方式可否告之？大家好！谢谢各位高手的指点。还有点问题如下：1.我还想问一下10-0.2g/ml之间呈线性关系,这个范围是不是太高了，我看好多资料的线性范围都在0.1-0.01g/ml或0.01-0.001g/m这样一个比较低的区间。 我觉得线性范围太高没有实际意义，因为以后检测样品时其中的抗原浓度低的话就不好检测了。2.标准品在较低浓度下（0.1 0.01 0.001g/ml），OD值没有显著的变化，有人说是因为抗原和标准品（竞争抗原）之间没有很好的竞争关系，可能是包被浓度大了，但是我的包被浓度已经降到了0.2g/ml，比较低了。3.请问一下半数抑制是什么意思，怎么计算？谢谢您！恳请详细回复！1:是有点高,这是由你的抗体的特异性和灵敏度决定的.如果觉得没有意义时间又许可的话,可以重新筛选一个更好的抗体.2:可能有包被量的原因,可以向下做一个梯度,也可用棋盘滴定(如对此有疑问请搜索口口草芳的帖子)认真确认.合适的包被量和抗体浓度,可以呈现更好的线性关系.3: 0 抑制剂吸光值的一半,一般认为是你的半数抑制浓度,它和标准曲线上计算的值出入不大.你的半数可以认为是5g/ml多一点.抗体表现的好坏,和操作者的熟练程度有很大关系. 有道理，学习了！zhaodan123:一般来说问题是不大的。对于蛋白来说，低温贮存会提高稳定性。在-80长期保存是没有问题的，但要注意因子对反复冻融的耐受程度。ghbu:用抗原包被来与液相抗原的竞争方法是一种低灵敏度的方法。如果必须这么做，并且文献也是这样的话，应当考虑竞争法构建的基础：1）理论上要提高灵敏度，必须降低包被量，但降低后能固相结合抗体也必然减少，从而导致OD值太低。所以必须进行方法放大或选择高灵敏度的化学发光或时间分辨。这是有限度的。2）抗体的亲和力足够大，但是有限度。要达到0.01ug/ml的灵敏度，你的包被浓度可能要到0.01左右或更低（视不同物质而言）。我估计难度很大。建议：放弃固相抗原，用包被抗体的竞争方法。半数抑制与象棋筛子所言，是零浓度的OD值的一半所对应的浓度。用拟合曲线反算。ghbu:用抗原包被来与液相抗原的竞争方法是一种低灵敏度的方法。如果必须这么做，并且文献也是这样的话，应当考虑竞争法构建的基础：1）理论上要提高灵敏度，必须降低包被量，但降低后能固相结合抗体也必然减少，从而导致OD值太低。所以必须进行方法放大或选择高灵敏度的化学发光或时间分辨。这是有限度的。2）抗体的亲和力足够大，但是有限度。要达到0.01ug/ml的灵敏度，你的包被浓度可能要到0.1左右或更低（视不同物质而言）。我估计难度很大。建议：放弃固相抗原，用包被抗体的竞争方法。半数抑制与象棋筛子所言，是零浓度的OD值的一半所对应的浓度。用拟合曲线反算。spiderman_2006学习了!想请教一个问题，假设用抗体包被,那么需要在药物上做酶标吧?这样的话就增加了一步酶标抗原的反应.直接法和间接法,二者相比,哪个的灵敏度更高一些?谢谢大家！多谢了！我是按照外文这样做的，人家做的就很好。我们要发SCI论文，所以还要按照这样方法去做。我用的抗原和一抗浓度是通过方阵滴定优化出来的，为什么优化出来的最佳浓度在做标准曲线时，标准曲线的梯度就不好了呢？我再将包被抗原的浓度降低一下试试吧感谢大家给我提出好的建议！ghbu:包被抗原的灵敏度达到0.01ug/ml，除非：1）抗原分子量特别大，一个抗原能结合10个HRP。2）抗体的的亲和力大。一个抗原能结合多个抗体。你能进一步说一下抗原情况。我只曾经在一个很特殊的抗原上按照这个模式达到0.02ug/ml的灵敏度，一般情况下是基本没有可能性的。想请教一个问题，假设用抗体包被,那么需要在药物上做酶标吧?这样的话就增加了一步酶标抗原的反应.直接法和间接法,二者相比,哪个的灵敏度更高一些?虽然酶标抗原很繁琐,但是酶标成功后,可以建立灵敏度更高的反应体系.并且,市场上小分子药物的试剂盒产品大多是竞争ELISA.直接法比间接法操作简便、特异性强，但灵敏度较差.而间接法的显著特点是灵敏度高而精密度差。呵呵，感谢筛子大哥感觉还是需要自己做一下,才能体会出直接和间接法在灵敏度上面的具体不同.精密度由什么决定?灵敏度与精密度的关系在哪里?精密度是指多次测定结果的重复性.一般认为最低检出量即为灵敏度.二者的关系不大.我认为精密度主要和酶标板的吸附能力以及重复性稳定性有关系求教导师让我用ELISA测细胞因子。标本我使用血清好还是用血浆好，还是跟我选用的试剂盒有关象棋筛子：想请教一个问题，假设用抗体包被,那么需要在药物上做酶标吧?这样的话就增加了一步酶标抗原的反应.直接法和间接法,二者相比,哪个的灵敏度更高一些?虽然酶标抗原很繁琐,但是酶标成功后,可以建立灵敏度更高的反应体系.并且,市场上小分子药物的试剂盒产品大多是竞争ELISA.直接法比间接法操作简便、特异性强，但灵敏度较差.而间接法的显著特点是灵敏度高而精密度差。=你所说的间接法是包被抗原与目标抗原竞争抗体，直接法是包被抗体，目标抗原与标记抗原竞争吧。在进行灵敏度分析时，按照某种模型，间接法时包被抗原与抗体接触面积小，因此结合较慢。反应模型是抗体先与目标抗原结合，剩余位点与固相抗原结合，这样，在抗体限量时，较少的目标抗原就可以抑制固相f抗原的结合，所以标准曲线斜率大，进而灵敏度高。但实际情况可能会相反。实际情况是，间接法的高灵敏度必须在低吸光值的条件下实现。为了使吸光度达到一个可以测定的范围（0.1-2.0），必须降低间接法的灵敏度，最终的灵敏度经常低于直接法。撞钟的和尚：当然跟选用的试剂盒上会有明确的标明。一般以血清为好。毕竟血浆里的纤维蛋白对实验会可能会有影响。精密度分为分析内与分析间。分析内来源于：包被板的吸附变异，加样变异，酶标仪测定变异（包括边缘效应），免疫反应变异等。酶标仪测定变异在OD值小于0.1与OD值大于2.0时比较明显，随着加样次数增加，加样变异可以会是主要不精密性来源。包被板吸附力越大，变异也越大。使用流动型的水浴可以减少反应条件差异。一般要求分析内变异小于10%，分析间变异小于15%.前段时间在做抗体配对（夹心法）的工作，发现一些组合测国家标准所建立的线性关系非常好，可用此方法来测临床样本时，却怎么也测不准，差异非常大。请教这是什么原因导致的呢？抗体制备过程中应怎样避免呢？前段时间在做抗体配对（夹心法）的工作，发现一些组合测国家标准所建立的线性关系非常好，可用此方法来测临床样本时，却怎么也测不准，差异非常大。请教这是什么原因导致的呢？抗体制备过程中应怎样避免呢？=这种情况很多，除了抗体原因外还可能是：1)国标选用的纯品与天然物质有差异。除合成、基因产品外，即使是纯化蛋白在纯化过程中也可能导致免疫特性变化。2）稀释国标的缓冲体系与血清的差异。有时侯可以通过调整国标稀释液实现。抗体制备的话，如果是单抗，则只能是在筛选、配对时测一下临床样本，看不同的株配对是否有差异。S形的请教我现在有多株单抗想看看它们是否针对相同抗原表位，有没有比较简单实用的方法做到。查阅文献后我选用非标记相加ELISA方法，但是苦于找不到完整操作方法.我想通过间接ELISA方法测定倍比稀释的腹水的OD值绘制曲线以便得到单抗的大致饱和度，但是效果一直不理想，是我的方法不行还是操作有误，请各位指点迷津。请问相加ELISA试验如何做？有没有详细的步骤。我现在有多株单抗需要鉴看是否针对同一抗原表位，查阅文献后决定采用非标记相加ELISA试验，但是不知是我理解错误还是操作问题，一直作不好。本想通过间接ELISA试验做腹水不同稀释度的OD值绘制曲线确定单抗饱和度，但是经常会出现高稀释度OD值高于低稀释度的现象，不知是我的稀释度没选好还是方法本就不对。请各位多指教！半对数曲线的形状，要看你用的坐标纸。如果是使用普通坐标，是一个向X轴倾斜的抛物线。如果使用半对数坐标纸，或将浓度对数换算后绘入普通坐标中，则是一样直线。使用半对数换算，目的就是为了得到条直线，从而能使用最小二乘法拟合曲线。非标记相加ELISA，我也不太明白。你可以说具体一些吗？请问抗原的具体情况，分子量，表位数量。您好，我想请教一个ELISA的问题。我在做双抗体夹心ELISA，前段时间实验出了点问题，以前用北京中杉的酶标抗体（羊抗兔HRP-IgG）能做出来的，后来换成PIERCE公司的羊抗兔HRP-IgG就一直没做出来，所有的操作都没有变，但就是不显色。把抗体换回去就可以做出来了。不明白是怎么回事，大家有没有遇到过这种情况？这种情况比较少见。请你确认一下：1。两种酶标抗体的原液浓度，最终稀释浓度。2.用少量液体酶（如酶1：1000稀后加10ul，加上底物）比较两种活性。3.检查两者的批号与效期。4.pierce酶是直接订购的，还是中介分装的？请把两种的标签内容发给我看一下。如果自己找到原因了，也请说一下让我们长一些见识。BJEIA战友，我的蛋白是禽类的干扰素，大小在23KD左右。具体有多少表位我还没有从相关文献中看到过。现在已经得到多株单抗，想建立双抗体夹心检测方法，现在就是想看一下这些单抗针对的抗原表位是否相同。其实不用相加法也行，只要能鉴定出针对不同抗原表位的单抗就行。不过要考虑成本，若全都用标记后做竞争的话我是吃不消的。那就用直接用夹心法做一下配对。你做表位筛除一部分，是想将配对的工作量降低。但如果蛋白有重复结构，同一株单抗有时侯也能建立双抗体夹心法。如果配对时不采用标记单抗，而是采用标记二抗的话，可以减小标记工作量。单抗A包被+抗原+单抗B，二抗酶。我们做单抗时，一般筛到十多株时，仍是全部标记后做配对的。BJEIA 战友，多谢你的帮助。正是这样，我也想过同一个抗体也可以做夹心的情况 。我很幸运初期可以筛出的就有十多株，所以都标记的话有点吃不消。就按你说的做一下，遇到问题还要多指教啊。我想问一下你们标记是自己配试剂标还是用现成的试剂盒。我是个新手很多实验没有经验。我们是生产性单位，当然全部是自己做。对科研者来说，应当尽可以消除意外因素，所以尽可能购买商品化的底物液，包被液，封闭液，标记试剂盒。这样将精力集中在自己关注的单抗上。原来如此，那称您为前辈一点不亏啊!我也渴望自己的成果能在实际中得到应用。谢谢帮助，往下做的过程中再遇问题还向您请教！我也有个问题，05年八月份收集的血清标本在-40度低温冰箱内保存至今，现在拿它来检测血清中乙肝表面抗原浓度，结果会有影响吗？BJEIA，您好，我的酶标二抗：Prod # 1858415 Lot # IA 110693Stabilized Goat anti-Rabbit HRP-conjugated1ml at 10ug/ml这个抗体我用1：2000一直也没做出来。是直接订购的。做WB可以做出来，我检测过，用抗体和底物直接反应，抗体质量应该没问题。我一直找不到这个抗体的说明书。另一个是北京中杉的：ZB2301 Go a Rb IgG/HRP Lot：66116 。 2007年1月的。这个抗体用1：3000就可以做出来。我还是没找到原因。你好，我想咨询一下我的问题，我今天用*的SP-A试剂盒做了两个样本孔和一个空白孔，最后三个孔的od值差不多，都是0.175左右，我的样本是大鼠肺泡灌洗液，请问可能的原因有哪些啊？下一步该怎么做？你好，我想咨询一下我的问题，我今天用*的SP-A试剂盒做了两个样本孔和一个空白孔，最后三个孔的od值差不多，都是0.175左右，我的样本是大鼠肺泡灌洗液，请问可能的原因有哪些啊？下一步该怎么做？你所说的间接法是包被抗原与目标抗原竞争抗体，直接法是包被抗体，目标抗原与标记抗原竞争吧。在进行灵敏度分析时，按照某种模型，间接法时包被抗原与抗体接触面积小，因此结合较慢。反应模型是抗体先与目标抗原结合，剩余位点与固相抗原结合，这样，在抗体限量时，较少的目标抗原就可以抑制固相f抗原的结合，所以标准曲线斜率大，进而灵敏度高。但实际情况可能会相反。实际情况是，间接法的高灵敏度必须在低吸光值的条件下实现。为了使吸光度达到一个可以测定的范围（0.1-2.0），必须降低间接法的灵敏度，最终的灵敏度经常低于直接法。经典,学习了.强中自有强中手啊实际情况是，间接法的高灵敏度必须在低吸光值的条件下实现。为了使吸光度达到一个可以测定的范围（0.1-2.0），必须降低间接法的灵敏度，最终的灵敏度经常低于直接法。请教BJEIAamelle1982两位专家，可否详细举出实例，以免理解上出现偏差。呵呵,筛子大哥过奖了,我不是专家,不过现在咱们在这的讨论的这个楼主可是专家.看BJEIA专家有点忙不过来,我就我会的解答以下问题吧(其实是现学现卖,实话实说)单克隆抗体结合位点分析按文献8、9方法进行。用EL ISA 相加试验测定OD 值, 抗体之间产生相加效应的程度用AV(additivity value)表示。AV=（ODMcAba+b）/(ODMcAba +ODMcAbb)100%式中McAba、McAbb 2表示不同单克隆抗体分别单独与抗原作用时的OD450 nm 值;McAba+b表示2种单克隆抗体混合后与抗原作用时的OD450nm值。当AV值小于50%时，证明a和b两种单抗识别同一个抗原位点，而AV值大于50%时，证明a和b两种单抗识别不同的抗原位点。文献8、98 Friguet B, Djavadi-Ohaniance L, Pages J, Bussard A, Goldberg M (1983) A convenient enzyme-linkedimmunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site. Application tohybridomas specific for the bsubunit of Escherichia coli tryptophan synthase. J Immunol Methods 60: 3513589 Levieux D, Venien A, Levieux A (1995) Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin withmonoclonal antibodies. Hybridoma 14: 435442这是我前几天帮人回答问题时参阅的文献,个人认为相加ELISA就是在加一抗时加入不同种的抗体(如不同批次的腹水啦等等),然后也加入单一的,然后按照上述公式计算就可以了.关于你提出的我想通过间接ELISA方法测定倍比稀释的腹水的OD值绘制曲线以便得到单抗的大致饱和度,但是效果一直不理想，是我的方法不行还是操作有误这个应该简单,你可以用棋盘滴定法就确定下来啊,不知你为何说效果不理想,是梯度没有出来吗?因为一个方阵做的好的可视条件,就是明显可以看出随你稀释的抗体浓度下降而OD值降低呀.你找一找主观原因和客观原因,比如你计算的方法(横纵坐标没有错误吧),酶标板稳定性方面等等.期待你的好成绩!我没有人云亦云啊,筛子这么说话,我可生气了.本来我是没有进行人身攻击的,我只是在细看了BJEIA的精彩解答后,判断他是为强手,也没有认为你有何不妥.大家来园子里就是来探讨问题的,本着身份平等,公开交流的原则,互相说一说自己对同样问题的看法,难免有意见一致和不同的地方,希望你也本着求同存异的气度去看待战友的意见.筛子大哥即时改正,我也就收回了以后还望你多多指教呢,在园子里也拜读过你的一些大作,很有见地,看得出也是在这方面的高手啊呵呵关于这个问题,我也实话实说,确实自己在这方面也处在探讨阶段,这里请允许BJEIA去给大家详细解答.我只能说我理解BJEIA的意思.另外我给BJEIA叫好的缘故是在于他提出了一些一反普遍理论的观点,因为在我们普遍的认识下,都认为间接灵敏.因为在很多时候,师兄师姐或即便是老师教给我们的都是定式思维,我们这么做了,却一直没有作出来,最后经过自己的实践才发现他们有的说的是片面的,甚至是错误的,误导人的,这点我有亲身体会,相信在园子里在实验台上工作和战斗过多年的战友都有所体会,所以我一直反复跟师弟师妹们交代的事就是我说的也不一定准确,大家要勤于自己动脑动手去实践,当然好的方法应该继续发扬.这一段比较忙，没有验证BJEIA老师的观点，不敢说适合与否。我也佩服BJEIA老师的才识，但我不会盲从。关于这个问题,我也实话实说,确实自己在这方面也处在探讨阶段,这里请允许BJEIA去给大家详细解答.我只能说我理解BJEIA的意思.既然只是理解，这就说经典，是否有些主观？另外我给BJEIA叫好的缘故是在于他提出了一些一反普遍理论的观点,因为在我们普遍的认识下,都认为间接灵敏.因为在很多时候,师兄师姐或即便是老师教给我们的都是定式思维,我们这么做了,却一直没有作出来,最后经过自己的实践才发现他们有的说的是片面的,甚至是错误的,误导人的,这点我有亲身体会,相信在园子里在实验台上工作和战斗过多年的战友都有所体会,所以我一直反复跟师弟师妹们交代的事就是我说的也不一定准确,大家要勤于自己动脑动手去实践,当然好的方法应该继续发扬.叫好不反对，要基于自己的充分的经验基础。老师和师兄所说，都是自己的经验之谈，不一定适合你。要分辨的学习 和执行，实验过程中在老师和师兄的基础上发展自己，这才是恰当的，他们有错误，但不能妄论误导一说。老师和师兄帮助你应该获得尊重，即使有错误，也不应成为批评的靶子。无语.*是口水战吗?我没有想到自己的文字会被园子里的战友如此误解.而且谁把谁当靶子,你上面写的已经很清楚了,群众的眼光是雪亮的.我的观点：一般没有影响。HBsAg试剂盒现在的灵敏度高达0.5ng/ml左右，而大部分的阳性标本会在5ng/ml以上。所以理化上你会遇到低滴度的HBsAg，但机率比较少。另外，对于低滴度的HBsAg而言，误判的风险也小一些。你前面的抗体是10ug/ml，酶标二抗的使用浓度一般在0.1ug-1ug/ml左右。所以你的进口抗体用得太稀了。国产酶标二抗可能是1mg/ml左右的。你可以用稀释后的液体酶比较一下两者中HRP的浓度。象棋筛子&amelle1982:谢谢两位，做科研工作，争吵与偏执也许并不是一个缺点与坏事。不仅是老师与师兄，即便对师弟们，也要保持尊重态度。入门有先后，但一旦入门则学业有专攻，各有所长，寸亦可补尺。即便是对手下普通的实验员，我也保持尊重的态度，因为在一些实验细节上，我没有太多的时间去仔细考虑，而他们往往能提出更为合理的实验方案。当然，尊重而不盲从，相应也是大家所共同认同的。因为实践的科学本身需要不断突破。我也不认为自己是真正的专家。因为我还不能建立完善的模型来分析两种方法。下面我尝试说一下自己的理解。尝试写长一些，用附件发上来。明天我去珠海出差。请耐心等几天。两天没上原来论坛里这么热闹，多谢amelle1982 的热心帮助。为了尽快解决问题我当时在多处求助过，你这是第二次解答了。我的问题在得到小蚂哥的原文献后已经解决。现在我很喜欢*，愿大家取长补短，共同进步啊！不客气,能够帮助到大家是我的万分荣幸啊!今天真开心!也衷心谢谢大家的支持!您好!我还是老困难户,老问题,还没有解决,请各位老师再帮我详细分析一下,本人不胜感激!我现在的结果:我试验结果的IC50在3g/ml左右.另外包被的抗原为0.2g/ml,竞争抗原的浓度为5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0g/ml。所得到的OD值为：0.405、0.64、0.755、0.852、0.915、0.919、0.948、0.953、0.958。曲线线性范围大概在2-0.2g/ml之间，在0.2-0.001g/ml之间OD值梯度变化不明显。我这样的结果可以吗?有什么问题？恳请各位高手帮我分析解答。多谢！还有一个问题,就是包被抗原和竞争抗原配成一定浓度之后的存贮问题, 我的包被抗原和竞争抗原是同一种蛋白,是Sigma的冻干粉,我首先将两者配成1mg/ml,按50l/管分装后冻存在-20度,用时取一小管.我不知道这样的存放可以吗?Sigma的冻干粉是在4度保存.因为昨天我做了一个方阵,发现OD值梯度还可以,但是OD值普遍都降低了很多,原来的效价在1:3200,现在连1:100都不到.我不知道是不是因为抗原冻存过程中有降解,导致包被的量减少,还是其他原因.与以前不同之处为:包被液是新配的,但与原来PH与浓度都一样;包被抗原原来放在4度,因为放两周就变质有沉淀了,所以现在改为-20度存放.请各位战友、斑竹和老师帮忙分析！谢谢大家！BJEIA wrote：下面我尝试说一下自己的理解。尝试写长一些，用附件发上来。明天我去珠海出差。请耐心等几天。期待BJEIA的指点冻存是一个好办法，一般对大多数蛋白是适用的。但要考虑反复冻融的问题。OD值下降可以是新包的板子效价下降，也可能是抗体等其它试剂的效价下降。是种现象是科研中经常见到的，原因是方法及工艺没有标准化，原料保存不当等。究竟是什么原因，只能是做对比实验了。附我对间接法与直接法的一些想法，不一定到位。象棋筛子.doc (24.0k)多谢 BJEIA 老师！还有许多不太明白的地方，我再仔细琢磨几下，有问题还要请教的。BJEIA 老师提到抗体效价降低的问题，不知道 BJEIA 老师在试剂盒生产中是如何解决这个问题的。谢谢！用过很多种试剂盒，但对于标准曲线的拟合一直很疑惑。我的理解是在双对数作图即OD值和浓度都作对数的情况下，标准曲线是直线的。但是在以浓度和OD值作图的时候，是拟合成直线还是曲线，一直没法确定。在excel作图的时候，如果双对数，又没法给出一个公式。各位高见如何？如果双对数是直线的话，直接作图一般也是直线。双对数的目的，是适用于浓度按等比设置，如1，2，4，8，16，32时。从作图看，前面点太密，后面点太疏，作图不好把握。从数学模型上看，最小二乘法要求数据点相对集中，否则各点对标准曲线影响程度不一样，造成各点对误差的作用不一样。例如：标准浓度为1，2，4，8，16时，用双对数拟合，如在S1处产生10%的实验差异，会使整个标准曲线范围内样品测值产生6%-2%的差异。S2处产生10%的实验差异，会使整个标准曲线范围内产生4%-0%的误差，S3=4处产生10%的实验差异，会使整个标准曲线范围内产生2%的误差，S4=8处产生10%的实验差异，会使整个标准曲线范围内产生5%-0%的误差，S5=16处产生10%的实验差异，会使整个标准曲线范围内产生9%-2%的误差。16处的影响要大一些，但可以接受。同样的标准曲线，用直接拟合直线法，S5=16处10%的误差，会在标准曲线低端产生21%的误差。从而误差被放大，因而不可以接受。因为最小二乘法的原理是合并离差最小化，而实验误差的10%，在16处为1.6，在1处为0.1，因而两者对标准曲线的影响是不对等的。如果将最小二乘法的模型改成合并百分离差最小化就合理了，但数学上没有这样的模型。传统上也没有这样的去做。所以，如果浓度点是设为等差数列，3，4，5，6，7，可以用浓度-OD直接拟合，如果是等比数列，1，2，4，8或1，10，100，1000，必须用双对数。有时候，我们用单对数标准曲线，即浓度取对数，而吸光度直接取OD值进行作图。适用于等比数列的浓度，反应后的吸光度却为等差数列这样的情况。双对数用EXCEL也非常容易解决。发一个自己编的双对数拟合的EXCEL表。回归曲线.xls (54.5k)请问 我的实验准备用双抗体夹心法用抗体检测血清中抗原浓度，从网上抗体资料上看有两种单抗，一种检测下线时3ng/ml,一种是0.03ng/ml，请问我应该选择那样抗体包被96孔板？谢谢一般是用亲和力强的单抗进行包被。当然试验确认一下更为妥当。两种单抗如果是同一公司的，他们应当给出一个推荐的使用方法。如果不是同一个公司，要考虑单抗的匹配。BJEIA 能给我一个EMAIL吗？谢谢BJEIA您好：我用pGEX-4T-1载体和重组质粒进行抗原包被，用同一种血清对包被的抗原建立间接ELISA，结果发现载体包被的OD值很高，几乎和重组质粒的一样高啊，而且对不同的血清，pGEX-4T-1载体的OD值还不一样。包被原是pGEX-4T-1载体和重组质粒。麻烦你帮我分析问题出在哪里？不胜感谢！你用的是包被抗原与酶标二抗吧，明显你构建的ELISA有相当大的问题。建议你购买一个市售的其它包被抗原的间接法试剂盒，作一下比较，是自己的包被有问题，还是其它试剂有问题。最终的症结在哪里，只能是一步步排除了。请教BJEIA战友，抗体溶液稳定性是怎么确定的，一般保存长时间需要加入其他保存剂么？我做出来的结果是空白对照和阴性对照全是阳性的。不知是哪个环节出了问题。请教BJEIA怎么解决，谢谢！老师，您好！我是内分泌的研究生，最近做一个ELISA的试剂盒，出现了一个很奇怪的问题，我请教了好多老师，他们均不知道原因出在哪儿。第一次做的标准曲线OD值比较正常，最高浓度标准品OD值有1.7，但是第2次到第5次，最高浓度标准品OD值都只有0.25左右。我做的是*的ADMA ELISA KIT，双抗夹心法。二抗是生物素化的抗人ADMA抗体，抗二抗是HRP标记的亲和素，工作浓度是1：99.底物是TMB。试剂盒从厂家运过来要好几天，他们用冰袋运输，但是他们坚持他们的试剂盒常温放一个星期是不会坏的。不过我就很怀疑这里面酶的活性能否保存。但是如果酶失活的话，为什么我第一次的结果又是比较正常的呢？我第一次做的标准曲线数据如下：浓度250.310.1560.0780OD值1.6220.6980.3130.0070000.022第二次实验标准曲线数据如下：浓度250.310.1560.0780OD0.1770.130.1080.0860.0790.0780.0750.074以后几次实验都和第二次的结果相近。我很想知道是什么原因导致的这个结果。OD值相差太远，尽管有的老师建议我可以接受这次实验的数据，但是大部分老师还是不同意阳性对照的OD值这么低，他们都觉得阳性对照OD值应该在1以上。谢谢老师为我解答。请教一下，1我前一段时间试着直接包被噬菌体，结果ELISA的结果是全阴的，但是我没有明确的阳性对照。不知道是不是因为噬菌体还不能直接包被阿？2另外我现在想改用包被噬菌体的单抗，所用洗液是PBS-T，我看文献稀释血清用的是HPE BUFFER,我现在想用1%BSA/PBS来稀释血浆，不知道用这个稀释液有没有问题3 我稀释液的BSA/PBS里加了叠蛋钠，但是我后面的是HRP偶联的二抗，那这个BSA/PBS是不是不能用了，必须用不加叠蛋钠的？还是也可以。另我的封闭剂是2%BSA/PBS-T也加了叠蛋钠这个对后面的影响大吗？是不是可以用。非常期待您的答案，我现在对实验感到很有压力。请教大师兄：所购试剂盒为测定血清标本用的，单波竞争法，我的样品是分泌物，测试结果：样本，健康对照，空白对照 吸光度都是0.05数数量级的， 标准曲线为0.4-2数量级的，不知如何解释，下一步应该如何做？如果是因为分泌物中蛋白数量很大，空白对照为何数值也类似哪？请多指教谢谢！请问测试两种单抗夹心效果如何，如果避开酶标的步骤，先包被一种单抗，再加抗原，再加另一种单抗，最后用商业化的羊抗鼠二抗作为酶的来源显色如何避免酶标抗体与包被抗体的结合呢？抗体的稳定性怎么确定？看效价下降。在可比性的条件下对抗体进行加速稳定性考核。好象有一本书上说是3714天效价下降不超过15%表明是稳定的。保存方法，也需要看抗体本身。如抗体的稳定性满足你要求，可以不加保存剂。有一些商用的保护剂，但不一定完全适用。常见的原因：封闭不当，酶太浓，另外还看一下包被的东西，是不是有很强的非特异。用未包被的板子做一下对照，如未包被板是阴性，则是包被板的问题。噬菌体没做过。但包被是物理吸附，关键看疏水区与疏水性。1%BSA/PBS可以稀释血浆。在酶标二抗前加一步洗涤，则不影响HRP活性。封闭剂里NaN3影响不大。谢谢BJEIA老师！我的包被板应该没有问题的。我是买的ELISA试剂盒，包被板是包被的病毒抗原，是试剂盒里的，并且我用试剂盒说明书方法做出来的结果很好。因为我要检测另一个指标，就增加了鼠抗人IgG1、IgG2亚类单克隆抗体，并把原来的HRP 标记的鼠抗人IgG换成了HRP 标记的羊抗鼠IgG，包被板还是用的试剂盒里的。具体方法如下：(1) 用移液枪每孔加入80ul样品稀释液；(2) 分别在对应孔加入20ul用前述方法检测出的IgG阳性血清；(3) 置37孵育30min；(4) 用洗涤液充分洗涤5次；(5) 加入鼠抗人IgG1、IgG2亚类单克隆抗体（工作浓度分别为1:800、1:5000,每孔100ml）置37孵育30min；(7) 洗涤液充分洗涤5次；加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1:1000，100l/ 孔）(9) 置37孵育30min；(10) 洗涤液充分洗涤5次；(11) TMB底物显色，置37孵育15min；(12) 加入终止液；(13) 用酶标仪双波长450/620mm测定各孔OD值；你的空白孔设计是否有问题？竞争法如果仅仅是不加样品，空白孔应为高OD值，如果样品与酶都没加，空白孔应为低OD值。标准曲线OD值在0.4-2，即便为蛋白数量大也不可能达到0.05，最多为0.1左右。0.05接近于未调零时单波长的显色剂空白。你再仔细看一下试剂盒说明书及自己各孔的加样。无法避免。简单一些可以用生物素或荧光素标记单抗，后面跟酶标亲合素或酶标荧光素抗体。生物素或荧光素标记的容易一些。1.调整鼠抗人与酶标羊抗鼠的浓度，看是否能将阳性标本与阴性标本区分开。2.空白孔是不是也加了样稀？做不加样稀与加样稀的对比。样稀+鼠抗人+酶0+鼠抗人+酶0+0+酶可以看出对空白孔非特异的影响。3. 方法设计本身有问题。因为羊抗鼠可能与人IgG有交叉反应。1、请问使用双抗体夹心法检测抗原，由于查到的两种单抗体只有同一种属，能否将其他一种换成其他种属的多抗？这样对结果会有很大影响吗？2、如果可以是将多抗包被还是单抗包被？请BJEIA老师指点一下谢谢GJEIA老师，非常感谢您的解答。1. 生物素化抗体和酶标记亲和素是浓缩液，我都是使用前15分钟配置的。2. 枪头只是第一次灭菌了，后几次实验的时候，枪头放置超过一周，应该视为有菌，我就没有重新消毒。但是厂家说，不需要无菌操作呀。3. 包被板开封后在一天内密封保存。4. 我今天又做第N次了,数据还是那个样子，我快疯掉了，标准品每次都是那个样子，今天最高浓度标准品OD值0.269。带我实验的老师也说可能是酶失活了。但是我跟厂家沟通，他让我把标本和试剂盒寄过去让他们检测。我就担心他们做数据。我跟我老板商量了，他居然也让我寄标本过去。我想，实验做得如何，自己也总有个谱儿，给了厂家标本，他做成天花乱坠你也不知道啊。厂家今天居然跟我说，你把我们的标准曲线用到你这次的实验不就得了？我晕掉了，他怎么可以这样？双抗体夹心法可以用单抗+单抗，也可以用单抗+多抗，但都要进行配对实验。多抗包被还是单抗包被，没有固定的，需要进行对比及考虑其它因素。你用的是国产的科研试剂吧。一般科研试剂因为是成本与产量的限制，导致各方面的性能做得不是非常可靠。你这里出现的叫开瓶稳定性，更是一个薄弱环节。试剂盒是的任一试剂失活都会导致你出现折这一问题。酶标亲和素是最容易出现稳定性问题。你可以让厂家再免费寄一瓶酶与生物素，自己试一下。正常条件下试剂盒是不需要严格的无菌操作的，但一般性要求如使用无菌枪头还是要的。另外实验室不能太脏。BJEIA老师，您好！他们说是原装进口的，555，是不是一般用HRP的都是国产的？进口用的是AP？USCN LIFE（中美科技），真郁闷。开瓶稳定性的意思是不是开了瓶子就不稳定？我已经重新要了2个试剂盒，一共要了4个试剂盒，我想，再要也是那个样子的。您确定这种情况不是标准品的问题，而是酶的问题吗？酶的不稳定导致的OD值偏低，各个倍比稀释标准品OD值不能拉开梯度，这种情况对实验结果影响大不大？这种情况出来的实验结果可靠吗？您觉得我要不要把试剂和标本寄过去，让他们做呢？他们会不会给我造数据呀？要是他们造了数据出来，反而说是*作的问题，那我不更郁闷？。谢谢BJEIA老师。谢谢老师的指导，我的单抗还没有来，如果有结果了，我也把我的结果告诉大家，免得做同样试验的同学再走弯路。/Thanks, again最近做的一个课题发现问题，能不能请BJEIA老师指点：采用双抗体夹心法定量检测抗原含量，包被抗体浓度为0.1ug/孔，二抗是根据我们自己滴定的工作浓度稀释的，抗原标准品为购买的进口分装的sigma的抗体，从8ug/ml开始对倍梯度稀释标准抗原，以抗原浓度的自然对数为横坐标，反应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，然后将待检标本梯度稀释后检测的OD值代入进行计算，获得待检样本的浓度，但是发现用此方法获得的抗原含量与其他方法（大型生化检测仪检测）检测的结果相差500-1000倍，我们寻找过多方面的原因，但是没有进展，能不能请BJEIA指点一下，谢谢！谢谢！非常感谢BJEIA老师！今天将HRP 羊抗鼠IgG的工作浓度调整为1:20000再做了一遍【设置两个阴性对照】：1.阴性血清 鼠抗人IgG1 HRP羊抗鼠IgG2.阴性血清 PBS HRP羊抗鼠IgG【空白对照】：蒸馏水鼠抗人IgG1 HRP羊抗鼠IgG【结果】阴性对照1是显色的，阴性对照2是不显色的。空白是显色的。阳性和阴性显色深浅差不多【问题】1.这是否说明鼠抗人IgG1 和 HRP羊抗鼠IgG之间有交叉反应?还是鼠抗人IgG1 特异性不高。2.空白对照和阴性对照设置是否有问题?3.我的实验设计方法是按照文献上的,国外国内都有这样做过，但我却做不出来，请教该如何改进实验方法。如果真是进口盒子的话，因为售价较高，他们会使用酶标亲和素稳定剂，因而酶稳定性是好一些的。HRP酶即便在国外也是应用比AP等广泛。开瓶稳定性是指试剂盒到客户手中，打开后的稳定性会小于试剂盒标称或出厂检验时的稳定性，原因在于客户的实验室条件的不一致。你问临的是开瓶稳定性问题，因为试剂盒运输到你手中的过程其它温度很可能高于标示储存温度，但你第一次实验没有问题。而你使用后，即使正常保存于4度，但试剂盒性能下降很快。所以商用试剂盒在开发时，需要将开瓶稳定性作为单独一个项目来进行评估。如果是标准不稳定，不影响样品OD值，因此在做同一份或类似样本时会出现测值越来越高，而酶不稳定时样品OD值也下降，样本的测值变化没有那么大，但可靠性受到影响。你需要考察一下试剂盒代理商是否真有技术能力进行实验。如果不放心，你可以在当地另找一家可信的实验室去做。BJEIA老师，您好！我是这样想的，如果我把试剂盒和标本送给他们，他们就能够做出高OD值来吗？我猜结果可能还是差不多。我们学校有老师说，只要把空白孔OD值做得很低，还是可以接受实验的结果，您同意吗？谢谢。不知道阁下具体是什么物质，所以只能泛泛而谈。一般而言，三种原因。其一是抗原原材料本身的性质。生化检测的酶活性或其它量，而ELISA检测的是免疫活性。两者差异有时会很大。其二是反应基质的影响，反应基质一般会影响测值，有时也会很大。其三是单抗识别问题。基因抗原与样本中的抗原会有差异，包括糖基化等，如果单抗对这两种抗原的亲和力不一致，会导致测值的非常不可靠。所以构建一个方法一般有两点要求，一是标准的溯源，保证标准品本身是可靠且准确的，一是测值的符合，与参比的方法或文献报道相符。还不能简单地这么肯定。做了酶稀释，还需要做鼠抗人稀释。最好用标准的方阵滴定实验来确定两种抗体的最佳使用浓度。不标准的方法，先稀释酶至阳性在1.0左右，再稀释鼠抗人至阴阳性差异最大，再加浓调整酶至阳性到理想的情况。所以如果鼠抗人过浓的话，也可能导致这种情况。空白孔设计有多种的方法，主要是用来作为对比。关键看目的。象你这里反映了测值过高与样本无关，就达到了目的。如果实验方法要改进的话，我推荐直接用酶标记鼠抗人IgG1，引入的层次越多，实验不确定因素越多，非特异也会增加。你看过什么商业试剂盒用两层二抗的？标记方法掌握好，微量50ug,100ug标记的成功率也是很高的。各位专家好！我在实验中遇到这样一个问题！浓度05102550100250吸光度2.7462.1541.8561.5041.0780.6050.243不难发现随着标准品浓度增加，吸光度却逐渐下降？为什么？标准曲线该怎么做？BJEIA老师，感谢您的解答，可能我昨天说的不够详细，今天补充：我的课题为用双抗体夹心法定量检测基因表达人IgG含量，标准品为购买的进口分装的sigma的人血清纯化的IgG抗体（含量已知，我们也用紫外法定量过，相差10%，也在三甲医院检验科检测过，与紫外结果基本相同），包被抗体为羊抗人IgG 0.1ug/孔（进口分装，已知含量,我们也用紫外法定量过，相差15%），酶标二抗为羊抗人IgG（Fc）（也是进口的）.包被液就是9.6的碳酸缓冲液，封闭用5%的BSA+PBS，一抗二抗稀释液为1%BSA+PBS，反应后以抗原浓度的自然对数为横坐标，反应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，然后将待检标本梯度稀释后检测的OD值代入进行计算，获得待检样本的浓度，但是发现用此方法获得的人IgG含量与紫外和生化检测结果相差500-1000倍，不过样本浓度的高低还是可以通过OD值初步判断，请BJEIA老师再指点一下，谢谢！谢谢！谢谢BJEIA 老师！谢谢，能给我您的email 吗?我自己还是未能找出原因，我想把具体步骤和结果发给你再具体分析