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微生物学实验设计方案 组成员：田晓瑞、秦艳艳、邓小凤、马小莉、孙翠、王凯 实验名称：乳酸菌的分离培养及形态观察前言：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。日常生活中利用乳酸发酵腌制泡菜，制造酸奶都是应用乳酸发酵的实例。分离乳酸菌常用的培养基有乳清琼脂、乳清白垩琼脂和BCP等多种实验目的：1.掌握乳酸菌的分离及性质观察2. 掌握培养基的制作方法及配制原则3. 运用正确的方法对菌体进行菌落形态观察实验原理：革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法，它是根据革兰式阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。最终被染成红色的是革兰氏阴性菌，被染成紫色的是革兰式阳性细菌。实验材料： 1，器材： 玻璃棒，量筒，线绳，胶塞，试管，三角瓶（3个），天平，接种环，酒精灯，火柴，培养皿（12个），镊子，载玻片，废液瓶，洗瓶，显微镜，拨针，盖玻片，擦镜纸，吸水纸，试管（6个） 2，试剂 ： 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水 H2O2 酸奶 二甲苯 香柏油 蕃红或石炭酸复红 碘液 95%乙醇 NaOH实验方法及步骤 1.培养基制备：（共200ml）1） 称量：称取牛肉膏0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3.6-4g 水 200ml 2） 溶化:将已经称好的药品依次放入融化容器内在电炉上加热促溶，待其他药品已溶，可将琼脂放入融化，并不时搅拌，待药品已融化完全，补充融化过程中蒸发的水分至所需培养基的总体积，搅拌均匀。3） 调节PH：用玻璃棒沾取少许培养基，以PH试纸检测培养基的PH,并用0.1NnaOH溶液调整。4） 分装：趁热将培养基分装至三角瓶内，分装时，应避免管口或瓶口粘附上培养基，如果粘附，须擦尽。5） 包扎：三角瓶口加棉花塞，用防水纸和线绳将瓶口加塞处包扎好，并注明培养基名称、组别、日期。6） 灭菌：将分装包扎好的培养基置于高压灭菌器中121灭菌20-30min 2.乳酸菌的分离及纯培养：1） 将稀释2倍、4倍和无稀释的酸奶分别涂在已制好的平板培养基上，每一倍数各两个，放于温床上培养。2） 乳酸菌的纯培养（1） 选取3种不同的菌落分别接种在不同的平板培养基上（各两个），分别表上序号，以备过氧化氢酶实验应用；（2） 在选取生长良好的菌落接种在斜面培养基上（三个）备用。 3.过氧化氢酶试验：分别挑取不同的菌落将3%H2O2注于乳酸菌菌落上，观察有无气泡产生。 4.乳酸菌革兰氏染色（以枯草杆菌染色作为对照）1） 涂片：在洁净的载玻片上滴加少许蒸馏水，用接种环以无菌操作方式从菌落上挑取少量菌体，与水混匀，并涂成薄层，然后干燥、固定2） 初染：滴加结晶紫染液覆盖图片，染色1分钟，然后用水冲洗3） 媒染：滴加碘液覆盖涂片，染色1-2分钟后用水冲洗，甩尽残余水4） 脱色：用95%乙醇冲洗30秒（须严格控制时间），然后立即用水冲洗5） 复染：用蕃红或石碳酸覆盖涂片进行复染，蕃红染2-3分钟，若为石碳酸染1分钟，水洗，晾干5. 乳酸菌菌