cathepsin+k对脂肪细胞分化的影响及其作用机制的研究--优秀毕业论文.pdf

上海交通大学 博士学位论文 cathepsin k对脂肪细胞分化的影响及其作用机制的研究 姓名：韩峻峰 申请学位级别：博士 专业：内科学（内分泌与代谢病） 指导教师：罗敏 20060501 c a t h e p s i nk 对脂肪细胞分化的影响及其作用机制的研究 中文摘要 目前全世界已经有超过1 0 亿的成人超重，至少有3 亿人属于重 度肥胖( b m i 3 0 ) 。肥胖的患病率逐年增加，且呈低龄化倾向。肥胖和 多种疾病密切相关，如高血压、糖尿病、冠心病以及某些癌症等，严 重影响人类健康，并给社会带来沉重的经济负担，成为全球第六大公 共健康问题。 但目前对肥胖的防治方法不多，疗效欠佳，临床上的两类主要药 物：1 ) 食欲抑制剂；2 ) 代谢刺激剂。作用广泛，副作用多，限制 了应用。近年对脂肪组织功能研究取得重大突破，认为其不仅仅是一 个能量储存器官，更重要的是具有内分泌功能。通过靶向干预脂肪组 织治疗肥胖成为国内外众多学者研究的热点。本文针对课题组前期通 过蛋白质组学技术筛选出的肥胖与正常人群差异蛋白c a t h e p s i n k ( c t s k ) ，对其与脂肪细胞分化的关系进行初步的探讨。首先运用免 疫印迹方法证实c t s k 在3 t 3 l 1 细胞中确有表达，并且随着脂肪细 胞分化进程其表达水平、酶活性逐步增强，至分化成熟其水平也相应 达到高峰；接着通过应用e 6 4 、m 6 p 抑制c t s k 活性发现整个分化进 程被阻断，且与c t s k 酶活性减弱密切相关这一有趣现象。说明c t s k 不只是简单的分化标志而是对脂肪细胞的正常分化发挥重要功能， 参与了脂肪细胞分化调控机制。c t s k 是一种半胱氨酸蛋白酶，可以 降解多种细胞外基质如i 型胶原等。国外有学者提出细胞外基质变化 可以影响脂肪细胞分化的假说，并已有多项实验结果证实。因此借鉴 这一思路对其具体机制进行探索，发现i 型胶原是其发挥作用的重要 靶点：i 型胶原主要在前脂肪细胞表达，在分化过程中c t s k 对其逐 步降解，这一改变激活脂肪细胞分化的两个重要的转录因子p p a r 3 , 和c e b p a ，刺激脂肪细胞特异性基因表达，从而推进分化进程。 本文首先在体外证实c t s k 在3 t 3 l 1 细胞中表达，分布于细胞 质内，在溶酶体中进行酶原激活。首次报道了c t s k 通过降解细胞外 基质i 型胶原参与脂肪细胞分化的调控机制。尽管本实验结果在某些 方面有待完善和需要进一步实验验证，但为解析细胞外基质与脂肪细 胞分化之间的关系提供了有力的实验依据，并且为将来干预脂肪细胞 分化治疗肥胖提供了可能的靶点，开拓崭新的思路。 关键词：c a t h e p s i nk ，脂肪细胞分化，肥胖症，i 型胶原，p p a r “， c e b p o t m e c h a n i s m sa n de f f e c t so fc a t h e p s i nkt 0 a d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o n a b s t r a c t t h e r ea r ea tl e a s t1 1b i l l i o na d u l t sw h oa r eo v e r w e i g h t ，i n c l u d i n g 31 2m i l l i o nw h oa r eo b e s ea tp r e s e n t t h ep r e v a l e n c eo fo b e s i t yh a sr i s e n d r a m a t i c a l l yo v e rt h ep a s td e c a d ee s p e c i a l l ya m o n g m a n yy o u n g c h i l d r e n e x c e s sa d i p o s et i s s u ei sa c c o m p a n i e db yad r a m a t i c a l l yi n c r e a s e dr i s kf o r t h ed e v e l o p m e n to fi n s u l i nr e s i s t a n c ea n dt y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s t h e h i g h e rp r o p e n s i t yo fo b e s e i n d i v i d u a l st o w a r d st h ed e v e l o p m e n to f d y s l i p i d e m i a ，h y p e r t e n s i o n ，c o r o n a r yh e a r td i s e a s ea n d s o m ec a n c e rt y p e s i sw e l la p p r e c i a t e d e x c e s sb o d y w e i g h ti st h es i x t hm o s ti m p o r t a n tr i s k f a c t o rc o n t r i b u t i n gt ot h eo v e r a l lb u r d e no fd i s e a s ew o r l d w i d e c u r r e n t l ya v a i l a b l ed r u g s s t i m u l a t ea n o r e x i g e n i cs i g n a l si nt h e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e mt os u p p r e s sa p p e t i t eo rt h e yi n h i b i t n u t r i e n t a b s o r p t i o ni nt h eg u t i ns p i t e o ft h eg r o w i n gu n d e r s t a n d i n go ft h e ， r e l a t i o n s h i pb e t w e e nf a tm a s s ，d i a b e t e sa n dc a r d i o v a s c u l a rr i s kf a c t o r s ， o n l yaf e wo ft h em e d i c a t i o n so nt h em a r k e ti n t e r f e r ew i t ht h ea d i p o s e t i s s u ed i r e c t l y a d i p o s et i s s u eh a sl o n gb e e nc o n s i d e r e da sap a s s i v ea n d i n a c t i v ef a ts t o r a g et i s s u e h o w e v e r ，r e s e a r c hi nt h ep a s td e c a d eh a s d e m o n s t r a t e dt h a ta d i p o s et i s s u e p l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i ne n e r g y r e g u l a t i o nv i ae n d o c r i n e ，p a r a c r i n ea n da u t o c r i n es i g n a l s t h i si m p l i e s t h a tt h e a d i p o s et i s s u e i t s e l fa n dt h e l i p i da n dp r o t e i n d e r i v a t i v e s o r i g i n a t i n gf r o mi to f f e ra l la t t r a c t i v ea v e n u et ot r e a td i s e a s e sr e l a t e dt o a b n o r m a l a d i p o s e t i s s u em a s s i n2 0 0 3 ，s i xp r o t e i n sw e r ef o u n d d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s i n gi nv i s c e r a la d i p o s et i s s u e sf r o mp a t i e n t sw i t h o b e s i t y a n dc o n t r o l sw i t h o u ti l l n e s s t h r o u g h t w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 一d e ) a n dm a l d i t o f m s h e r ew ef o c u s e d o n c a t h e p s i nk ( c t s k ) a n da l s o a s s e s s e di t se f f e c t so na d i p o c y t e d i f f e r e n t i a t i o nt h r o u g h3 t 3 - l 1c e l ll i n e a st h ef i r s ts t e p ，i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h ep r e s e n c eo fc t s kp r o t e i ni n 3 t 3 l 1c e l ll i n e i nv i t r oi ta p p e a r e dt h a tt h el e v e l so fc t s km r n a ， p r o t e i na n de n z y m ea c t i v i t yg r a d u a l l yi n c r e a s e dw i t ha d i p o s ec o n v e r s i o n m o r e o v e r , e 6 4a n dm 6 p , t w oi n h i b i t o r s o fc t s kc o u l dp r e v e n t a d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o ni nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r , a se v i d e n c e db y a b s e n c eo ft r i g l y c e r i d ea c c u m u l a t i o na n dg l y c e r o lc o n t e n t s t h e s ed a t a p r o v i d et h ee v i d e n c et h a tc t s k i sn o tan o v e lm a r k e ro fa d i p o s i t yb u t p o s s i b l ye m e r g e da sad e t e r m i n a n to fa d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o n c t s k i sa m a j o rc y s t e i n ep r o t e a s e ，a n d c a n e f f i c i e n t l yd e g r a d em a n y e c m ( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ) c o m p o n e n t ss u c ha st y p eic o l l a g e n ap h y s i c a l c o n n e c t i o nb e t w e e nt h ee c ma n da d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o nh a sb e e n p r o p o s e d ：e c mc o m p o n e n t sm o d u l a t et h ei n t e r a c t i o no fc e l l sw i t ht h e i r e n v i r o n m e n ta n dl e a dt oa ni n t r a c e l l u l a rc a s c a d eo fs i g n a lt r a n s d u c t i o n t h a ti n f l u e n c e sd i f f e r e n t i a t i o n i th a sb e e nd e m o n s t r a t e db ys e v e r a ls t u d i e s i nm ys t u d y , t y p eic o l l a g e ni st h em a j o rt a r g e to fc t s k s ow ec o n c l u d e t h a tc t s kd e g r a d e st y p eic o l l a g e nw h i c hw a sm a i n l ye x p r e s s e db y p r e a d i p o c y t e s ，t h e na c t i v a t e st w oc r i t i c a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sp p a r c e b p at or e g u l a t ea d i p o c y t e s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o nr e s u l t i n gi nt h e m a t u r ea d i p o c y t e t h ep r e s e n ts t u d yp r o v i d e st h ef i r s te v i d e n c et h a t a d i p o s et i s s u ea n d ，m o r ep r e c i s e l y , a d i p o c y t e sp r o d u c ea n d r e l e a s ec t s k t h ef u r t h e ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e st h a tt h em o d u l a t i o no ft y p eic o l l a g e n t h r o u g hp r o d u c t i o no fc t s km i g h tb ea ni m p o r t a n tk e yr e g u l a t o ro f a d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o na n dc o u l dc o n t r i b u t e t ot h er e m o d e l i n gt h a t o c c u r sd u r i n gt 1 1 ed e v e l o p m e n to f o b e s i t y t a k e nt o g e t h e r , a l t o u g hf u r t h e rs t u d i e sa l en e e d e dt ov e r i f yt h e s e r e s u l t s ；t h ep r e s e n t d a t a s u g g e s t t h a tc h a n g e si n e c mt h r o u g h c t s k m e d i a t e dd e g r a d a t i o nm i g h tp l a yac r i t i c a l r o l ei nt h ea d i p o c y t e d i f f e r e n t i a t i o np r o c e s s i ti st e m p t i n gt os p e c u l a t et h a tc t s km a y r e p r e s e n tn e w , i n t e r e s t i n gt h e r a p e u t i c a lt a r g e t st om o n i t o ra d i p o s e t i s s u e g r o w t hb yr e d u c i n ga d i p o s e d i f f e r e n t i a t i o n k e yw o r d s ： c a t h e p s mk ，a d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t m n ，o b e s i t y , t y p e i c o l l a g e n ，p p a r y , c e b p c e 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密 ( 请在以上方框内打“ ) 靴敝储獬。拚嘶 日期：夕吖年厂月矿日 稚轹枞 日期o o 名年厂月9 自 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 靴敝储鹳：希奸 日期：删占年厂月妒e t 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 第一部分c t s k 与脂肪细胞 引言 近年来全球肥胖症患病率逐年上升，且呈现低龄化倾向。据世卫组织估计，全 世界已经有超过1 0 亿的成人超重，至少有3 亿人属于重度肥胖【l 】。国内的资料显示， 我国估计现有2 亿人超重，肥胖人数为6 0 0 0 多万。其中某些大城市成人超重率、 肥胖率分别高达3 0 和t 2 3 ，儿童肥胖率已达8 1 。肥胖常诱发高血压，冠状 动脉粥样硬化性心脏病，高脂血症，2 型糖尿病，肺功能不全以及某些癌症，还会 对消化系统，肾脏功能产生影响以及影响儿童的身心健康，从而成为全球第六大公 共健康问题【2 l 。美国n h a n e s 研究报告显示在4 0 一5 0 岁人群中肥胖可使其预期寿 命降低七年，有1 8 成人死亡率与肥胖相关闭。随之而来肥胖给整个社会带来沉重 的经济负担，在美国2 0 0 0 - - 2 0 0 5 年每年有3 7 的医疗开支用于超重，5 3 用于肥 胖，而且比例逐年增加1 4 j 。 当前肥胖的药物防治策略主要有两类：1 ) 食欲抑制剂，如苯丙胺类，双胍类； 2 ) 代谢刺激剂，如甲状腺素片等。这些药物并不直接作用于脂肪组织，副作用较 多，临床上难以被病人接受1 5 l 。长期以来，脂肪组织一直被视作惰性的能量储存器官， 对与其他组织、器官信息交流的认识仅限于其所分泌的游离脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d ， f f a ) 可影响肝脏的糖脂代谢，以后也认识到脂肪酸的异位堆积影响骨骼肌、1 3 细胞 的功能，然而这远远不能揭示脂肪组织在机体病理生理过程中所起的复杂作用。在 1 9 9 4 年，瘦素的发现引发了对脂肪组织研究的热潮1 6j 。众多脂肪细胞因子如脂肪源 性肿瘤坏死因子o r ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - n 师一a ) 【7 | 、脂联素俸1 、抵抗素铆、白细 胞介素6 t 1 0 i 和内脏脂肪素( v i s 雠i n ) 1 等相继被发现，脂肪组织旺盛的内分泌功能 亦逐渐为人们所认识：在生理情况下，脂肪组织可以分泌一些激素类物质作用于自 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 身以及其他组织、器官，发出体内脂质储存量的信号，使人体作出相应的反应以保 持体重在正常的范围。脂肪组织通过与机体其他组织的对话，整合内分泌、代谢和 炎症信号。调控机体的能量状态。随着对脂肪组织功能的深入了解，使得靶向干预 脂肪组织治疗肥胖成为可能，目前与其相关的多个领域成为国内外研究的热点：包 括脂肪细胞分化，脂肪细胞凋亡【1 3 1 ，脂肪细胞分泌因子【1 4 1 等。 本课题组从2 0 0 1 年起以脂肪组织为切入点，运用双向电泳和质谱为研究手段， 从肥胖人群和正常人群中筛选出七个差异蛋白点n5 1 。本文选择c t s k 为研究对象， 将着重探讨其与脂肪细胞的关系。 l 、材料与方法 1 1 主要试剂和消耗材料 i n v i t r o g e n 公司r n a 抽提试剂t r i z o l 、s u p e r s c r i p t1 ir t 逆转录酶。t a qp l u s 酶、 琼脂糖、d e p c 由上海生工公司提供，d n a m a r k e r 购自日本t a k a r a 公司，羊抗小 鼠c t s k ，c y s t a i nc 多克隆抗体，h r p 标记的驴抗羊i g g 购自s a n t ac m z 公司，免疫 印迹增强化学发光法( e n h a n c e dc h e m i l u m i n e c e n tm e t h o do fw e s t e r nb l o t t i n g ，e c m k i t ) 购自c e l ls i g n a l i n g 公司，硝酸纤维膜由华舜公司提供。驴抗羊荧光标记二抗 购自c h e m i c o n 公司，地塞米松、异丁基- 甲基黄嘌呤购自s i g m a 公司。胰岛素由 礼来公司提供，牛血清白蛋白( b s a ) 、小牛血清由上海实生细胞生物技术有限公 司提供，d m e m 培养基购自美国g i b e ob r l 公司，二甲基亚砜( d m s o ) 为宣兴 市化工厂产品。3 t 3 一l 1 细胞株购自a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ，c l - 1 7 3 ) 。 c t s k 活性检测试剂盒购自c a l b i o c h e m 公司，l y s o t r a c k e rr e dd n d 一9 9 为 m o l e c u l a rp r o b e s 公司产品。 1 2 主要仪器设备 1 2 19 6 0 0 型p c r 扩增仪( p e r k i n e l m e r ) 1 2 2 低温高速离心机( b e c k m a n ) 1 2 3d u - 5 3 0 型紫外分光光度仪( b e c k m a n ) 2 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 1 2 4c 0 2 培养箱( n u a i r e ) 1 2 5 垂直电泳仪( b i o r a d 公司) 1 2 6 硝酸纤维素膜电转移器( b i o r a d 公司) 1 2 7 磷屏成像分析系统f x - m a c ( b i o - r a d 公司) 1 2 8 超净工作台，苏州净化设备厂 1 2 9 紫外成像分析系统( b i o r a d 公司) 1 3 研究方法 1 3 1 细胞培养及诱导分化 1 3 1 13 t 3 - l 1 前脂肪细胞株的复苏 1 ) 从液氮中取出细胞株，立即置3 7 。c 水浴，快速复苏约2m i n 。 2 ) 将复苏的细胞吸入装有1 0m l 培养液的5 0 l l 离心管中，室温1 0 0 0r p m 离心5 m i n 。 3 ) 弃上清，再加入l om l 培养液，缓慢吹打，使细胞重悬。 4 ) 将重悬的细胞及培养液吸入培养瓶中。 5 ) 在显微镜下观察细胞形态和数目。 6 ) 置5 c 0 2 的3 7 0 c 恒温培养箱中培养。 1 3 1 23 t 3 - l 1 前脂肪细胞株的培养与传代 1 ) 显微镜下观察细胞已贴壁，里梭形、透亮，更换培养液至细胞汇合。 2 ) 将培养液倾出，加入0 2 5 胰酶进行消化，显微镜下可见细胞由不规则的多角 形或梭形收缩成圆形，该过程约需5m _ i n 。 3 ) 用滴管吹打，使细胞脱离培养瓶壁，吸入已装有培养液的离心管中，1 0 0 0r p m 离 心5 m i n ，沉淀细胞。 4 ) 倾去上清，再加入培养液，用滴管吹打，使细胞分散。 5 ) 根据接种密度取部分含细胞的培养液加入培养瓶中，于5 c 0 2 的培养箱中3 7 。c 培养。 1 3 1 3 3 1 “ 3 - l 1 前脂肪细胞株的诱导分化 1 ) 将上述细胞进行l ：4 传代，等细胞长至汇合时( 定义为0 天) 换液，继续培养 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 4 8 h 。 2 ) 加入含有0 5 m m 异丁基一甲基一黄嘌呤、0 2 5 9 v l 地塞米松和1 7 9 m 胰岛素的1 0 小牛血清的高糖d m e m 培养4 8 h 。 3 ) 撤去地塞米松和3 一甲基1 一异丁基嘌呤，换以含1 7 1 t m 胰岛素的培养液再培养 4 8 h 。可见少数细胞形态呈圆形，并有脂滴出现。 4 ) 第4 天已可见到分化成熟的脂肪细胞，细胞体积明显增大，形状变圆。细胞质 中含有丰富的脂滴。 1 3 1 4 油红0 染色 油红o 可以特异性的使脂质着色，前脂肪细胞在分化培养基中逐渐分化成为 成熟的脂肪细胞，细胞质内有脂质滴聚集。因此油红0 染色可以用于脂肪细胞的 鉴定，并进行分化状态的观察和分化程度的间接定量分析。 1 )弃培养液，用p b s 洗3 次。 2 )用1 0 甲醛固定液( 4 0 甲醛1 0 m l 加入9 0 m ld d h 2 0 ，再加入氯化钙l l g ， 调p h 为7 o ) 固定细胞1 0 m i n ，p b s 洗3 次，然后将细胞晾干2 0 r a i n 。 3 ) 加油红o 染液( 0 2 5 9 油红o 加入1 0 0 m l 异丙醇，5 6 “ c 水浴助溶l h ，冷却后 过滤作为储存液。使用时取6 份上述储存液，加4 份d d h 2 0 混匀，静置1 0 m i n ，即 为使用液) 于细胞表面，1 0 m i n 。 4 )弃油红o 染液，用6 0 异丙醇洗细胞2 次，以去除多余的染料。 5 ) 用d & q 2 0 洗3 0 次后，用苏木精染细胞核2 m i n 。 6 )用水洗5 - 1 0 m i n ，倒置显微镜下观察结果，拍摄照片。 1 3 2 总r n a 的抽提和质量鉴定 1 3 2 1r n a 抽提： 将培养液吸于，用冰浴后的p b s 冲洗两遍，每孔加入l m l t r i z o l ，用滴管吹打， 待细胞完全裂解后，将裂解液移入e p p e n d o r f 管，加o 2 m l 氯仿，剧裂摇动1 5 s e c ， 静置5 m i n 后1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ；取上清加入另一新的e p p e n d o r f 管，加0 5 m l 异 丙醇混匀，静置1 0 m i n 后1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，可见乳白色小球状沉淀；小心弃 上清，以1 m 1 7 5 乙醇洗涤沉淀，真空抽干，以无r n a 酶去离子水重溶r n a 。一 4 上海交通大学医学院2 0 0 3 缓博士研究生学位论文 8 0 保存备用。 1 3 2 2r n a 的鉴定及定量： 取r n a 用紫外分光光度计检测2 6 0 n m 的吸光度( o d ) 值及o d 2 6 0 n m o d 2 8 0 n m 的比值，以测定其含量和纯度，以1 琼脂糖电泳鉴定r n a 有无降解。 1 3 2 3 引物设计及合成 根据g e n e b a n k 公布的小鼠c a t h e p s i nk ，p p a r v 和管家基因1 3 - - a c t i n 的基因序 列，应用p r i m e r e x p r e s s t m i 0 软件自行设计上、下游引物，由赛百盛公司合成。 c a t h e p s i nk 上游引物 5 t g g g a g c t g t g g a a g a a g a c 3 。 下游引物 5 t t t c a t c c t g e c e e a c a t a e3 5 5 0b p c y s t a t i nc 上游引物 5 c t g c g c t c c t t g a t g c t a c t 3 下游引物 5 c a c g c t g t a g a t c t g g a a g g a 3 3 6 0 b p 1 3 - a c t i n 上游引物 5 c t g g g a c g a t a t g g a g a a g a3 下游引物 5 a g a g g c a t a c a g g g a c a a c a3 2 0 2b p 1 3 2 4 e d n a 的合成 参与逆转录反应体系按g i b c o 公司的s u p e r s c r i p ti i r t 址使用说明进行操作： r n a 1 峙 o i i g o t ) 2 山 加r n a a s e f r e ed d h 2 0 至1 2 u l 7 0 “ c 孵育1 0 m i n 置于冰上，经短暂离心后加入 5 f i r s tb a n db u f f e r d t t d n l p 4 0 1 2 0 1 l u l 混匀，置4 2 “ c2 r a i n 后加入 s u p e r s c r i p ti i1 0 1 混匀，置4 2 “ 06 0 m i a , 7 0 “ c1 5 r a i n 后逆转录反应完毕，产物2 0 “ c 保存。 1 3 2 5p c r 反应 取逆转录产物，p c r 管中建立2 5 0 1 反应体系作p c r 反应： 5 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 反应条件： c d n a 上、下引物各 1 0 b u f i e f d 1 叮 p t a q 酶 加d d h 2 0 至 0 5 u l 0 5 u l 2 5 m 0 5 m 0 3 1 a 2 5 u 1 c a t h e p s i nk 9 5 。c4 r a i n 。9 4 0 c3 0 s e e ，5 6 8 0 c3 0 s e e - 7 2 0 cl m i n ，2 9c y c l e ，7 2 1 0 r a i n c y s t a f i nc 9 5 。( 24 m i n ，9 4 0 c3 0 s e e ，5 5 。c3 0 s e c ，7 2 * ( 2l m i n ，2 9c y c l e ，7 2 。c1 0 m i n p - a c t i n 9 5 。c4 m i n ，9 4 。c3 0 s e e ，5 5 。( 23 0 s e e 。7 2 。cl m i n ，2 9c y c l e ，7 2 。c1 0 n f i n 取上述p c r 产物于1 2 琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下观察，用f ) ( 一m a c 进行扫描分析。 1 3 3 蛋白免疫印迹 1 3 3 1 配制1 0 s d s p a g e 分离胶和4 s d s - - p a g e 基层胶，灌入垂直电泳槽的 玻璃板中。 1 3 3 2 样品加入细胞裂解液后，4 0 c1 0 0 0 0 9 离心1 0m i n 后取上清， j f l 3 。4 x s d s 凝胶 加样缓冲液# 圣v o t e x 混匀，9 5 一1 0 0 “ c j 口热5 m i n 。 1 3 3 32 0 pl 样品溶液加入加样孔，以l o o v 电泳，根据溴酚兰指示带调整电泳时间。 1 3 3 4 电泳结束后将胶放入转膜缓冲液平衡3 0 m i n 。提前准备与凝胶同样大小的滤 纸和硝酸纤维素膜，放入转膜缓冲液中平衡。 1 3 3 5 在转移盒内组装转印夹层：阴极至阳极依次放入海绵、三层滤纸、凝胶、硝 酸纤维素膜、三层滤纸、海绵。 1 3 3 6 将转移盒按正确的极性方向放入电转仪中，连接电源l o o v 电转l h 。 1 3 3 7 转印结束取出转印膜，铅笔标记膜的正反面。 1 3 3 8 膜放入盒中，加入5 r i d 封闭液，水平摇床摇动l h 。 6 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 1 3 3 9 以适当稀释浓度的一抗工作液替换封闭液，水平摇动4 “ c 过夜。 1 3 3 1 0 弃一抗工作液，以2 0 m l t b s t 洗膜3x1 5 m i n 。 1 3 3 1 1 加入适当稀释浓度的二抗工作液，室温摇动1 4 , 时，再次用t b s t 2 0 m l 洗3 x 1 5 m i n 。 1 3 3 1 2 将膜放入配制的发光试剂溶液，放入暗盒压x 一光片2 1 0 m i n 。取出x 一光 片，显影，定影，f x m a c 扫描分析结果。 1 3 4c t s k 的亚细胞定位 分化成熟的脂肪细胞中加入5 0 n mr e dn d d 9 9 ，3 7 0 c 孵育2l a ，取出培养皿冰 上预冷，吸去培养液后4 0 c p b s 漂洗两次，加入4 多聚甲醛冰上固定3 0 m i n 。p b s 重新漂洗两次，加入1 ：1 0 0 稀释的羊抗大鼠c a t h e p s i nk 多克隆抗体，4 0 c 冰箱过 夜。次日经p b s 漂洗后加入1 ：2 0 0 稀释的荧光标记的二抗溶液，室温下孵育3 0m i l l ， p b s 洗脱多余的二抗，激光共聚焦显微镜下观察拍照。 1 3 5 c t s k 酶活性检测 c t s k 活性检测严格按照试剂盒说明书操作，具体如下：分化不同阶段的脂肪 细胞用1 ：2 6 荧光底物标记，培养箱孵育1h ：经p b s 漂洗2 次后，以0 5 v n 加 入h o e c h s t , 培养箱再孵育5 一l or a i n 。激光共聚焦显微镜下观察拍照。5 5 0 n m 激发 6 1 0 n m 发射的滤光片观察c t s k 活性( 呈现红色) ，h o e c h s t 染色可用3 6 5 n m 激发 4 8 0 n m 发射的u v 滤光片观察( 细胞核，呈现蓝色) 。专人操作，标化流程。每次随 机选取8 个细胞连续观察3 0 分钟，扫描9 0 次，取平均值曲线作图。 1 3 6 统计学处理 实验数据以x s 表示，应用s p s s l 0 0 统计软件分析。先进行方差齐性检验， 满足方差齐性条件( p 0 0 5 ) ，则组间两两比较用o n e w a y a n o v a d u n n e t t t 检验， p 0 0 5 ) ，则组间两两比较用o n e - w a y a n o v a d u n n e t t t 检验， p 0 0 5 ) ( 图1 l - - a ) 。而5r e t o o l 1 的m 6 p 加入后o d 值与对照组相比升高，1 0 m m o l 1 的m 6 po d 值达到0 0 5 7 0 0 9 1 ( p 0 0 5 ) ，则组间两两比较用o n e - w a y a n o v a d u n n e t t t 检验， p 0 0 5 有统计学差异。方差齐性条件不满足时( p 0 0 5 ) ，则组间两两比较用 o n e - w a y a n o v a d u n n e t t t 3 检验。 2 、结果 2 1 细胞外基质在脂肪细胞分化过程中表达的改变 由于在不同的脂肪细胞模型中，细胞外基质各不相同。课题组检测了迄今为止 在国内外文献报道中出现的各种细胞外基质。结果显示在3 t 3 l 1 细胞分化过程中， 除c o l l a g e n1 i 未检测到外其余皆有表达( 图1 6 ) 。 4 1 海交通大学医学院2 0 0 3 级博卜研究生学位论文 图1 6 细胞外基质在脂肪细胞分化过程中的表达 f i g1 6 ：e x p r e s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r m a l r i x i na d i p o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n 2 2 c t s k 对细胞外胶原的影响 c t s k 属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族，具有胶原酶活性， 由于有三种不同类型的胶原同时在3 t 3 一l i 细胞外表达，课题组运用酶藉分析的方 法观察c t s k 对细胞外胶原是否有影响。结果显示培液上清对细胞外胶原有明显的 降解作用，加入c t s k 活性抑制剂e 6 4 后，降解作用减弱，有剂量依赖作用。而蛋 白抽提液虽然可以得到相同的趋势，但降解作用较上清为弱( 图1 7 一a ，b ) 。 图1 7 一a 4 2 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 图1 7 - b 圈1 7c t s k 对细胞外胶原的影响 f i g1 7 ：e f f e c t so f c t s k t o e x t r a c e l l u l a rc o l l a g e n 2 3c t s k 对细胞外基质i 型胶原表达的影响。 上面的实验结果提示c t s k 可以降解细胞外基质胶原，而在骨细胞的研究中， c t s k 可以降解多种骨基质，以i 型胶原为主。因此课题组采用免疫组化和免疫印 迹方法重点研究了c t s k 对细胞外基质i 型胶原表达的影响。首先课题组观察了i 型胶原在脂肪细胞分化过程中蛋白水平表达的改变，结果显示当细胞汇合时i 型胶 原表达最高，之后迅速下降，分化成熟时完全消失( 图1 8 一a ，b ) 。随后课题组采用 免疫组化( 图1 9 ) 和免疫印迹( 图2 0 - a ，b ) 方法观察了当e 6 4 抑制c t s k 活性后 脂肪细胞i 型胶原的表达情况。两种方法得到相同的结果：第1 0 天时不应该表达 的i 型胶原仍然存在，且c t s k 活性越弱，i 型胶原表达越多。为了进一步验证 c t s k 活性与i 型胶原的相互关系，根据第一部分c t s k 发挥效应的时间窗为汇合 后o 一2 天，实验中对这一时间点进行干预，同样发现随着c t s k 活性减弱，i 型 胶原的蛋白表达明显增加( 图2 1 _ 8 ，b ) 。提示在脂肪细胞分化中，i 型胶原可能是 c t s k 发挥功能的重要靶点。 h 母交通大学仄学院2 0 0 3 级博十研究生学位论文 图1 8 _ a 图1 8 - b 图1 8i 型胶原在脂肪细胞分化过程中蛋白水平表达的改变 f i gl g ：c h a n g e so fc o l l a g e nie x p r e s s i o ni np r o t e i nl e v e l sd u r i n ga d i p o c y t ed i f f e r e n t i a t i o n 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博十研究生学位论文 图1 9e 6 4 时细胞进行干预后l 型胶原的表达一免疫组化( 第1 0 天) f 地1 9 ：e x p r e s s i o no f c o l l a g e nia f a re 6 4i n t e r v e n t i o ni nd a y1 0 - 一i m m u n o c y t o c h e m i s t r y 图2 0 一a 上海交通人学医学院2 0 0 3 级博l 研究生学位论文 图2 0 一b 图2 0e 6 4 对细胞进行干预后i 型胶原的表达一免疫印迹( 第1 0 天) f i g2 0 ：e x p r e s s i o n o f c o l l a g e n ia f t e r e 6 4 i n t e r v e n t i o n i n d a y l o - - i m m u n o b l o t t i n g 图2 1 _ a 上海交通大学医学院2 0 0 3 级博士研究生学位论文 图2 1 一b 图2 1e 6 4 对细胞进行干预后i 型胶原的表达一免疫印迹( 第2 天) f i g2 1 ：e x p r e s s i o no f c o l l a g e nia f t e re 6 4 i n t e r v e n t i o ni nd a y2 - - i m m u n o b l o