dickkopf1在多发性骨髓瘤中的作用.pdf

第二军医大学博士学位论文dickkopf1在多发性骨髓瘤中的作用姓名：顿晓熠申请学位级别：博士专业：内科学（血液）指导教师：侯健20090501第二军医大学博士学位论文dic k k o p fl 在多发性骨髓瘤中的作用摘要第一部分d k k l 在多发性骨髓瘤中的i i 缶床研究目的研究删患者骨髓上清液及血清d i c k k o p f l ( d k k l ) 水平，及其与骨髓瘤分期、溶骨性病变的关系，以及不同化疗方案对d k k l 的影响及与疗效的关系，探讨d k k l 在多发性骨髓瘤中的临床作用。方法采用双抗体夹心酶标免疫分析法( e l i s a ) 检测8 0 例初诊m m 患者、1 0 例m g u s 患者及2 0 例对照骨髓上清液及血清d k k l 水平，以及检测1 3 6 例接受硼替佐米+ 地塞米松或沙利度胺+ 地塞米松治疗的删患者化疗前后血清d k k l 水平。结果删患者与m g u s 患者相比，骨髓上清液d k k l 水平明显增高( 9 3 5 8 8 n g m lv s1 7 6 2 0 n g m l ，p = o 0 0 1 ) 。而m g u s 患者与对照组相比，d k k l水平无明显变化( 1 7 6 2 0 n g m lv s1 2 4 9 1 n g m 1 ，p 0 0 5 ) 。骨髓上清液组与血清组之间d k k l 水平无统计学差异( 9 3 5 8 8 n g m lv s9 2 4 3 7 n g m l ，p o 0 5 ) 。d k k l 水平与骨髓瘤分期( d u r i ea n ds a l m o n 分期) 相关，i i 期和i i i 期删患者骨髓上清液d k k l 水平明显高于i 期患者( i 期2 4 4 1 0 n g m lv si i 、i i i 期1 0 3 4 7 1 n g m l ，p = o 0 0 2 ) 。i 期m m 患者与m g u s 患者骨髓上清液d k k l 水平无统计学差异( p 0 0 5 ) 。使用i s s 分期也得到相似结果。重要的是，有溶骨性病变的患者骨髓上清液d k k l 水平明显高于没有溶骨性病变的患者( 1 1 2 2 7 2 n g m lv s2 4 3 4 8 n g m l ，p 3 ，分别为2 4 3 4 8 n g m l ，4 9 8 4 5 n g m l ，1 5 3 3 4 2 n g m l ，p o 0 5 ) 。硼替佐米+ 地塞米松( v d ) 组患者化疗前后血清d k k l 水平明显下降( 1 4 1 7 8 9 n g m lv s第二军医大学博士学位论文8 3 9 7 2 n g m l ，p 0 0 5 ) 。所有化疗有效( c r + p r ) m m 患者，化疗前后血清d k k i水平明显下降( 1 1 6 8 3 8 n g m lv s7 1 9 3 1 n g m l ，p 0 0 5 ) 。在t d 组，无论是化疗有效还是无效，化疗前后血清d k k i 水平均无明显变化( p 0 0 5 ) 。v d 组化疗有效者，化疗前后血清d k k i 水平显著下降( 1 3 3 4 9 2 n g m lv s5 9 7 6 9 n g m l ，p 0 0 5 ) 。结论删患者d k k i 水平明显高于m g u s 患者及对照组，而且d k k i 水平与骨髓瘤分期及溶骨性病变密切相关，能反映溶骨性病变的程度和范围。d k k i 水平在化疗有效时明显下降，但与化疗方案有关，硼替佐米能使d k k i 水平明显下降，而沙利度胺及地塞米松却无此作用。【关键词】多发性骨髓瘤，d k k i ，溶骨性病变，骨髓瘤分期第二部分骨髓瘤细胞与基质细胞d k k i 相关受体l r p 5 6 及k r e m e n l 2 基因转录水平的研究目的比较骨髓瘤细胞系、c d l 3 8 + 原代骨髓瘤细胞、删患者及f 常人基质细胞l r p 5 6 、k r e m e n l 2 及b c a t e n i nm r n a 水平，研究骨髓瘤细胞或重组d k k i蛋白对正常人基质细胞上述基因m r n a 水平的影响，以探讨d k k i 在多发性骨髓瘤中的作用。方法采用w e s t e r nb l o t 及e l i s a 方法，检测骨髓瘤细胞系、c d l 3 8 + 原代骨髓瘤细胞、骨髓基质细胞及细胞培养液d k k i 蛋白表达情况，以及r e a l t i m e p c r 方法，检测骨髓瘤细胞系、c d l 3 8 + 原代骨髓瘤细胞、删患者及正常人骨髓基质细胞l r p 5 6 、k r e m e n l 2 及b c a t e n i nm r n a 水平以及骨髓瘤细胞或重组d k k i 蛋白与正常人骨髓基质细胞共培养时上述基因m r n a 水平。结果骨髓瘤细胞系r p m i 一8 2 2 6 、n c i - h 9 2 9 和l p - i 以及3 5 例删患者c d l 3 8 + 骨髓瘤细胞，d k k i 蛋白表达明显，而4 例删患者基质细胞中未见d k k i蛋白表达，同时d k k i + 骨髓瘤细胞培养液中也检测到d k k i 蛋白。删患者基质细2第二军医大学博士学位论文胞l r p 5 6 和k r e m e n l 2m r n a 水平显著高于正常人基质细胞和c d l 3 8 + 原代骨髓瘤细胞。c d l 3 8 + 原代骨髓瘤细胞b - c a t e n i nm r n a 水平高于删患者及正常人基质细胞。无论使用t r a n s w e l l 小室或者直接接触法进行骨髓瘤细胞系r p m i - 8 2 2 6 、n c i - h 9 2 9 与正常人基质细胞共培养4 8 h 及7 2 h ，l r p 5 6 、k r e m e n l 2m r n a 水平明显增加，b - c a t e n i nm r n a 水平下降，但2 4 h 变化不明显。7 2 h 与4 8 h 相比，上述基因m r n a 水平变化更加明显。重组d k k l 蛋白浓度为l o o n g m l 及3 0 0 n g m l时，与基质细胞共培养4 8 h 及7 2 h 后l r p 5 6 、k r e m e n l 2 及t 3 一c a t e n i nm r n a 水平无明显变化。重组d k k l 蛋白浓度为5 0 0 n g m l 时，培养4 8 hl r p 5 6m r n a 水平有轻微上升( p o 0 5 ) ，k r e m e n l 2m r n a 水平有所上升( p o 0 5 ) ；培养7 2 hl r p 5m r n a 水平有所上升( p o 0 5 ) ；k r e m e n l 2m r n a 水平有所上升( p o 0 5 ) ，及b - c a t e n i nm r n a 水平明显下降( p o 0 5 ) 。重组d k k l 蛋白浓度为7 0 0 n g m l时，培养4 8 h 及7 2 hl r p 5 6 、k r e m e n l 2m r n a 水平明显上升( p o 0 5 ) ，及b c a t e n i nm r n a 水平明显下降( p o 0 5 ) 。结论骨髓瘤细胞、删患者及正常人基质细胞之间l r p 5 6 、k r e m e n l 2 及b - c a t e n i n 基因转录水平存在差异，而骨髓瘤细胞分泌的d k k l 可能是造成 l m患者基质细胞上述基因变化的重要因素。【关键词】骨髓瘤细胞，基质细胞，l r p s 6 ，k r e m e n l 2 ，b c a t e n i n第三部分d k k l 的真核表达、纯化及功能测定目的表达和纯化d k k l 蛋白，研究骨髓瘤细胞及基质细胞d k k l 相关受体表达情况，并探讨d k k l 对骨髓瘤细胞及基质细胞效应不同的可能机制。方法利用脂质体介导p c d n h 3 1 ( 一) 一d k k l 质粒瞬时转染2 9 3 t 细胞，使用w e s t e r nb l o t 方法鉴定上清中的表达蛋白，使用n i - h g r o s eh i s 标签蛋白纯化试剂盒，纯化融合h i s 标签的d k k l 蛋白。利用流式细胞术( f c m ) ，对c d l 3 8 +骨髓瘤细胞、删患者基质细胞及健康志愿者基质细胞表面d k k l 相关受体表达情况进行同步分析比较。第二军医大学博士学位论文结果使用脂质体转染法，成功将p c d n a 3 1 ( 一) 一d k k l 质粒瞬时转染2 9 3 t细胞，获得表达蛋白。使用特异性抗d k k l 抗体与小鼠抗6 h i s 单克隆抗体行w e s t e r nb l o t 鉴定重组蛋白，证实重组蛋白是融和了h i s 标签的d k k l 蛋白。流式细胞术显示，重组d k k l 蛋白能与c d l 3 8 + 骨髓瘤细胞、埘患者基质细胞及健康志愿者基质细胞特异性结合。其中健康志愿者基质细胞平均荧光强度( m f i ) 为2 0 8 8 4 ；c d l 3 8 + 骨髓瘤细胞m f i 为5 8 6 1 7 2 ；m m 患者基质细胞m f i 为1 0 4 53 2 1 。三组之间相比有统计学差异( p o 0 5 ) 。结论脂质体介导的质粒p c d n a 3 1 ( 一) 一d k k l 体外转染效率较高，能表达有活性的d k k l 蛋白，可以与骨髓瘤细胞及基质细胞d k k l 相关受体特异性结合。骨髓瘤细胞、基质细胞之间d k k l 相关受体蛋白表达量不同。【关键词】d k k i ，真核，表达，流式细胞术，平均荧光强度t her o l eo fd i c k k o p f li nm ul t i p l em y e l om aa b s t r ac tp a r ti ：c l i n i c a ls t u d yo fd k k li nm u l t i p l em y e l o m ao b j e c t i v et od e t e c tb o n em a r r o wp l a s m aa n ds e r u mc o n c e n t r a t i o n so fd i c k k o p f l ( d k k l ) i np a t i e n t sw i t hm u l t i p l em y e i o m aa n dp e r f o r mac o r r e l a t i v ea n a l y s i sb e t w e e nd k k i ，m y e l o m as t a g ea n dl y t i cb o n ed i s e a s ea n de v a l u a t et h ee f f e c to fd i f f e r e n tt r e a t m e n tr e g i m e n sf o rm mo ns e r u md k k ia n dt h er e l a t i o n s h i pw i t ht h er e s p o n s et ot r e a t m e n t m e t h o d sd k k ib o n em a r r o wp l a s m aa n ds e r u ml e v e l sw e r eq u a n t i f i e di n8 0n e w l yd i a g n o s e dm mp a t i e n t s 、1 0m o n o c l o n a lg a m m o p a t h yo fu n d e t e r m i n e ds i g n i f i c a n c e ( m g u s ) p a t i e n t sa n d2 0c o n t r o ls u b j e c t sb ye l i s a ，u s i n gam o n o c i o n a la n t i d k k la n t i b o d y a n ds e r u ms a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o m1 3 64第二军医大学博士学位论文结果使用脂质体转染法，成功将p c d n a 3 1 ( 一) 一d k k l 质粒瞬时转染2 9 3 t细胞，获得表达蛋白。使用特异性抗d k k l 抗体与小鼠抗6 h i s 单克隆抗体行w e s t e r nb l o t 鉴定重组蛋白，证实重组蛋白是融和了h i s 标签的d k k l 蛋白。流式细胞术显示，重组d k k l 蛋白能与c d l 3 8 + 骨髓瘤细胞、埘患者基质细胞及健康志愿者基质细胞特异性结合。其中健康志愿者基质细胞平均荧光强度( m f i ) 为2 0 8 8 4 ；c d l 3 8 + 骨髓瘤细胞m f i 为5 8 6 1 7 2 ；m m 患者基质细胞m f i 为1 0 4 53 2 1 。三组之间相比有统计学差异( p 0 0 5 ) b o n em a r r o wp l a s m ad k k il e v e l ss i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t hm y e l o m as t a g ea c c o r d i n gt od u r i ea n ds a l m o n ( m e a n2 4 4 1 0 n g m lv s 1 0 3 4 7 1 n g m li ns t a g eia n di i i i i ，r e s p e c t i v e l y ；p = 0 0 0 2 ) t h e r ew a sn od i f f e r e n c eb e t w e e nm mp a t i e n t si ns t a g eia n dm g u sp a t i e n t s ( p 0 0 5 ) t h e r ew e r es i m i l a rr e s u l t su s i n gi s ss t a g e i m p o r t a n t l y ，m y e l o m ap a t i e n t sw i t h o u tl y t i cl e s i o n si nc o n v e n t i o n a lr a d i o g r a p h yh a ds i g n i f i c a n t l yl o w e rd k k il e v e l st h a np a t i e n t sw i t hl y t i cb o n ed i s e a s e ( m e a n2 4 3 4 8n g m lv s 1 1 2 2 7 2 n g m l ；p 3l e s i o n s ：2 4 3 4 8 n g m lv s 4 9 8 4 5 n g ，m lv s 1 5 3 3 4 2 n g m l ；p o 0 0 1 ) i nt h i ss t u d y ，t h ee f f e c to fd i f f e r e n tt r e a t m e n tr e g i m e n sf o rm mp a t i e n t so ns e r u md k k lw a se v a l u a t e da n dc o r r e l a t e dw i t ht h er e s p o n s et ot r e a t m e n ti n1 3 6m y e l o m ap a t i e n t sr e c e i v i n gb o r t e z o m i ba n dd e x a m e t h a s o n e ( n = 7 2 ) ，t h a l i d o m i d ea n dd e x a m e t h a s o n e ( n = 6 4 ) as i g n i f i c a n td e c r e a s eo fd k k ia f t e rt h e r a p yw a ss e e ni nt h eb o r t e z o m i ba n dd e x a m e t h a s o n eg r o u p s ( m e a n1 4 1 7 8 9 n g m lv s 8 3 9 7 2 n g m l ；p o 0 5 ) w i t h i na l lg r o u p s ，as i g n i f i c a n td e c r e a s eo fd k k lw a so n l ys e e ni nr e s p o n d e r s ( i e p a t i e n t sa c h i e v i n gc o m p l e t er e m i s s i o no rp a r t i a lr e m i s s i o n ) ，b u tn o ti nn o n r e s p o n d e r s c o n c l u s i o nm y e l o m ap a t i e n t sh a v ei n c r e a s e db o n em a r r o wp l a s m ad k k la sc o m p a r e dw i t hp a t i e n t sw i t hm g u sa n dc o n t r o ls u b j e c t s b o n em a r r o wp l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fd k k ih a v ec l o s er e l a t i o n s h i pw i t hm y e l o m as t a g ea n dl y t i cb o n ed i s e a s e s e r u md k k il e v e l sd e c r e a s ei nm y e l o m ap a t i e n t s5第二军医大学博士学位论文r e s p o n d i n gt ot r e a t m e n t ，c o r e l a t ew i t ht h er e g i m e nc h o s e n k e yw o r d s d k k i ；m u l t i p l em y e l o m a ；l y r i cb o n ed i s e a s e ；m y e l o m as t a g ep a r ti hg e n ee x p r e s s i o no fd k k ir e c e p t o rl r p 5 6a n dk r e m e nl 2i nm y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a lc e l l so b j e c t i v et oc o m p a r et h eg e n ee x p r e s s i o no fl r p 5 6 、k r e m e n l 2a n d $ - c a t e n i ni nh u m a nm y e l o m ac e l ll i n e s ，c d l 3 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l s ，s t r o m a lc e l l so fm u l t i p l em y e l o m ap a t i e n t sa n dh e a l t h yv o l u n t e e r sa n di n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm u l t i p l em y e l o m ac e l l so rr h d k k l o ng e n ee x p r e s s i o ni ns t r o m a ic e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sa n di d e n t i f yt h er o l eo fd k k ii nm u l t i p l em y e l o m a m e t h o d sd k k ip r o t e i ne x p r e s s i o nw a sc h e c k e di nh u m a nm y e l o m ac e l ll i n e s ，c d l 3 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l s ，s t r o m a lc e l l sa n dm y e l o m ac e l lc o n d i t i o nm e d i au s i n gw e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n de l i s aa s s a y l r p 5 6 、k r e m e n l 2a n d i - c a t e n i nmr n ae x p r e s s i o ni nh u m a nm y e l o m ac e l ll i n e s ，c d13 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l s ，s t r o m a lc e l l so fm u l t i p l em y e l o m ap a t i e n t sa n dh e a l t h yv o l u n t e e r sw e r et e s t e db yr e a l t i m e - p c rt oc o m p a r et h ee f f e c to fm u l t i p l em y e l o m ac e l l so rr h d k k io ng e n ee x p r e s s i o ni nh u m a ns t r o m a lc e l l s ，w ed i dr e a l t i m ep c rf o rl r p 5 6 、k r e m e nl 2a n dp - c a t e n i nm r n ae x p r e s s i o ni ns t r o m a ic e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sc o c u l t u r e dw i t hm u l t i p l em y e l o m ac e l l so rr h d k k i r e s u l t sd k k lw a sp r o d u c e db ym u l t i p l em y e l o m ac e l l s ，n o ts t r o m a lc e l l s d k k lw a sd e t e c t a b l ei nm y e l o m ac e l lc o n d i t i o nm e d i a ，a sw e l l l r p 5 6a n dk r e m e n1 2m r n ae x p r e s s i o ni ns t r o m a lc e l l so fm u l t i p l em y e l o m ap a t i e n t sw e r eh i g h e rt h a nt h a ti ns t r o m a ic e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e ra n dc d l 3 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l s p - c a t e n i nm r n ae x p r e s s i o ni nc d l 3 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l sw a sh i g h e rt h a nt h a ti ns t r o m a lc e l l so fm u l t i p l em y e l o m ap a t i e n t sa n dh e a l t h y6第二军医大学博士学位论文v o l u n t e e r s g e n ee x p r e s s i o no fl r p 5 6 ，k r e m e n l 2w a se l e v a t e di ns t r o m a lc e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sa f t e r4 8 h - 7 2 ho fc o c u l t u r ew i t hh m c l sr p m i - 8 2 2 6i nt h ep r e s e n c eo ra b s e n c eo fat r a n s w e l li n s e r t as i g n i f i c a n ti n h i b i t o r ye f f e c tw a so b s e r v e do nt h ee x p r e s s i o no fp - c a t e n i ni ns t r o m a lc e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sa f t e r4 8 h - 7 2 ho fc o c u l t u r ew i t hm u l t i p l em y e l o m ac e l l s n os i g n i f i c a n te f f e c tw a so b s e r v e do nt h eg e n ee x p r e s s i o na f t e r2 4 hc o c u i t u r e s i m i l a rr e s u l t sw e r eo b t a i n e dw i t ht h eh m c l sn c i h 9 2 9i nc o c u l t u r e ( d a t an o ts h o w n ) w ee x a m i n e dt h ee f f e c to fr h d k k io nl r p 5 6 ，k r e m e n l 2a n dp - c a t e n i nm r n ae x p r e s s i o ni ns t r o m a lc e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r s t h el e v e l so fl r p 5 6a n dk r e m e n l 2g e n ee x p r e s s i o ni ns t r o m a lc e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sw e r eh i g h e s ta t7 2 hp o s tr h d k k l ( a tc o n c e n t r a t i o n7 0 0n g m l ) t r e a t m e n t a n dp - c a t e n i nm r n ae x p r e s s i o ni ns t r o m a lc e l l so fh e a l t h yv o l u n t e e r sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya tt h es a m et i m e c o n c l u s i o nl r p 5 6 、k r e m e n l 2a n dp - c a t e n i ng e n ew e r ee x p r e s s e dd i f f e r e n t l yi nh u m a nm y e l o m ac e l ll i n e s ，c d l 3 8 + p r i m a r ym y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a lc e l l s a n dd k k lp r o d u c e db ym y l o m ac e l l sm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed i f f e r e n tg e n ee x p r e s s i o ni ns t r o m a lc e l l sb e t w e e nm u l t i p l em y e l o m ap a t i e n t sa n dh e a l t h yv o l u n t e e r s k e yw o r d s m y e l o m ac e l l s ；s t r o m a lc e l l s ；l r p 5 6 ；k r e m e nl 2 ；p - c a t e n i np a r ti i i ：e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n df u n c t i o n a le x a m i n a t i o no fd k k lo b j e c t i v et oe x p r e s s ，p u r i f yd k k l ，a n di n v e s t i g a t et h eb i n d i n gc a p a c i t yo fi t sr e c e p t o ro nt h ec e l lm e m b r a n eo fm y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a lc e l l s m e t h o d sv e c t o rp c d n a 3 1 ( - ) - d k k lw a st r a n s f e c t e di n t o2 9 3 tc e l l sw i t hl i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0r e a g e n t d k k l p r o t e i ni nt h es u p e r n a t a n tw a si d e n t i f i e d7第二军医大学博士学位论文b yw e s t e r nb l o t w i t ht h en i a g r o s eh i sp r o t e i np u r i f i c a t i o nk i t ，d k k lp r o t e i nw a sp u r i f i e d f l o wc y t o m e t r y ( f c m ) w a su s e dt os t u d yd k k l - b o u n dr e c e p t o ro nt h ec e l lm e m b r a n eo fm y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a ic e l l s r e s ul t sw i t hl i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0r e a g e n t ，t h em a m m a l i a ne x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 1 ( - ) - d k k lw a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f e c t e di n t o2 9 3 tc e l l s i nt h es u p e r n a t a n t ，d k k ip r o t e i nw a sc o l l e c t e d u s i n ga n t i d k k ia n t i b o d ya n da n t i h i sa n t i b o d y ，d k k if u s i o np r o t e i ni nt h es u p e r n a t a n tw a si d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o t f l o wc y t o m e t r yr e s u l t ss h o w e dt h a td k k ip r o t e i nc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt h er e c e p t o ro nt h ec e l lm e m b r a n eo fm y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a lc e l l s t h em e a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ( m f i ) o fr e c e p t o ro nm y e l o m ac e l l s ，s t r o m a lc e l l so ft h eh e a l t h yv o l u n t e e r sa n dm y e l o m ap a t i e n t sw e r e ( 5 8 6 = 1 ：1 7 2 ) ，( 2 0 8 士8 4 ) ，( 1 0 4 5 j ：3 2 1 ) ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ea m o n gt h r e eg r o u p s ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o nu s i n gm a m m a l i a ne x p r e s s i o nv e c t o r , d k k ip r o t e i nw a so b t a i n e da n ds h o w e dah i g hb i o l o g i c a la c t i v i t ya n dc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt h er e c e p t o r t h ea m o u n to fr e c e p t o ro fd k k lp r o t e i ns p e c i f i c a l l yb i n d i n go nt h ec e l lm e m b r a n eo fm y e l o m ac e l l sa n ds t r o m a lc e l l sw e r ed i f f e r e n t k e yw o r d s d k k l ；e u k a r y o t i c ；e x p r e s s i o n ；f c m ：m f i8m mm b dd k k lw n t i - c a t e n i nl r pm g u si m w gf b sp b sf c mp c rc rp rp de d t am r n ao bo cg s k 一3 pa p cc l ( i 旺p k cb m s ct c fl e f中英文缩略词m u l t i p l em y e l o m a多发性骨髓瘤m y e l o m ab o n ed i s e a s e骨髓瘤骨病d i c k k o p f lw n t 拮抗剂w i n g l e s s + i n tw n tb e t a - c a t e n i nb 一连环素l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r - r e l a t e d 低密度脂蛋白相关p r o t c l n蛋白m o n o c l o n a lg a m m o p a t h yo fu n d e t e r m i n e d 意义未明的单克隆免s i g n i f i c a n c e疫球蛋白血症i n t e r n a t i o n a lm y e l o m aw o r k i n gg r o u p国际骨篦瘤协作组f a t a lb o v i n es e r u m胎牛血清p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液f l o wc y t o m e t r y流式细胞术p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应c o m p l e t er e m i s s i o n完全缓解p a r t i a lr e m i s s i o n部分缓解p r o g r e s s i v ed i s e a s e疾病进展d i s o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e乙二胺四乙酸m e s s e n g e rr n a信使核糖核酸o s t e o b l a s t成骨细胞o s t e o c l a s t破骨细胞g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e3 p糖原合成激酶一3ba d e n o m a t o u sp o l i o s i sc o l i大肠腺瘤息肉蛋白c a s e i nk i n a s el a酪蛋白激酶iqp r o t e i nk i n a s ec蛋白激酶cb o n em a r r o ws t r o m a lc e l l骨髓基质细胞tc e l lf a c t o r，t细胞因子l y m p h o i de n h a n c i n gf a c t o r淋巴样增强因子独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：陵唾鹚签字日期：渺罗年j 月玎日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：娩睦熠轴签名：彳zf 也签字日期：瑚罗年丁月2 ，日签字日期：o 仇乍3 j 巧1f第二军医大学博士学位论文ii j 一刖吾多发性骨髓瘤( m u l t i p l em y e l o m a ，删) 是伴有溶骨性病变的恶性浆细胞疾病，作为主要发生在骨髓内的恶性肿瘤，瘤细胞的生长与骨髓微环境的关系十分密切，而与骨病相关的成骨细胞、破骨细胞、基质细胞等是组成微环境的主要内容，他们之间的相互关系不但与姗骨病发生有关，同时也与瘤细胞的生长、存活及疾病进展等直接相关，探索删骨病发生机制，有可能为删的发病机制及治疗提供新的方向和线索。w n t 信号传导途径在胚胎发育、造血系统发育、肿瘤发生中发挥重要作用。d i c k k o p f l ( d k k l ) 是能够直接与跨膜受体相互作用而抑制w n t 信号传导的分泌性抑制因子，可直接作用于细胞而无需与w n t 因子相互作用。d k k l 与跨膜蛋白k r e m e n l ( k r m l ) k r e m e n 2 ( k r m 2 ) 及l r p 5 6 形成复合物，促进l r p 5 6 受体胞膜内吞，而从w n t 受体复合物脱离，抑制经典w n t 信号传导途径。溶骨性病变的发生主要是由于破骨细胞活性增强和成骨细胞活性减弱所致。强有力的证据表明经典w n t 信号传导途径对正常骨发育和肿瘤相关骨病的发生是非常重要的。w n t 信号传导途径通过直接影响成骨细胞以及间接影响破骨细胞的成长发育而成为骨再生的重要调节因素。骨髓瘤细胞分泌大量w n t 拮抗剂d k k l ，抑制经典w n t 信号传导途径，阻碍骨髓基质细胞向成骨细胞的分化，导致骨髓瘤骨病和疾病进展。通过微点阵技术，明确d k k l 基因表达与骨髓瘤溶骨性病变是密切相关的。有关骨髓瘤细胞影响成骨细胞形成和功能的可能机制尚处于研究之中。近来发现，骨髓瘤细胞通过影响成骨细胞前体的转录因子r u n x 2 的活性而影响成骨的形成。然而也可能存在导致删成骨功能缺陷的其他机制。既往文献报道，沙利度胺、雷利度胺及糖皮质激素均能上调d k k l 的表达，而硼替佐米在体内外均能促进成骨细胞前体的分化，它的抗骨髓瘤效应与删患者血清中d k k l 水平下降相关。在骨髓瘤的治疗中，沙利度胺、雷利度胺、地塞米松与硼替佐米联用，硼替佐米能否克服上述药物在骨代谢方面的不良反应，有待研究。删患者与正常人骨髓基质细胞的生物学特性有所不同。在同样的骨髓微环境下，骨髓瘤细胞分泌大量d k k l ，通过影响w n t 信号传导途径而抑制基质细胞9第二军医大学博士学位论文成骨细胞前体向成骨细胞的分化，但却不能抑制骨髓瘤细胞经典w n t 信号传导途径，具体原因尚不清楚。所以我们提出，是不是由于删患者基质细胞与骨髓瘤细胞及正常人基质细胞之间，d k k l 相关受体l r p 5 6 及k r e m e n l 2 的表达存在差异，而造成m m 患者基质细胞及骨髓瘤细胞对d k k l 的反应不同?为进一步了解d k k l 在骨髓瘤中的作用，本研究内容包括：( 1 ) 、d i c k l在多发性骨髓瘤中的临床作用，我们检测m m 患者、m g u s 患者及对照组骨髓上清液及血清d k k l 水平，了解d i e d ( 1 水平与骨髓瘤分期及溶骨性病变的关系，以及m m 患者接受t d 、v d 化疗前后血清