外源NO对UV-B胁迫下红松幼苗生理特性的影响论文.pdf

摘要 摘要 2 6 8 16y 2 0 平流层臭氧的减少会导致到达地球表面的u v - b ( 2 8 0 - 3 2 0r i m ) 辐射显著增强，增强 的u v - b 辐射对生物体有明显的生物学效应。一氧化氮( n o ) 作为u v 辐射的第二信 使，已成为当前植物逆境生理和信号转导领域的研究热点。本文分别研究了增强u v - b 辐射、施加外源n o 供体及二者复合作用对红松( p i n u sk o r a i e n s i s ) 幼苗光合作用、自 由基含量、抗氧化酶活性、类黄酮含量等生理生化指标的影响，以此在不同层次探讨红 松幼苗对环境u v - b 辐射增强、n o 浓度升高的生态适应机制，探明外源n o 对u v - b 胁迫下红松幼苗生理特性的影响。主要结果如下： u v - b 辐射增强显著提高红松针叶内羟基自由基( o h ) 、过氧化氢自由基( h 2 0 2 ) 和m d a 含量；u v - b 辐射增强诱导过氧化氢酶( c a r ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 活性升高，显著降低过氧化物酶( p o d ) 活性( p o 0 5 ) 。下同。 v a l u e sa r et h em e a n 士s e ，n - - - 9 m e a m w i t h i nac o l u m nw i t hd i f f e r e n tl o w e r c a s e , l e t t e r s 。a r es i g n i f i c a n t l y ，一一h - 一一一一 d i f f e r e n t ( p t 2 t i c k 。t 3 处理叶片的m d a 含量增加最多，为1 2 5 6m m o l g - 1 ，和c k 相 比增加了1 3 1 9 。方差分析结果表明t 1 、t 2 、t 3 处理叶片的m d a 含量与c k 差异均 达到显著水平( p t 2 t i c k 。t 3 处理叶片h 2 0 2 含量最高，为1 4 9 0 5i x m o l g ，和c k 相比增加了 1 3 2 5 。u v - b 处理红松针叶的h 2 0 2 含量与c k 差异均达到显著水平( p t i t 2 t 3 。t 1 处理果糖含量最大，为0 0 6 2 7m g 9 1 ，与 对照相比增加了1 0 7 8 ，t 2 和t 3 处理则降低了果糖含量。 。表2 - 3 增强i w - b 辐射对红松针叶可溶性糖含量的影响 t a b l e2 一e f f e c t so f e n h a n c e du v - br a d i a t i o no ng l u c o s e , f r u c r o s e ，a n ds u c r o s ec o n c e n t r a t i o n si nn e e d l e so f p h m sk o r a i e n s i s w - b 处理 果糖含量 ( m g 茁1 ) 葡萄糖含量 ( m g g - 1 ) 蔗糖含量 ( r a g g - 1 ) c k 0 0 5 6 6 士0 0 1 5 l a b 0 0 0 8 9 - 土0 0 0 5 8 a0 0 0 8 3 4 - 0 0 0 3 7 a 0 0 6 2 7 士0 0 2 0 3 a 0 0 0 7 9 士0 0 0 3 8 a t 2 0 0 5 0 9 土0 0 0 0 2 a b 0 0 0 6 1 士0 0 0 0 3 a b0 0 0 5 2 士0 0 0 0 5 b “ 1 3 0 0 3 3 6 - ：如0 0 0 9 b 0 0 0 3 5 4 - 0 0 01 4 b 0 0 0 3 4 4 - 0 0 0 1 2 c 数值为平均数士标准差，n = 6 。v a l u e sa r et h em e a n 士s e ，n = 6 2 2 9u v - - b 辐射增强对红松针叶u v - - b 吸收化合物含量变化的影响 表2 4 增强u v - b 辐射对红松针叶u v - b 吸收化合物含量的影响 t a b l e2 - 4e f f e c t so fu v - br a d i a t i o no nc o n t e n t so f u v - b a b s o r b i n gc o m p o u n d s i nn e e d l e so f p i n u s k o r a i e n s i s l w - b 处理 总酚含量 ( m g g - 1 ) 黄酮含量 ( m g g - 1 ) 缩合单宁含量 ( n a g 9 1 ) c k 4 2 2 4 4 - 1 0 0 4 a 3 7 8 2 4 - 1 4 9 2 a11 5 7 3 士1 3 7 4 a t 1 t 2 3 7 3 4 士- 0 9 5 1 b 3 3 4 2 - - 士o 3 7 6 b1 0 1 8 7 士1 2 5 3 b 3 9 4 5 ：1 ：1 4 3 2 b3 5 31 i - 0 8 4 6 c 1 0 3 31 士2 2 0 5 b t 3 3 9 5 3 4 - 1 2 7 4 b3 5 3 9 - 士0 6 81 c 11 4 6 8 士1 0 6 2 a 数值为平均数士标准差。( n - 3 ) 。v a l u e sa r et h em e a n 士s e ，( n - 3 ) 本文对不同u v - b 处理4 0d 后红松幼苗针叶中总酚、黄酮、缩合单宁含量进行测 定，结果见表2 - 4 。从表2 - 4 可以看出，不同u v - b 处理之间叶片中总酚、黄酮、缩合 2 2 2 增强l b 辐射对红松幼苗生理特性的影响 单宁的含量达到显著性差异。u v - b 处理对红松幼苗针叶中总酚、黄酮、缩合单宁的含 量的影响趋势一致，与对照相比，u v - b 处理导致红松幼苗针叶总酚、黄酮、缩合单宁 的含量都低于对照，但随u v - b 辐射处理剂量的增强而增加，表现为c k t 3 t 2 t 1 。 t l 处理总酚、黄酮、缩合单宁含量最少，和对照相比分别减少了1 1 6 0 、1 1 6 3 、 1 1 9 8 。u v - b 处理组和对照组叶片中总酚、黄酮的含量达到显著性差异( p t 2 t i c k ，p o d 活性表现为t 3 t i t 2 t 3 。由此可见，高剂量的 u v - b 辐射长期处理抑制了红松针叶蜡质的积累。通过对4 个u v - b 处理红松幼苗针叶 蜡质化学成分的比较发现，红松蜡质主要化学成分为烷类，比重占5 0 以上，并且随着 u v - b 辐射处理强度的加强而降低，表现为c k t i t 2 t 3 。其次为烯萜类和酯类，比重 各占1 0 左右，酯类的比重随着u v - b 辐射处理强度的加强而增加，表现为 t 3 t 2 t 1 c k 。酚类成分随着u v - b 辐射处理强度的加强而降低，表现为 c k t i t 2 t 3 。 表2 - 6 增强u v - b 辐射4 0d 后对红松针叶蜡质含量和化学成分的影响 t a b l e2 - 6 e f f e c t so fe n h a n c e du v - br a d i a t i o no na m o u n ta n dc h e m i c a lc o m p o s i t i o no fe p i c u t i c u l a rw a x e si n 2 4 n e e d l e so f p i n u sk o r a i e n s i sa f t e r4 0d a y so fe x p o s u r e w b 处理蜡质含 【l x g c n 门 烷类酯类烯萜类酚类伯醇醛类 未检出成 【嘲瞰】【吲 】【吲【啊分 吲 蜡质含量数值为平均数士标准差，n = 3 。v a l u e sa r et h em e a n 士s e ，n = 3 2 2 12 肼b 辐射增强对红松幼苗生理指标之间的相关性 表2 7u v - b 胁迫下红松幼苗生理指标之间的相关性 t a b l e2 - 7c o r r e l a t i o no nt h ep h y s i o l o g i c a li n d e x e so f p i n u sk o r a i e n s i ss e e d i n g su n d e ru v - bs t r e s s ：p 0 8 。抗氧化酶之间a p x 和c a t 间 存在极显著的正相关关系( p t i t 2 t 3 。与对照相比，t 2 和t 3 处理则降低了 果糖含量。 一“ ( 6 ) u v - b 处理对红松幼苗针叶中总酚、黄酮、缩合单宁的含量的影响趋势一致，与 ， ，对照相比k 姓b 处理导致红松幼苗针叶总酚、黄酮、缩合单宁的含量都低于对 照，但随u v - b 辐射处理剂量的增强而增加，表现为c k t 3 t 2 t 1 。长时间的 u v - b 辐射胁迫抑制了u v - b 吸收化合物含量的积累。 ( 7 ) 与对照相比，u v b 胁迫处理导致c a t 、a p x 、s o d3 种保护酶活性增强，p o d 活性则表现明显下降趋势。u v - b 辐射处理显著激发了红松幼苗叶片中的s o d 活 性，且随u v - b 辐射剂量的增强而增加：u v - b 辐射则明显抑制了p o d 活性，且 随着u v - b 辐射剂量增强而下降；c a t 和a p x 没有明显的变化趋势。 ( 8 ) 经过4 0du v - b 辐射后红松针叶表面蜡质条纹状隆起断裂，破碎，条纹状隆起数 量减少，蜡质颗粒增多。与对照相比，u v - b 处理组红松针叶蜡质含量均降低， 且随u v - b 辐射处理强度的加强而降低，高剂量的u v - b 辐射长期处理抑制了红 松针叶蜡质的积累。红松幼苗针叶蜡质化学成分中烷类是主要成分，比重占5 0 以上，并且随着u v - b 辐射处理强度的加强而降低；酯类的比重随着u v - b 辐射 处理强度的加强而增加，表现为t 3 t t 1 c k 。 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 n o 是一种广泛存在于生物体内的气体活性分子，也是一种活性氮( r e a c t i v e n i t r o g e ns p e c i e s ，r n s ) t s l 】。在植物体内主要通过n o s 和n r 催化形成。植物体内产生 的n o 不仅是生长发育的调节分子，且在任何生长环境下都能发挥其生理调控作用 1 9 2 。b e l i g n i t l 8 3 】认为植物n o 具有双重生理效应，其中高浓度n o 具有生理毒性，而低 浓度n o 则有保护作用，并与细胞的微环境和n o 的实际浓度有关。适当浓度的n o 可 缓解逆境条件下植物受到的氧化伤害 1 8 4 】。 研究表明，n o 可以影响植物的生长和光合作用过程，而且n o 对植物生长的影响 呈浓度依赖性【1 8 5 】。高浓度n o 抑制番茄生长，而低浓度n o 则促进生长；在葛笋和豌 豆中也发现同样的试验结果【7 4 , 1 8 6 】。徐茂军等研究结果也表明，高浓度n o 抑制长春花等 植物细胞的生长，而低浓度n o 则促进细胞生长【1 8 7 1 。高浓度n o 处理豌豆叶片可以诱 发胁迫症状，用浓度相当于1m mn o 的s n p 处理豌豆叶片可以看到脂氧合酶( l o x ) 活性显著降低1 1 8 8 j 。这些都表明，高浓度n o 也可以是胁迫诱导因子。 因此，本试验选用不同浓度的n o 供体s n p 对红松幼苗进行处理，旨在探讨不同 浓度外源n o 信号对红松针叶光合能力和生理特性的影响，明确外源n o 优化调控红松 幼苗生长生理的最适浓度。 3 1 材料与方法 3 1 1 试验材料与试验设计 试验在东北林业大学森林植物生态学重点实验室温室内进行。试验材料为3 年龄红 松幼苗，于帽儿山林场苗圃区移取，并采用盆栽的方式在东北林业大学森林植物生态学 教育部重点实验室的温室内进行日常管理和培育。供试土壤的基本理化性状为：p h 值 5 6 、有机质2 5 、速效氮2 0 0m g k g 一、速效磷9 0m g k g 、速效钾2 0 0m g k g 。将幼 苗随机分为5 组，每组5 0 株。外源n o 供体采用硝普钠( s o d i u mn i t r o p p r u s s i d e ，s n p ， 购自上海国药集团公司) ，先用蒸馏水配制lm m 的母液，4 “ c 保存，用时按试验所需的 浓度进行稀释。一组为对照组，不使用s n p 处理，其余4 组分别使用浓度为0 0 1 m m 、0 1m m 、0 5m m 、1 0m ms n p 溶液喷施处理红松幼苗。s n p 处理组用不同浓度 s n p 溶液1 0 0m l 均匀喷施于叶面，c k 组喷施清水。处理7d 后测定各项生理指标，每 个处理均随机取样。 3 1 2 试验方法 3 1 2 1a p a r 响应曲线的测定方法 见2 1 2 1 。 3 1 - 2 - 2 光合参数测定方法 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 在实验处理周期内，晴朗天气上午，选取己完全展开的生长状况良好、叶位一致的 叶片，用美国l i c o r 公司生产的l i 6 4 0 0 便携式光合仪在开放气路下测定。测定光强 设定为o 和1 0 0 01 t m o l i n - 2 s ，c 0 2 浓度4 0 0l x m o l m o l 一( a i r ) ，叶片温度2 5 + 2 “ c 。上午 9 ：o o 1 1 ：o o 测定净光合速率( p n ) 、气孔导度( g s ) 、胞间c 0 2 浓度( c i ) 、蒸腾速率 ( t r ) 等各项指标，每个处理测定3 株，每株重复测定3 次，取平均值。 3 1 2 3 光合色素含量测定方法 见2 1 2 5 。 3 1 2 4 过氧化氢( h 2 0 2 ) 自由基含量测定方法 见2 1 2 3 。 3 1 2 5m d a 含量测定方法 见2 1 2 4 。 3 1 2 6 可溶性蛋白含量测定方法 见2 1 2 6 。 3 1 2 7 类黄酮含量测定方法 称取新鲜叶片o 5g ，加1 0m l 酸性甲醇溶液( 甲醇、水、盐酸体积比为7 9 “ 2 0 ： 1 ) ，室温下研磨；于5 5 水浴中提取3 0m i n 。30 0 0r m i n 离心1 0r a i n ，定容至1 0m l ， 然后用紫外可见光分光光度计在波长3 0 0n l i l 处比色，类黄酮含量以3 0 0n l n 处的o d 值表示，单位o d 3 0 0 g 。1 f w 1 8 9 1 。一一 3 1 2 8 抗氧化酶活性测定方法 见2 1 2 9 。 3 1 2 9 统计分析 试验中所得数据均采用e x c e l 2 0 0 7 软件制图、s p s sl1 0 软件执行统计学分析，每个 处理所得数据取平均值并求标准误( 平均值4 - 标准误) 。通过单因素方差检验( p 0 5m m c k 1m m 0 0 1 m m 。不同浓度s n p 处理对红松幼苗的净光合速率产生了明显的作用。 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 ，- 、 们 弋 一 o u 。 斟 增 o 0 5 ) 。下同 v a l u e sa l et h em e a n 4 - s e ，n = 6 m e a n sw i t h i nac o l u m nw i t hd i f f e r e n tl o w e r c a s el e t t e r sa l es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p 如0 5 ) m e a n sw i t h i nac o l u m nw i t ht h es a m el o w e r c a s el e t t e ra l en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e o 0 5 ) t h es a m eb e l o w 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中光合参数进行测定，结果见表3 1 。表 3 1 显示最大净光合速率和饱和光强随着s n p 处理浓度的加强而增加，只有0 0 1m m 浓 度s n p 处理低于c k ，其余处理都增强了最大净光合速率和饱和光强，且随着s n p 处 理浓度的增强而增加，表现为1m m 0 5m m o 1m m c k 0 0 1m m 。光补偿点和 暗呼吸速率最小值则出现在o 1m m 浓度s n p 处理。其余浓度s n p 处理则增加了光补 偿点和暗呼吸速率的值，最大值分别出现在1m m 和o 5m m 浓度s n p 处理。 表3 1 不同浓度s n p 处理对红松幼苗净光合速率、气孔导度、胞间c 0 2 浓度、 蒸腾速率的影响 t a b l e3 - 2e f f e c t so nt h en e e d l e sn e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ( p n ) ，s t o m a t a lc o n d u c t a n c e ( g s ) ，i n t e r c e l l u l a rc 0 2 c o n c e n t r a t i o n ( c i ) a n dt r a n s p i r a t i o nr a t e ( t r ) o f p i n u sk o r a i e n s i ss e e d l i n g so fs n p w i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o i l s 数值为平均数4 - 标准差，n = 3 。v a l u e sa r et h em e a n 4 - s e ，n = 3 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中光合参数进行测定，结果见表3 - 2 。由 表3 2 可知，不同浓度s n p 处理对净光合速率、气孔导度、胞间c 0 2 浓度和蒸腾速率 的影响不同。净光合速率、蒸腾速率最大值出现在0 1m m 浓度s n p 处理，气孔导度、 胞间c 0 2 浓度最大值出现在o 0 1m m 浓度s n p 处理。与对照相比，不同浓度s n p 处理 均显著提高了胞间c 0 2 浓度和蒸腾速率的值。净光合速率最小值出现在o 0 1m m 浓度 s n p 处理，这与光合曲线变化趋势一致。 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 3 2 3 不同浓度s n p 对红松针叶光合色素的影响 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中光合色素含量进行测定，结果见表3 3 。由表3 3 可知，不同浓度s n p 处理红松幼苗7d 后光合色素含量表现为0 0 1m m 1 m m c k 0 5m m 0 1m m ，叶绿素a 、叶绿素b 、类胡萝b 素、总叶绿素含量最大值 出现在0 0 1m m 浓度s n p 处理，最小值出现在0 1m m 浓度s n p 处理。 表3 3 不同浓度s n p 处理对红松幼苗针叶光合色素的影响 t a b l e3 - 3e f f e c t so f fp i g m e n t sc o n c e n t r a t i o n si nn e e d l e so f p i n u sk o r a i e n s i ss e e d l i n g so fs n pw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s 1 1 2 7 士0 0 9 6 b0 4 2 3 ：士- 0 0 3 2 b0 18 5 士0 0l7 b1 5 4 9 4 - 0 018 b 2 2 1 5 4 - 0 7 0 3 a0 6 9 1 士0 1 2 0 a0 4 1 8 4 - 0 1 4 2 a2 9 0 6 4 - 0 8 1 3 a 0 8 9 9 4 - 0 0 2 7 b0 3 3 4 4 - 0 0 0 9 b0 14 5 4 - 0 0 0 6 b1 2 3 3 士0 019 b 0 9 5 4 士0 1 6 2 b0 3 5 5 4 - 0 0 4 7 b 0 1 4 6 4 - 0 0 2 3 b 1 3 0 9 4 - 0 2 0 9 b 1 1 1 6 ：t - 0 0 7 l b0 4 1 8 士0 0 2 4 b0 2 0 1 4 - 0 0 1 5 b1 5 6 4 士0 0 9 5 b7 。 数值为平均数士标准差，n = 9 。v a l u e sa r et h em e a n 4 - s e ，n = 9 3 2 4 不同浓度s n p 对红松针叶h 2 0 2 含量的影响 3 蜘 一2 网 c 乃 o l = 瑚 也 “ o n - r - 豇 蘸蚕萋蚕 筐翼 匡薰 匿 蹩三基 匿蚕蚕蛰 筐塞 匡薹墓碧 鏖圣雾 c o (咖 至0 l 1 嘶0 5 m 1 旺 _ i s n p 处理 3 7 o 吣 m 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 图3 - 2 不同浓度s n p 处理红松幼苗针叶h 2 0 2 含量的影响( n = 3 ) f i g 3 - 2e f f e c t so nh 2 0 2c o n t e n ti nn e e d l e so f p i n u sk o r a i e n s i so fs n pw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 不同处理间差异显著性以不同字母标注，有一个字母相同即为差异不显著( p 0 0 1r n m 0 5m m 1m m c k 。 3 2 5 不同浓度s n p 对红松针叶m d a 含量的影响 d 1 0 工 露至雾 i 筐翼薰 鏖霎 i 重量誊 【筐薹蚕 5r 筐茎茎薹 0 【董量星量 a ( 寓 露冒 鏖萝匪雪 屋舅 震国 亘亘 匡舅 重亘 i 冀翼囊窜匿薹薹| | 鬯，霞 c 匡警 匡蚕 匿 羼垂| | 耋i 宦蚕 匡蚕委雪 筐碧 匡蠹 图3 - 3 不同浓度s n p 处理红松幼苗针叶m d a 含量的影响( n = 3 ) f i g 3 - 3e f f e c t so nm d a c o n t e n ti nn e e d l e so f p i n u sk o r a i e n s i so fs n pw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中m d a 含量进行了测定，结果见图3 3 。由图3 3 可知，不同浓度s n p 处理都显著提高了m d a 的含量。其中，o 1m m 浓度 s n p 处理m d a 含量最高，为1 6 9 0m m o l g f w ，1m m 浓度s n p 处理m d a 含量增加 最少。表现为0 1m m 0 5m m 0 0 1r n m 1m m c k 。 3 - 2 - 6 不同浓度s n p 对红松针叶可溶性蛋白含量的影响 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中可溶性蛋白含量进行了测定，结果见 图3 4 。由图3 4 可知，不同浓度s n p 处理都显著提高了可溶性蛋白的含量。其中， o 0 1m m 浓度s n p 处理可溶性蛋白含量最高，o 5m m 浓度s n p 处理可溶性蛋白含量增 加最少。表现为o 0 1m m 0 1m m l m m o 5m m c k 。 圭霾冀藿霾蚕需 一一_6二。量三一鲻缸 0 1m m l m m c k 0 5m m 。 3 2 8 不同浓度s n p 对红松针叶抗氧化酶活性的影响 本文对不同浓度s n p 处理后红松幼苗针叶中抗氧化酶活性进行了测定，结果见表 3 4 。由表3 - 4 可知，不同浓度s n p 处理对抗氧化酶活性影响不同。和对照相比，0 0 1 和o 1i n m 浓度s n p 处理显著提高了c a t 活性( p 0 1m m o 0 1m m 1m m 0 5m m 。其中c a t 、a p x 、p o d 活性最小值 出现在lr a m 浓度s n p 处理，s o d 活性最小值出现在o 5m m 浓度s n p 处理。 表3 - 4 不同浓度s n p 处理对红松幼苗针叶抗氧化酶活性的影响 t a b l e3 - 4e f f e c t so nt h ea c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e si nn e e d l e so f p i n u sk o r a i e n s i ss e e d l i n g so fs n p w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 数值为平均数4 - 标准差，n = 3 。v a l u e sa r et h em e a r l 士s e ，n = 3 3 3 讨论 光合作用是地球上重要的生命现象，它是唯一能把太阳能转化为稳定的化学能贮藏 在有机物中的过程，是自然界中最重要的化学反应，是生物界最基本的物质代谢和能量 代谢。净光合速率可直接反映出单位叶面积的物质生产能力，是光合作用特性的重要指 标，也是影响经济产量的和生物产量的重要因素【1 9 0 1 。植物叶片净光合速率的变化反映 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 了植物光合作用能力的强弱，不同植物种类对u v - b 辐射的敏感性不同。蒸腾作用是植 物体内的水分以气态方式从植物的表面向外界散失的过程。蒸腾作用不仅是植物吸收和 运输水分的主要动力，还是植物吸收和运输各种营养物质以及在植物体合成的有机物质 转运的动力【巧o j 。 通常认为，影响植物光合作用的因素可以分为气孔性限制因素和非气孔性限制因 素。f a r q u h a r 等【1 9 1 】认为，气孔限制因素导致的净光合速率下降伴随着蒸腾速率和胞间 c 0 2 浓度的下降；非气孔限制因素导致的净光合速率下降伴随着蒸腾速率和胞间c 0 2 浓 度的上升，即净光合速率的下降是由于叶肉细胞光合活性的下降造成的。从本实验的结 果中可以看出，在o 1m m 浓度s n p 处理下，红松叶片的净光合速率与对照相比明显上 升，而蒸腾速率和胞间c 0 2 浓度均显著增加，同时，气孔导度明显增加，这一结果表 明，0 1m m 浓度s n p 处理下红松光合作用的影响主要是通过气孔性限制因素引起的。 樊洪泓等l l 删用外源n o 供体s n p 处理霍山石斛发现，外源n o 可以提高光合系统 的光能转换效率和潜在活性，增加过剩光能的非光化学耗散，缓解光抑制的发生，增强 抗氧化系统对活性氧的清除能力，有效的保护光合机构免受强光胁迫的伤害。邵瑞鑫等 u 8 2 j 研究发现，经过低浓度s n p 处理可以明显改善小麦叶片的光合性能，从而促进地上 部分干物质的积累，并且增加叶片的水势和渗透势。我们研究结果表明，外源n o 对红 松幼苗光合作用的影响表现出明显的剂量效应，和c k 相比，0 1 和0 5m m 浓度s n p 处理提高了净光合速率，而0 0 1 和lm m 浓度s n p 处理则降低了净光合速率。师守国 等【1 9 3 】研究发现，杏的叶片喷施s n p 在一定浓度范围内其净光合速率随s n p 浓度的升高 而增加，如果浓度超出这个范围，其净光合速率随s n p 浓度的升高而降低，当喷施浓 度为1 0 0l u n o l l 。1 时，其净光合速率最高。这与我们研究结果一致。 叶绿素是参与光合作用光能吸收、传递和转化的重要色素，d o w n i o n 等【1 9 4 j 发现， 菠菜叶绿素含量降低是引起光合速率降低的主要原因。施加外源n o 杏叶片叶绿素的变 化与杏叶片净光合速率的变化基本相同，在一定浓度范围内，随着处理浓度的增加而增 加，这一点在马铃薯材料的试验中己得到证实u 9 5 】。而施加外源n o 处理抑制了番茄叶 肉细胞光合活性下降，维持了番茄较高的光合速率【1 9 6 1 。这与我们的研究结果相反，本 研究发现与对照相比，光合色素含量最大值出现在o 0 1m m 浓度s n p 处理，最小值出 现在o 1m m 浓度s n p 处理。 本研究结果表明不同浓度s n p 处理显著增加了h 2 0 2 和m d a 的含量，其中0 1m m 浓度s n p 处理h 2 0 2 和m d a 的含量最高。同时，不同浓度s n p 处理对抗氧化酶活性影 响不同，c a t 、a p x 、p o d 活性最大值出现在0 0 1 和0 1m m 浓度s n p 处理；不同浓 度s n p 处理显著降低s o d 活性。这说明高浓度外源n o 也可能是一种胁迫因子。可能 因为叶片内n o 的浓度过大、积累过多，导致叶片发生药害，叶片内高浓度n o 会诱发 0 2 和h 2 0 2 大量产生，为清除所产生的自由基，提高了某些抗氧化酶的活性，从而导致 了自由基含量和抗氧化酶活性升高。 蛋白质不仅是组成生物有机体的重要物质，而且作为生物催化反应酶的主要组成部 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 分，在各项生理功能中起到重要的作用。本研究表明所有浓度外源n o 处理都提高了可 溶性蛋白的含量，其中o 0 1m m 增加最多，这和光合色素含量变化趋势一致。有研究表 明，在植物叶片的可溶性蛋白质中，约有5 0 是r u b i s c o ，光合色素含量的提高可能导 致可溶性蛋白含量的增加。可溶性蛋白质含量的升高会导致植物r u b i s c o 活性和光合能 力的提高 1 9 7 j ，进而影响到植物的正常生长。蛋白质的某些变化是植物的一种适应性反 应，它有利于植物抵抗外界的生物和非生物胁迫。 罗建平等【1 9 3 】研究发现n o 能有效地促进怀槐悬浮细胞合成异黄酮，n o 可能通过诱 导植物细胞结构的变化来响应次生代谢产物的合成。我们研究结果与前人研究结果一 致，这说明添加适当浓度外源n o 可有效的促进类黄酮的含量的积累，有助于红松幼苗 提高抗氧化水平，缓解胁迫压力。 在植物中，n o 功能具有二元性【1 8 3 】，在低浓度下，它有保护作用；而高浓度n o 则 会严重伤害细胞。植物在受到各种生物或非生物胁迫，如水分和盐胁迫、机械损伤以及 紫外线等都可以产生氧化爆剔1 8 9 , 1 9 6 ，而氧化爆发诱导形成的r o s 是植物细胞凋亡的启 动信号之一，然而r o s 不足以诱导植物产生足够强的抗病力，必须和n o 协同作用才 能达到这一结果【1 9 9 。n o 作为信号分子，通过调节抗氧化能力来缓解各种胁迫造成的氧 化损伤，从而增强植物对各种逆境胁迫的抗性 2 0 0 。如高温胁迫下，外源n o 可以促进 梨的抗氧化酶活性提高，缓解高温对梨叶片的伤害【2 0 1 】；0 1m ms n p 处理对高温强光胁 一一迫下灌浆期小麦具有明显的保护作用包括降低叶片m d a 含量和细胞膜透性，提高 s o d 、c a t 和p o d3 种保护酶活性【l 洲。一方面，低浓度n o 可以通过各种方式与r o s 作用，发挥抗氧化功能。在短时间的热胁迫下可以检测到豌豆叶片中n o 产生的增加 【1 9 3 】，n o 也能增强番茄、小麦和玉米的抗寒性 2 0 2 。另一方面，n o 供体s n p 可增加叶 绿素荧光u 盯1 ；高浓度n o 处理豌豆叶片可以诱发胁迫症状，用浓度相当于1m mn o 的 s n p 处理豌豆叶片可以看到l o x 活性显著降低【1 8 7 】。这些都表明，高浓度n o 也可以是 胁迫诱导因子1 2 0 3 i 。 环境信号刺激植物体内n o 爆发后，启动了一系列生化反应，使植物体内代谢失衡 而处于一种混沌和耗散结构的状态，造就了植物体新的生态平衡。重复多次的n o 爆发 并不能使机体产生同样的反应，这是因为受胁迫细胞刺激应答系统的反应滞后所致。环 境因子对于植物细胞频繁的刺激，致使应答系统产生疲劳【6 】。 3 4 本章小结 ( 1 ) 不同浓度s n p 处理对红松幼苗的净光合速率产生了明显的作用。和c k 相比， o 1 和0 5m m 浓度s n p 处理提高了净光合速率，而0 0 l 和1m m 浓度s n p 处理 则降低了净光合速率，整体表现为o 1m m 0 5m m c k 1m m 0 0 1m m 。 ( 2 ) 最大净光合速率和饱和光强随着s n p 处理浓度的加强而增加，只有o 0 1m m 浓 度s n p 处理低于c k ，其余处理都增强了最大净光合速率和饱和光强。光补偿点 3 外源n o 调控红松幼苗生长与生理特性的浓度效应 和暗呼吸速率最小值则出现在0 1m m 浓度s n p 处理。其余浓度s n p 处理则增 加了光补偿点和暗呼吸速率的值。 与对照相比，不同浓度s n p 处理均显著提高了胞间c 0 2 浓度和蒸腾速率的值。 净光合速率、蒸腾速率最大值出现在0 1m m 浓度s n p 处理，气孔导度、胞间 c 0 2 浓度最大值出现在0 0 1m m 浓度s n p 处理。净光合速率最小值出现在o 0 l m m 浓度s n p 处理，与光合曲线变化趋势一致。 叶绿素a 、叶绿素b 、类胡萝卜素、总叶绿素含量最大值出现在0 0 1m m 浓度 s n p 处理，最小值出现在o 1m m 浓度s n p 处理。不同浓度s n p 处理红松幼苗7 d 后光合色素含量表现为0 0 1m m 1m m c k 0 5m m 0 1m m 。 不同浓度s n p 处理都显著提高了h 2 0 2 和m d a 的含量，1 - 1 2 0 2 和m d a 的含量的 最大值均出现在0 1m m 浓度s n p 处理。 不同浓度s n p 处理都显著提高了可溶性蛋白的含量。其中，0 0 1m m 浓度s n p 处理可溶性蛋白的含量最高。 不同浓度s n p 处理都显著提高了类黄酮的含量( o 5m m 浓度s n p 处理除外) ， 其中，o 0 1m m 浓度s n p 处理类黄酮的含量最高。 不同浓度s n p 处理对抗氧化酶活性影响不同。低浓度s n p 处理不成程度的提高 了c a t 、a p x 和p o d 的活性，而高浓度s n p 处理则显著抑制了c a r 、a p x 和 p o d 的活性；不同浓度s n p 处理都显著降低了s o d 酶活性。 ) ) ) ) ) ) 3 4 5 6 7 8 ( ( ( ( ( ( 4 外源n o 对u v - b 胁迫下红松幼苗生理特性的影响 4 外源n o 对u v - b 胁迫下红松幼苗生理特性的影响 过量的u v - b 辐射会使植物叶表现出褐斑、黄化、卷曲甚至死亡。t e v 越等 2 0 4 的研 究表明：u v - b 伤害作用是通过诱导自由基产生，从而加剧膜脂质过氧化，使脂肪酸配 比发生改变。作为比可见光具有更高能量的u v - b ，作用于叶绿体时可能会产生更多的 r o s ，而大量r o s 的产生，使自由基清除系统失去平衡，从而导致膜脂质过氧化和 m d a 的积累增加，进而导致膜系统破坏，脂肪酸比例失调，膜流动性下降，光合色素 降解，希尔反应活力降低【2 0 5 】。我们前期研究表明，在u v - b 作用下，红松幼苗针叶光 合能力的下降，h 2 0 2 、m d a 含量增多，说明u v - b 辐射使红松幼苗产生大量的活性氧 自由基，发生了脂质过氧化，导致更多的u v - b 渗透人植物叶中，或者使植物体内清除 自由基的能力减弱。 n o 作为一种化学性质活跃的生物自由基，在植物生长发育及抗逆性等多种生命活 动中充当第二信使【2 0 5 】。来源于n o s 系统的n o 是u v 辐射下产生的与生长发育有关的 信号分子，u v 诱导的生长抑制是通过影响细胞壁降解酶活性，改变细胞壁化学特性和 机械延展性实现的，而n o 作为u v 辐射的第二信使介导了这一过程【2 0 6 。n o 作为u v - b 辐射的第二信使，已成为当前植物逆境生理和信号转导领域的研究热点【5 】。 b e l i g n i t l 8 8 】认为植物n o 具有双重生理效应，其中高浓度n o 具有生理毒性，而低 “溅n o 侧有保护作用，并与细胞的微环境和n o 的实际浓度有关。有研究发现，外源 n o 可以减少胁迫条件下活性氧的积累，从而缓解干旱、低温和病菌对植株造成的伤害 【2 0 1 ，2 0 7 1 ，段凯旋等【2 0 8 1 研究发现，适当浓度的外源n o 可通过提高抗氧化酶活性，降低 铜、镉胁迫下平邑甜茶根系和叶片的0 2 。产生速率及m d a 含量，从而保护幼苗。作为 信号分子，n o 对植物抗逆性的作用越来越受重视。 适当浓度的n o 可缓解逆境条件下植物受到的氧化伤害。但目前的研究多集中在 n o 对盐胁迫和干旱胁迫的作用；同时，关于外源n o 提高植物抗逆性的报道主要集中 于草本植物，涉及木本植物的研究较少。相昆和付士磊 5 , 2 0 9 分别研究了外源n o 对干旱 胁迫下核桃幼苗和杨树幼苗生理特性的影响：很少涉及n o 对u v - b 胁迫下生理作用的 影响。该试验以3 年生红松幼苗为材料，研究了外源n o 对u v - b 胁迫下红松幼苗的影 响，为了解n o 提高植物抗逆性的作用提供理论依据。 4 1 材料与方法 4 1 1 试验材料与试验设计 试验在东北林业大学森林植物生态学重点实验室温室内进行。试验材料为3 年龄红 松幼苗，于帽儿山林场苗圃区移取，并采用盆栽的方式在东北林业大学森林植物生态学 教育部重点实验室的温室内进行日常管理和培育。供试土壤的基本理化性状为：p h 值 5 6 、有机质2 5 、速效氮2 0 0m g k g 、速效磷9 0m g k g 、速效钾2 0 0m g k 百1 。将幼 4 外源n o 对u v - b 胁迫下红松幼苗生理特性的影响 苗随机分为4 组，每组6 0 株。 试验设置4 个处理：( 1 ) c k ：( 2 ) s n p ( 0 0 1r a m ) ；( 3 ) u v - b ( 4 2 2k j m - 2 - d - 1 ) ：( 4 ) s n p ( 0 0 1m l v l ) + u v - b ( 4 2 2k j n 1 2 d 1 ) 。 c k 为温室内自然条件处理，u v - b 处理组为在温室内自然光照基础上，人工增加 4 2 2k jn 1 2d 。1 辐射强度的u v - b 处理。u v - b ( 2 8 0 - 3 2 0r i m ) 辐射处理通过悬在植株上方 的u v - b 辐射灯管产生，发射的紫外线用o 0 8m m 醋酸纤维膜过滤，以消除u v - c 的影 响，并每两周进行更换滤膜。u v - b 辐射处理时间为每天1 2h ( 6 ：0 0 - 1 8 ：0 0 ) 。u v - b 辐射 强度通过光谱仪a v a s p e c2 0 4 8 2 进行测定。并用c a l d w e l l i n 2 1 的方法标定到3 0 0n m 的广 泛植物作用谱进行加权处理获得生物有效辐射( u v - b b e ) 。用g r e e n 等【1 1 3 】的模型算得补 增u v - b 辐射的强度。处理期间通过调整灯管与植株冠层的高度以保证植株接受稳定剂 量的u v - b 辐射强度。 外源n o 供体采用硝普钠( s n p ，购自上海国药集团公司) ，先用蒸馏水配制lm m 的母液，4 “ c 保存，用时按试验所需的浓度进行稀释。s n p 处理组用0 0 1m ms n p 溶液 1 0 0m l 均匀喷施于叶面，c k 和u v - b 处理组喷施清水。处理l 、3 、5 、7 、9d 后测定 各项生理指标，每个处理均随机取样。 4 1 2 试验方法 4 1 2 1a - p a r 响应曲线的测定方法 见2 1 ：2 1 。 一 4 1 2 2 光合色素含量测定方法 见2 1 2 5 。 4 1 2 3 过氧化氢( h 2 0 2 ) 自由基含量测定方法 见2 1 2 3 。 4 1 2 4m d a 含量测定方法 见2 1 2 4 。 4 1 2 5n o 含量测定方法 采用试剂盒法。参考c o r p a s 等口1 0 1 的方法，取1g 针叶在0 - 4 。c 放入4 0m mh e p e s p h7 2 缓冲液3m l 研磨，2m l 冲洗，用2 层纱布过滤后，在2 70 0 0xg4 “ c 离心2 0 m i n ，取上清液参考试剂盒说明书进行测定( 试剂盒购自南京建成生物工程研究所) ： o 1i n l 上清液加o 2m l 反应液3 7 “ c 反应6 0m i n ，再加入反应液旋涡混匀3 0s ，室温静 置1 0m i n 后7