MINISTR复合扩增体系的研制与开发.pdf

中文摘要 m i n i s t r 复合扩增体系的研制与开发 摘要 目的：在法医d n a 检验中，s t r 技术已经广泛用于个人识别和亲权 鉴定方面。但是法医检案工作中，常常由于高温、潮湿、暴晒、微生物等 因素的影响，使检材中的d n a 分子被损坏，发生断裂，分子变小，大片 段丢失。在这些情况下应用s t r 技术不能成功地得出结论，经常会出现 “优势扩增”或者“无效扩增”，这就给正确的d n a 分型带来困难。重 新设计引物，减小扩增产物片段长度是目前解决d n a 高度降解检材检验 问题的一种新的方法。2 0 0 1 年9 1 1 恐怖事件时这种方法被应用于遇难者 的尸源认定，同时被正式命名为m i n i s t r 技术。目前，a b 公司已经开发 出针对c o d i s 系统以内8 个基因座的m i n i s t r 商品化试剂盒。但由于 c o d i s 系统内一些基因座侧翼序列不适合设计新的引物，或者等位基因 范围太大，使这些基因座的扩增片段长度难以缩短到理想长度( 0 7 ) 的基因座作为候选基因座。根据我们在河北汉族人群中调 研究论文 查的群体遗传学数据，除d 4 s 2 3 6 4 、d 3 s 3 0 5 3 、d 6 s 4 7 4 、d 2 0 s 4 8 2 、d 1 s 1 6 2 7 、 d 5 s 2 5 0 0 、d 1 8 s 8 5 3 、d 1 7 s 1 3 0 1 和d 1 7 s 9 7 4 基因座之外，其余1 4 个基因 座的多态信息含量均大于o 7 ，具有较高的遗传多态性，但d 3 s 4 5 2 9 、 d 6 s 1 0 1 7 和d 2 0 s 1 0 8 2 三个基因座的等位基因分布比较集中，故也未被选 为候选基因。 5 选择扩增条件相似、扩增效率高的基因座。复合扩增各个基因座之间 的扩增效率的平衡是通过调节引物的浓度来达到一致的。所以尽量选择扩 增效率高的基因座，在调节平衡的时候引物浓度的变动范围就比较宽松， 为扩增效率相对较低的基因座引物浓度调节提供空间。通过本部分实验发 现d 1 g a t a l1 3 、d 4 s 2 4 0 8 和d 11 s 4 4 6 3 三个基因座虽然多态信息含量较 高，但扩增效率较低，对t a qd n a 聚合酶的质量要求较高，不易与其他 基因座进行复合扩增，因此舍去。 6 引物兼容是指各个基因座的引物不相互作用。因为基因座的引物间的 特殊序列发生相互作用时会产生非特异性条带或额外带，使产物量下降， 甚至是无扩增产物。由于多对引物同时存在于同一个反应体系，导致复合 扩增失败的原因主要有三类： 1 ) p c r 选择：由于靶序列、靶序列侧翼或整个基因组的特性所造成某些 模板总是易于被扩增的机制称之为p c r 选择【1 5 】。 2 ) p c r 漂移：p c r 漂移被认为是由于p c r 组分间随机波动的相互作用 造成的，结果是非常低浓度的模板其拷贝数升高 1 6 - 1 7 】，试剂操作的随 机变化和热循环仪的变温速率的变化也可造成p c r 组分相互作用的 变化。 3 ) 引物二聚体：引物二聚体是指引物间相互作用形成的引物聚合体【掩1 。 引物二聚体形成的主要原因是引物序列的互补。在没有任何碱基互补 的时候，如果引物浓度高或者在冷启动或者循环次数太多的情况下， 引物之间也可相互作用形成引物二聚体【1 9 1 ，所以引物的设计和选择对 于避免引物二聚体的形成很重要【2 0 1 ，同时扩增条件的优化也有助于减 少引物二聚体的形成。 本部分实验参考文献所设计的引物，在最终所筛选出的8 个m i m i s t r 基因座引物间未出现引物二聚体和p c r 漂移等现象，因此未重新设计引 物，直接引用文献报道的引物进行扩增。 研究论文 根据在河北汉族人群中的初筛结果，2 6 个基因座中除d 1 4 s 1 4 3 4 、 d 8 s 1 1 1 5 和d 2 2 s 1 0 4 5 三个基因座经反复摸条件扩增后仍出现非特异性条 带多、主带不明显、无法判型等问题，舍去未作群体遗传学调查外，按照 以上复合扩增优选基因座的原则，在其余2 3 个基因座中筛选出了 d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 2 1 5 7 ，d 9 s 11 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 和d 2 s 1 7 7 68 个基因频率分布好，扩增片段短、杂合度高，包含信息量大 的m i n i s t r 基因座。 这8 个基因座在中国其他地区汉族人群中的调查结果表明，它们的等 位基因频率分布均符合h a r d y w e i n b e r g 平衡定律，且具有较高的多态信 息含量( 0 5 9 0 0 8 1 0 ) 和个人识别率( o 8 1 4 0 9 2 8 ) 。可以作为下一步实 验的候选基因座。 上述优选出的基因座，更加适合于中国汉族人群的群体遗传学特征。 在第二部分实验中，将以此为依据构建m i n i s t r 复合扩增体系。 小结 本部分实验从文献推荐的2 6 个m i n i s t r 基因座中，经过大量的群体遗 传学调查实验，优选出了适合中国汉族人群群体遗传学特征的8 个片段长 度较短、多态性好的m i n i s t r 基因座。在第二部分实验中我们将突破文献 推荐的组合模式，应用五色荧光标记显示系统构建这8 个m i n i s t r 基因座 复合扩增体系。并在第三部分实验中以各基因座所筛选出的等位基因为 基础，构建等位基因标准分型物。 研究论文 参考文献 1 h o l tc l ，b u o n c r i s t i a n im ，w a l l i nj m ， a m p f s t r t mp c ra m p l i f i c a t i o nk i t s f o r e n s i cs c ii n t ，2 0 0 2 ，4 7 ：6 6 - 9 6 e t a lt w g d a mv a l i d a t i o no f f o rf o r e n s i cd n ac a s e w o r k j 2b a rw ：k r a t z e ra ，m a c h l e rm ，e t a lp o s t m o r t e ms t a b i l i t yo fd n a f o r e n s i c s c ii n t ，1 9 8 8 ，3 9 ：5 9 - - 7 0 3w h i t a k e rj p , c l a y t o nt m ，u r q u h a r ta j ，e t a ls h o r r tt a n d e mr e p e a tt y p i n go f b o d i e sf r o mam a s sd i s a s t e rh i g hs u c c e s sr a t ea n dc h a r a c t e r i s t i c a m p l i f i c a t i o np a r e m si n h i g h l yd e g r a d e ds a m p l e s b i o t e c h n i q u e s ，1 9 9 5 ， 1 8 ：6 7 0 - 6 7 7 4 c o t t o ne a ，a l l s o pr f , g u e s t 几，e t a lv a l i d a t i o no ft h ea m p f s t rs g m p l u s t ms y s t e mf o r u s ei nf o r e n s i cc a s ew o r k f o r e n s i cs c ii n t ，2 0 0 0 ， 1 1 2 ：1 5 1 1 6 1 5k r e n k eb e t e r e b aa ，a n d e r s o ns j ，e t a lv a l i d a t i o no fa16 - l o c u s f l u o r e s c e n tm u l t i p l e xs y s t e m jf o r e n s i cs c i ，2 0 0 2 ，4 7 ：7 7 3 - 7 8 5 6b u t l e rj m ，s h e nym c c o r db r ，e t a lt h ed e v e l o p m e n to fr e d u c e ds i z e s t ra m p l i c o n sa st o o l sf o ra n a n l y s i so fd e g r a d e dd n a jf o r e n s i cs c i ， 2 0 0 3 ，4 8 ：1 0 5 4 - 1 0 6 4 7 h t t p ：w w w c s t l n i s tg o v b i o t e c h s t r b a s e m i n i s t r t i m e l i n e h t m 8h i l lc r c o b l e d ，b u t l e rj mc h a r a c t e r i z a t i o no f2 6n e wm i n i s t rl o c i f o r e n s i cs c ii n t ，2 0 0 6 ，1 0 ：1 0 - 1 2 9 娄春光，李淑瑾，丛斌，等3 + m i n i s t r 基因座在高度降解检材中的 应用及其遗传多态性。中国法医学杂志，2 0 0 6 ，2 1 ：8 1 - 2 8 3 1 0 郑秀芬法医d n a 分析。中国人民公安大学出版社，2 0 0 2 1 1a l l e nc r g r a v e sgb u d o w l ebp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na m p l i f i c a - t i o n p r o d u c t ss e p a r a t e do nr e h y d r a t a b l ep o l y a c r y l a m i d eg e l sa n ds t a i n e dw i t h s i l v e r b i o t e c h n i q u e s ，19 9 0 ，7 ：7 36 - 7 4 4 12p o w e r s t a t s ac o m p u t e rp r o g r a mf o rt h ea n a l y s i so fp o p u l a t i o ns t a t i s t i c s ， f r e e p r o g r a m d i s t r i b u t e d b yt h e a u t h o r so v e rt h ei n t e m e tf r o m h t t p ：w w w p r o m e g a c o m g e n e t i c i dt o o l s ，19 9 9 3 6 研究论文 13 r a y m o n dm ，r o u s s e tfg e n e p o p ( v e r s i o n1 2 ) ，p o p u l a t i o ng e n e t i c s s o f t w a r ef o re x a c tt e s t sa n de c u m e n i c i s m jh e r e d ，19 9 5 ，8 6 ：2 4 8 - 2 8 3 1 4 侯一平，王保捷，杨庆恩法医物证学第二版。人民卫生出版社，1 9 9 8 15w a g n e ra ，b l a c k s t o n en ，c a r t w r i g h tp ，e t a ls u r v e y so fg e n ef a m i l i e su s i n g p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ：p c rs e l e c t i o na n dp c rd r i f t s y s tb i o l ，19 9 4 ， 4 3 ：2 5 0 - 2 6 1 16d i e f f e n b a c hc w jl o w et m j ，d v e k s l e rg sg e n e r a lc o n c e p t sf o rp c r p r i m e rd e s i g n p c rm e t h o d sa p p l ，19 9 3 ，3 ：5 3 0 - 5 3 7 17m u t t e rg l ，b o y n t o nk ap c rb i a si na m p l i f i c a t i o no fa n d r o g e nr e c e p t o r a l l e l e s ，at r i n u c l e o t i d er e p e a tm a r k e ru s e di nc l o n a l i t ys t u d i e s n u c l e i c a c i d sr e s ，1 9 9 5 ，2 3 ：1 4 11 - 1 4 1 8 18b r o w n i e3 ，s h a w c r o s ss ，t h e a k e rj ，e t a lt h ee l i m i n a t i o no fp r i m e r - d i m e r a c c u m u l a t i o ni np c r n u c l e i ca c i d sr e s ，19 9 7 ，2 5 ：3 2 3 5 - 3 2 41 19f e r r i et l m ，s e h w a r zm j ，r o b e r t s o nn h ，e t a ld e v e l o p m e n tm u l t i p l e x - i n g a n da p p l i c a t i o no fa r m st e s t sf o rc o m m o nm u t a t i o n si nt h ec f t r g e n e a mjh u m g e n e t ，1 9 9 2 ，5 1 ：2 5 1 - 2 6 2 2 0s u z u k im 乃g i o v a n n v n is jb i a sc a u s e db yt e m p l a t ea n n e a l i n gi nt h e a m p l i f i c a t i o no fm i x t u r e so f16 5r r n ag e n e sb yp c r a p pm i c r o b i o l ， 19 9 6 ，6 2 ：6 2 5 - 6 3 0 3 7 研究论文 第二部分 荧光标记m i n i s t r 复合扩增体系的构建 上_ - j 刖吾 荧光标记m i n i s t r 复合扩增体系的建立是本实验的难点之一。s t r 复合扩增( m u t i p l e xp c r ) 技术白1 9 8 8 年c h a m b e c r i n a 等【1 。3 】首次提出 这一概念起，已被广泛应用于基因组结构与功能及数量性状基因座的定位 等研究。复合扩增技术具有高效、经济简便等特点。在法医学领域，要求 在尽量短的时间内对多个遗传标志做出分析结果，而且法医的生物学检材 常常是微量和不可再现的，复合扩增技术的应用凸显其无法代替的重要 性。但该技术需要解决多色荧光带来的荧光间相互干扰的问题，因复合扩 增的基因座数目多而如何控制各基因座间的平衡性问题，以及确定循环参 数和扩增条件等诸多问题。 荧光标记m i n i s t r 基因座复合扩增体系建立的技术难点在于：由于 竞争的影响，随着复合基因座数目的增加，各基因座的相对平衡控制的难 度亦加大，而且我们所选的8 个基因座片段长度都集中在8 0 1 6 0 b p 之间， 如何在有限长度范围内组合多个片段相近的m i n i s t r 基因座而又要排除 交叉重叠，具有较大的难度。此外，复合扩增的缓冲体系和扩增参数也与 常规p c r 有较大的区别。不同染料荧光间的互相干扰，也易造成分型的 困难。 针对这些技术的难点，本部分实验先后进行了荧光的筛选，基因座组 合方式、复合扩增体系的调配、缓冲条件和循环参数等内容的研究。通过 大量反复的实验研究，不断调整体系组分浓度，改进缓冲体系和扩增参数， 最终建立了稳定可靠的m i n i s t r 复合扩增体系。 1 材料 1 1 实验样本 材料与方法 研究论文 d n a 样本：应用第一部分实验提取的d n a 样本。 1 2 仪器 8 0 m d f 3 8 2 e 型超低温冰箱日本s a n y o 公司 微量移液器法国g i l s o n 公司 t g l 1 6 g 台式高速离心机上海医用分析仪器厂 3 k1 8 型低温超速离心机 美国s i g m a 公司 t d a 8 0 0 2 型电热恒温水浴箱天津市泰斯特仪器有限公司 i v i e s 3 0 2 0 型高压消毒锅日本s a n y o 公司 x w - 8 0 a 旋涡混合器上海医科大学仪器厂 7 9 1 磁力加热搅拌器上海浦东物理光学仪厂 d w i i i 水平电泳槽北京六一仪器厂 u v 型紫外分析仪珠海黑马医学仪器有限公司 黑马凝胶成像系统珠海黑马医学仪器有限公司 核酸定量仪n d l 0 0美国g e n e 有限公司 m i l l i qs y n t h e s i s 超纯水仪 美国m i l i p o r e 公司 p t c 2 0 0p c r 扩增仪美国m j 公司 a b i9 7 0 0p c r 扩增仪美国a b 公司 a b ip r i s m3 1 0 基因分析仪美国a b 公司 a b i31 3 0 基因分析仪美国a b 公司 g e n e m a p p e r3 2 软件 美国a b 公司 1 3 主要试剂及配制 1 3 1 试剂 c h e l e x 1 0 0 蛋白酶k 9 9 4 7 ad n a 引物 d n t p 1o p c r 反应缓冲液 m g c l z t a q d n a 聚合酶 美国s i g m a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国a b 公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 研究论文 去离子甲酰胺 g s 5 0 0 l i z 电极缓冲液 p o p 4 液体胶 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 2 方法 2 1p c r 扩增 2 1 1 荧光染料的筛选与组合 荧光标记试剂是否稳定，组合是否恰当，是否与检测设备相匹配，是 影响d n a 检测质量的重要因素。选择荧光组合时，我们还应考虑荧光的 吸收激发波长不能互相重叠，荧光信号强度等。多色显示体系中，当一种 颜色的荧光只标记一个m i n i s t r 进行四个m i n i s t r 基因座的复合扩增时， m i n i s t r 基因座的组合不受片段长度限制；当种颜色的荧光标记一个以 上m i n i s t r 基因座进行扩增时，同一颜色荧光标记的m i n i s t r 基因座长 度必须错开。本实验中研究的m i n i s t r 基因座的扩增片段大小相似，分 型区相互重叠，因此每个基因座必须标记不同颜色的荧光，但目前生物技 术公司只能标记五种颜色的荧光，要想达到区分开所有基因座的目的，须 将这些m i n i s t r 基因座分组复合扩增才能达到准确分型的目的。 目前国内d n a 检验实验室重要应用的检测设备是a b ip r i s m3 1 0 和 a b i31 0 0 遗传分析仪。两者配套的荧光标记物有f a m 、j o e 、t a m a r a 、 h e x 、n e d 、r o x 、v i c 、l i z 等，依据荧光染料光谱特性、检测灵敏度 等，本实验对荧光染料进行了筛选。 2 1 2 基因座的选择与组合 2 1 2 1m i n i s t r 基因座的选择： 根据筛选m i n i s t r 基因座的原则，在第一部分实验中已经优选出了 符合中国汉族人群特征的d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 2 1 5 7 ， d 9 s 1 1 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 和d 2 s 1 7 7 68 个m i n i s t r 基因座。 2 1 2 2 基因座组合方式的调整： 各基因座的等位基因组成及范围、扩增片段长度、组合是否出现基因 座间重叠等。由于我们所选择的8 个基因座片段长度基本相近( 8 0 1 6 0 b p ) ， 在进行基因座组合时基因座间不可避免的会出现重叠，这种情况下我们只 研究论文 能通过不同颜色的荧光来进行不同基因座的区分。为了能用有限的荧光颜 色将a m e l o g e n i n ( 1 0 6 b p ，11 2 b p ) 与其它基因座进行区分，我们将其与 d 2 s 1 7 7 6 ( 1 3 5 1 5 9 b p ) 用同一种颜色进行标记。 2 1 3 引物合成 根据文献【5 】，由上海生工生物技术有限公司合成，荧光标记全部采用 5 末端标记。 2 1 4 单个基因座的扩增条件的建立 2 1 4 1p c r 反应体系 2 1 5 复合扩增体系的建立和优化 2 1 5 1 各基因座引物浓度的调整 引物组分的调整原则是增加产物量少的基因座的引物，或者减少产物 量多的基因座的引物，通过多次的反复实验，不断调节引物浓度与配比， 最后实现整个复合扩增体系全部基因座的同时扩增并且基因座间达到基 本平衡。 研究论文 2 1 5 2 复合扩增条件的建立 首先对各基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因 座扩增条件的基础上，研究9 个基因座复合扩增p c r 反应条件，通过大 量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如循环参数、退火温度、 m 9 2 + 浓度等，使扩增产物基本达到平衡、特异的要求，同时扩增出整个复 合扩增体系的全部基因座，建立起多个基因座的复合扩增体系。 2 2p c r 扩增产物检测 2 2 1 用a b ip r i s m31 0 和a b i3 1 3 0 遗传分析仪检测扩增片段。荧光标记 毛细管电泳荧光自动分析仪的参数设置和操作步骤： 2 2 1 1 开机 1 ) 打开3 1 0 主机，系统白检，绿灯长亮c o l l e c t i o n 软件 2 ) 在w i n d o w s 菜单下选择s t a t u s 观察第三栏在i n s t r u m e n t 菜单下，选择 m a n u a lc o n t r o l ，介调至6 0 o ，e x c u t e 执行，关闭该对话框 2 4 1 2 安装毛细管，灌胶 1 ) 从4 冰箱取出p o p 4 胶，室温回温3 0 。c ，吸取少量p o p 4 ，将注射器 来回抽动几下后将胶排净 2 ) 吸取p o p 4 适量( o 5 m 1 ) ，用d d h ：2 0 洗p u l m pb l o c k 右侧上紧，将胶 放回4 “ c 冰箱 3 ) 装好毛细管 4 ) 进入m a n u a lc o n t r o l 菜单，关闭缓冲阀门，开废液阀门，手指压注射 器排净管道中气泡，( c l o s e ) 5 ) 进入m a n u a lc o n t r o l 菜单，打开缓冲阀f - j r 4 方法排净管道中气泡，然 后关闭缓冲阀门 6 ) 松开c a p i l l a r yf i t t i n g ，排净毛细管一侧的气泡，关紧f i t t i n g ，注意毛细 管顶端位于管路十字架的右边缘，与电极平齐 7 ) 用无水乙醇清洗毛细管激光检测窗口后将毛细管固定于检测窗1 2 1 h o l d e r 处，毛细管窗口应与机器检测窗口位置吻( 此点可用毛细管上 的m a r k e ：位于检测窗边缘来证实) 8 ) 毛细管另一端插入电极端，使尖端比电极略低越o 5 m m ，同时用手指 轻轻左右调节毛细管，使之尖端贴近电极尖( 间隔约2 r a m ) ，调好后 用胶带固定，合上控温板门 研究论文 9 ) 在i n s t r u m e n t 菜单下执行a u t o s a m p l ec a l i b r a t i o n 命令，出现 a u t o s a m p l e rc a l i b r a t i o n 窗口，根据右下角的提示进行操作 1 0 ) 打开m a n u a lc o n t r o l ，执行s y r i n g eh o m e ，然后选择s y r i n g ed o w n ，输 入合适的值并执行，使曲柄几乎与注射器的活塞顶部接触具体方法： 可先输入较大的值，如1 0 0 ，然后待靠近后，将值减少，如5 0 ，2 0 ， 5 2 2 1 3m a t r i x 文件的制作 荧光标记的p c r 产物在a b ip r i s m31 0 遗传分析仪上分析时，由于 五色荧光染料在同一激发波长下其发射波长相互之间有干扰，在附近的色 道出现一个干扰峰( p u l l u pp e a k ) ，要使用一个m a t r i x 文件，可以在分析 中校正光谱的迭加，抵消不同荧光染料相互之间的荧光吸收干扰。应用新 的荧光标记复合扩增体系都要创建一个新的m a t r i x 文件，进行光谱校正， 按照a b 公司的操作说明即可【6 】。 2 2 1 4 样品准备 l 、) 将1 0 b u f f e r 稀释到l b u f f e r ( 需约1 5 m 1 ) 2 ) 将1 b u f f e r 加入到b u f f e rr e s e r v i o r 及1 号b u f f e rv i a l 注意将液面达 到m a r k e r 3 ) 2 号位为装有约4 m l 去离子水的b u f f e rv i a l ，3 号位为注入d d h 2 0 的去 盖1 5 m le p p e n d o r f 管 4 、) 按去离子甲酰胺：g s 5 0 0 l i z 分子量标准物= 6 5 ：1 混合，离心，取混合 液1 3 p l 混合液加入0 2 1 a l 扩增产物，混匀，离心。转入专用o 5 m l 样 品管 5 ) 于m a n u a lc o n t r o l 中，执行a u t o s a m p l e rh o m ex ，ya x i s 和a u t o s a m p l e r h o m eza x i s 命令 6 ) 按p u m pb l o c k 左边的t r a y 键，待自动样品盘伸出后将上述样品及试 剂放置到相应位置，按t r a y 退回，关好前门 2 2 1 5 数据收集 1 1 ) 于打开的收集软件之f i l e 菜单中选中n e w 2 ) 于跳出的菜单中选s e q s a m p l es h e e t 4 8t u b eo r9 6t u b e ，不同选择依 t r a y 的不同而定 3 ) 以样品的实际位置为准输入相应的样品名并选择相应的m o b i l i t yf i l e 研究论文 和i n s t r u m e n tf i l e ( m a t r i xf i l e ) 4 ) 存盘，关掉s a m p l es h e e t 5 ) 同上所述再次选n e w ，单中选s e q i n jl i s t 6 ) s e q i n j l i s t 表中，可见s a m p l es h e e t 下拉菜单，选中刚才编好的s a m p l e s h e e t ( 有时间及日期显示名) 7 ) 在第一个样品前须做一个t e s tc c d 4 c o l o r 程序。具体方法是，用鼠标 选中i n j # 项的n o 1 ，于e d i t 下拉菜单中，选中i n s e r t 有一个空行插入 于表的n o 1 处。任选一个t u b e & s a m p l en a m e 后，于m o d u l e 下拉菜 单处，选t e s tc c d 4 c o l o r ，不选择自动分析即完成。正常情况下4 条 信号线应在2 0 4 8 ( y 轴值) 以下，如高于此值则需暂停机器并将毛细 管窗口擦净后再继续运行 8 ) 编好l i s t ，注意m o d u l e 的选择 9 ) 选择r u n 运行此编好i n j l i s t 2 4 1 6 数据分析 1 、) 双击g e n e s c a n 的快捷图标，打开g e n e s c a n 软件 2 ) 在f i l e 下拉菜单中选n e w ，再选p r o j e c t ，建立一个新的空白p r o j e c t 3 ) 导入实验数据：在p r o j e c t 下拉菜单中选a d ds a m p l ef i l e s ，然后依据样 品文件所在路径找到并导入样品文件，点击a n a l y s i s ，软件自动完成 计算 2 2 1 7 关机 1 、) 运行样品盘x y - z 轴回归位 2 ) 退出程序，关闭电脑 3 、) 关闭主机开关 4 ) 落下毛细管，使其末端浸入去离子水 结果 1 复合扩增体系基因座基本特征及荧光组合设计 1 1 复合扩增体系基因座基本特征 本体系共包括d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 2 1 5 7 ，d 9 s 1 1 2 2 ， d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 2 s 1 7 7 68 个常染色体m i n i s t r 基因座及一个性 研究论文 别基因座a m e l o g e n i n 。各基因座的基本信息及组合方式见t a b l e 2 1 ，引 物序列见t a b l e 2 2 。 1 2 荧光组合设计 为了达到试剂国产化的目的，根据国内所能标记荧光染料的颜色，及 比较各种荧光标记染料的特性后，我们选择了羧基荧光素( f a m ) 作为 蓝色荧光标记染料，四甲基6 羧基罗丹明( t a 眦) 作为黄色荧光标记 染料，六氯荧光素( 玎三x ) 作为绿色荧光标记染料和若丹明( r o x ) 作 为红色荧光标记染料，内标选用l i z ，构建了五色荧光组合方案，上述四 种荧光染料的光谱学特性见t a b l e 2 3 。 2 复合扩增反应体系与条件的建立和优化 一套成功的复合扩增体系受许多因素的制约，其中主要包括引物浓 度、退火温度、缓冲条件、循环参数和基因座之间平衡度的调配等实验研 究。 2 1 复合扩增体系中引物的优化 p c r 扩增产物的长度、特异性是由特异引物限定的。因此，引物的 设计与合成是保证p c r 成功的关键因素之一。本实验所选取基因座的引 物均来自文献报划5 1 ，经第一部分实验的检测在扩增过程中未发现等位 基因丢失等现象，因此我们未重新设计引物，直接引用文献推荐的引物。 本部分实验所选取的d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 2 1 5 7 ，d 9 s 1 1 2 2 ， d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 2 s 1 7 7 6 和a m e l o g e n i n9 个基因座，我们遵循了 不同基因座引物之间特别是3 端不出现互补序列的原则进行了复合扩 增，复合扩增体系一中包含的d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 和d 9 s 2 1 5 7 四个基因座的引物浓度分别为0 3 p m 、0 2 9 m 、0 3 9 m 和o 5 9 m ；复合扩 增体系二中d 9 s 1 1 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 2 s 1 7 7 6 和a m e l o g e n i n 五 个基因座的引物浓度分别为0 3 p m 、o 7 p m 、o 7 9 m 、o 5 9 m 和0 2 1 t m 。 各基因座峰形对称尖锐，无双尖峰出现，峰之间基本平衡。结果见f i g 2 1 。 2 2 退火温度的选择 p c r 反应中各基因座的扩增效率与退火温度有直接的关联，为此我 们将退火温度设定从5 3 、5 5 、5 7 和5 9 等范围内观察最适退火温 度。实验表明，在5 3 产生了较多的非特异带，在5 9 无扩增条带产生， 而在5 5 和5 7 。c 没有非特异带，有较好的特异性，但在5 5 时，有些基 研究论文 因座( d 1 s 1 6 7 7 ) 的峰值小于在5 7 时的峰值，因此我们选择5 7 为复 合扩增体系的退火温度。结果见f i g 2 - 2 ，f i g 2 3 ，f i g 2 4 ，f i g 2 5 。 2 3 循环参数的变化 在其它条件都不变的情况下，仅改变循环参数设置进行实验。a 为2 6 个循环；b 为2 8 个循环；c 为3 0 个循环。实验表明，循环参数对基因座 之间的平衡性和基因座的峰高均有一定的影响。而2 8 个循环的结果具有 最佳的平衡性。结果见f i g 2 6 ，f i g 2 7 ，f i g 2 8 。 2 4m 9 2 + 浓度的变化 虽然m 9 2 + 只是反应缓冲液的一部分，但它在p c r 反应中发挥重要作 用。为了研究m 9 2 + 浓度的变化对复合扩增的影响，将m 9 2 + 浓度设置在 o 5 2 0 m m 范围内，d n a 样品模板量2 n g ，其它条件不变。实验表明， m 9 2 + 浓度在1 0 m m 是最佳选择，低于1 0 m m 时，扩增效率不高，很多基 因座不能被有效地扩增，而高于1 0 m m ，随着m 9 2 + 浓度增高其平衡性和 特异性就越差。结果见f i g 2 - 9 ，f i g 2 1 0 ，f i g 2 1 1 ，f i g 2 1 2 。 2 5 基因座之间平衡度的调配 由于竞争的影响，随着复合基因座数目的增加，各基因座的相对平衡 控制的难度亦加大。通过多次的反复实验，不断调节引物浓度与配比，最 后实现整个复合扩增体系全部基因座的同时扩增并且基因座间达到基本 平衡。 2 6 滑脱峰( s t u t t e rp e a k ) 的研究 在复制过程中，由于d n at a q 酶的滑动，常常在比正常峰小一个重 复单位的位置形成一个小的额外峰，称为滑脱峰。滑脱峰高占相应主峰峰 高比值称为滑脱峰百分比。滑脱峰一般低于等位基因峰值的10 。几乎所 有的d n a 聚合酶都能产生滑脱峰，特别是t a q 酶。滑脱峰在二核苷酸重 复的s t r 基因座较为多见，四、五核苷酸重复的s t r 基因座较为少见。 本部分实验所研究的8 个基因座中除d 9 s 2 1 5 7 和d 1 2 a t a 6 3 两个基因座 为三核苷酸重复外，其余6 个基因座均为四核苷酸重复。s t u t t e r 峰在 d 1 2 a t a 6 3 基因座最为明显，结果见f i g 2 1 3 。 3 复合扩增体系检测结果 应用我们自行设计的五色荧光组合方案和9 个基因座分两组复合扩 增的组合方式：蓝色荧光染料( f a m ) 标记d 1 0 s 1 2 4 8 和d 1 2 a t a 6 3 ；黄 研究论文 色荧光染料( t a m r a ) 标记d 1 s 1 6 6 7 和d 1 0 s 1 4 3 5 ；绿色荧光染料( h e x ) 标记d 2 s 4 4 1 和d 9 s 11 2 2 ；红色荧光染料( r o x ) 标记d 9 s 2 1 5 7 、d 2 s 1 7 7 6 和a m e l o g e n i n ，峰形对称尖锐，无双尖峰，峰之间高度平衡。 4 7 研究论文 附图 f i g 2 - 1 f 1a n df 2g r o u p s p c ro u t c o m eu n d e rt h eo p t i m a lp r i m e rc o n c e n t r a t i o n 。l ：广彳一一 = l j 襄：二二卫：二二 f i g 2 - 2 f 1a n df 2g r o u p s p c ro u t c o m eu n d e r5 3 “ ca n n e a lt e m p e r a t u r e 二 三 熬 m r 。一一产+ 。2 一。1 。2 。1 。! l 叫!上i j ! 山一；。 。l i 一 ：厂一矿。1 2 。3 。 习i 。l jfd 一 旧 。 = 。 “l 一r 一5 2 。2 l 。1 2 。o = 1 t。“ n i e 二三i e f ：二二 = jl： i 二匝二二 二i 二二 ：i 二匹二二! | 二五二二 f j 昏2 - 4f 1a n d f 2g r o u p s p c ro u t c o m e u n d e r 5 7 a n n e a l t e m p e r a t u r e i 二二二：二i 二二 i 二芒覃二二二二二t 上 乱一 ：厂= j 1 跫。j ， i 二：二 二二= 二二 吖2 o o o 。o o o o o ot l j l = = l ；2 o = 2 一 赴。 竺! 。8 _ z i - 磊= _ _ _ 嬲1 i 7 0 ：，一_ 、。v 。| 。n 。 _ ! i - ! l j _ _ i _ j 一- r - h j l _ h ， i jl。j l v 。”叫扣佃u c、 一二- ，嚏一! m ”，。1 。篇；= - * r # 寸。1 。2 。 i l 。 。，一1 l 一 畸l o o 0 o i _ _ lf j j l j - _ = 2 ：l _ = = n = l = 一 乱。 。i! !。 嘶2 2 。2 。f 。2 2 。1 2 。 赴! 竺l l - l - _ 口r i l l = j ! 一f = ：l j l 0 l 2 l _ = l = ：l叫 i l 。丝。一 j 。_ - r i 一 。 = 一o l ! ! 一* j = = = l l j l i l _ l o 2 s ! = ：l 。j 1jl 一 o” _1 ：l - i l j ；。一i i l i 。l _ 莲二二i 二蕞j r 二二 。：l 。：二。i i i 。i l 。：。一 o 。l l = = 2 = 一- 产2 。o 。1 o 。o i 江幽止丛丛也。 址 五出l 虹蕊k 出。础。皂 堕。! 研究论史 一厂一= 厂一一一 = l !山黾! i 厂一i 厂_ f i g2 9 f 1a n df 2g r o u p s p c ro u t c o m eu n d e r o s m m o l l m g “c o n c e n t r a t i o n i 二j 二i 叵 二二 f i g 2 - 1 0 f ia n d f 2 g r o u p s p c ro u t c o m eu n d e r l 0 m m o l l m f + c o n c e n l r a t i o n ! 壅垒圭 = = i i i i # f i i i i = 一 ：厂一 一l ? l 。上。一 f i g 2 1 1 f 1a n d f 2g r o u p s p c ro u l c o m e u n d e r l s m m o l l m g z + m c e n t r a t i o ；? i = = $ 2 i 。一 i e 二i 二二乏= ( = 二二i 一，：! 号 ；一 i = 三二二 二i 二 芎= = = 二= j 二_ l 。也血。 。目 l f i 2 1 2 f ia n d f 2g r o u p s p c ro u t c o m eu n d e r 2 0 m m o l l m 9 2 + 1 2 0 n c e a t