毕业设计（论文）-禽巴氏杆菌ptfa基因原核表达载体的构建.doc

摘 要禽巴氏杆菌ptfa基因原核表达载体的构建食品与生物工程学院 *指导教师 *摘要多杀性巴氏杆菌（pasteurella multocida p.m）是有荚膜的革兰氏阴性杆菌，属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属。禽巴氏杆菌病（又称禽霍乱）是由巴氏杆菌所引起的家禽和野禽的一种急性、接触性、败血性疾病总称。近年来国内外学者的研究表明，菌毛是巴氏杆菌表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物，其化学组成是菌毛蛋白（pilin）。它是禽多杀性巴氏杆菌的重要致病因子。菌毛在禽巴氏杆菌感染过程中与粘附有关。ptfa基因编码的蛋白是禽多杀性巴氏杆菌的菌毛蛋白，在机体抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击中具有重要作用。本文通过已公布的菌毛蛋白ptfa基因的序列，设计了一对引物，以提取的巴氏杆菌基因组为模板，进行pcr特异性扩增出ptfa基因，将扩增得到的产物克隆到载体pet30a中，得到重组质粒pet30aptfa 转化到大肠杆菌dh5菌株的感受态细胞中，将转化形成的重组细胞进行涂布（含卡那霉素的lb平板）筛选，挑取平板上的单菌落进行扩培，对扩培液再次进行纯化，提取纯化细胞的质粒进行pcr扩增检验，将呈阳性的提取质粒进行测序，成功获取ptfa基因同时表明原核表达载体构建成功，为巴氏杆菌疫苗的研究奠定了基础。关 键 词：多杀性巴氏杆菌，ptfa基因，基因组提取，原核表达载体prokaryotic construction of expression vector ptfa gene from avian pasteurella multocidacollege of food bioengineering *tutor *abstractfowl cholera,which pathogen is pasteurella mutocida,is a kind of acute、contagiousand septicaemia infection disease in domestic poultry and wild birds.many studies have shown that, fimbriae on the pasteurella surface is more detailed, straight , hard and shorter than the flagellum, its chemical composition is the pili protein (pilin).it it is an important pathogenic factor.of pasteurella multocida.fimbriae has infections on the process of poultry fimbriae and adhesion.the protein which ptfa encoded is the pilus of pasteurella multocida. it has an important role in the body against avian pasteurella multocida .in this paper, a pair of primers were designed according to the ptfa gene sequence published . the pasteurella multocida p.m genome was extracted as template for pcr amplified specific ptfa gene. the pcr product was recovered and cloned into the clone vector pet30a, and was transformed into e.coli strain dh5 competent cells. the recombinant plasmid pet30a-ptfa was selected by kanamycin. plasmid was extracted and tested by pcr amplification. the results show that the prokaryotic expression vector was constructed successfully.key words：pasteurella multocida, ptfa gene, genomic extraction, prokaryotic expression vectorii目 录目录前 言1第1章 文献综述31.1 多杀性巴氏杆菌概述31.2 溶血性巴氏杆菌概述31.3 多杀性巴氏杆菌毒力因子及免疫原的研究41.3.1 荚膜41.3.2 外膜蛋白51.3.3 脂多糖61.3.4 多杀性巴氏杆菌毒素61.4 多巴氏杆菌重要基因的研究61.4.1 荚膜合成基因61.4.2 溶血基因71.4.3 磺胺耐药基因71.4.4 toxa基因71.5 本研究的目的和意义8第2章 实验内容92.1 实验材料92.1.1 菌种92.1.2 载体92.1.3 主要试剂92.1.4 分子生物学试剂92.2 培养基及主要试剂配制92.2.1 培养基配制92.2.2 缓冲液配制102.2.3 琼脂糖凝胶电泳缓冲液、胶的配制102.2.4 其他相关试剂或溶液的配制112.3 主要仪器112.4 方法112.4.1 菌种的活化与保藏112.4.2 巴氏杆菌基因组dna的提取122.4.3 引物的设计与合成122.4.4 ptfa基因的克隆132.4.5 pcr产物的凝胶回收132.4.6 酶切目的基因和质粒142.4.7 感受态细胞的制备152.4.8 连接反应152.4.9 转化162.4.10 重组质粒的提取162.4.11 pcr扩增检验目的基因17第3章 结果与分析183.1 基因组dna的pcr扩增183.2 感受态大肠杆菌的制备183.3 重组质粒的pcr扩增鉴定19第4章 结论20参考文献21致谢23iv前 言前 言多杀性巴氏杆菌在兽医学是一个非常重要的病原，也是人类的一个条件性致病菌，由于其抗原性、宿主特异性和致病机理的不同，其感染的宿主也存在很大的差异，一些特定的血清型是导致动物某些严重巴氏菌病，如禽霍乱，牛出血性败血病，猪肺疫和猪萎缩性鼻炎等的病原菌。该菌已经给畜牧业造成了重大的损失，无论是在国内还是在国外，其危害性已经引起了人们高度重视。国内外研究人员在开发高效、安全的疫苗方面已做了大量的研究。我国在全菌灭活苗、减毒活疫苗和菌体成分亚单位苗的制备上已取得了一定的成果，如国内的多杀性巴氏杆菌全菌的菌蜕疫苗，有较好的免疫保护效果。多杀性巴氏杆菌血清型较多，不同地区的菌种差异明显，因而研究的疫苗还不能对多种血清型菌株引起的疾病都起到预防作用，研发针对多种血清型的疫苗是今后研究的方向。对本菌引起的巴氏杆菌病的防治除了接种疫苗外，还需如加强饲养管理、药物治疗等综合措施。 菌毛也叫作纤毛(fimbriae)，其化学组成是菌毛蛋白(pilin)，菌毛与运动无关。菌毛可分为普通菌毛(commonpilus)和性菌毛(sexpilus)两种。4型菌毛(type 4 fimbriae)，普通菌毛的一种，具有黏附作用，能使细菌牢固地附着于动物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜上皮细胞上。是公认的毒力因子。目前发现，一些不同种类的细菌如大肠杆菌(escherichiacoli)、嗜水气单胞菌(aeromoru砧hydrophila)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)等的4型菌毛具有一定的同源性，n端序列高度保守。另外4型菌毛根据前体蛋白n端信号肽长度又可分为两种，其一较短n端存在6-7个氨基酸的信号肽，被称为典型4型菌毛，其二为类4型菌毛，它的信号肽较长。4型菌毛曾被应用于防止羊腐蹄病及牛传染性结膜炎。将多杀性巴氏杆菌的4型菌毛蛋白的成熟蛋白与其他细菌的进行比较，发现有高度的同源性。通过基因工程手段克隆ptfa基因时，发现它的信号肽比经典的4型菌毛的要长，其中序列“kgftlielmtv”高度保守，与其他菌(如流感嗜血杆菌与巴氏杆菌属的其它菌)的同源性较高。 禽巴氏杆菌的ptfa基因编码的蛋白是菌毛蛋白，在机体抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击中具有重要作用。利用pcr扩增技术、基因组提取技术、原核载体的构建、连接、筛选与鉴定等基因克隆操作，成功构建ptfa原核表达载体，体外获取ptfa基因充分了解巴氏杆菌ptfa基因特性，对研究防止巴氏杆菌病的疫苗有所帮助。因此，对ptfa基因原核表达载体的构建及其研究具有重要的意义。1第1章 文献综述第1章 文献综述1.1 多杀性巴氏杆菌概述多杀性巴氏杆菌一种两段钝圆，中央微突的短杆菌或球杆菌，长0.62.5微米，宽0.250.6微米，不形成芽胞，不运动，无鞭毛，革兰氏染色阴性的需氧兼性厌氧菌。本菌在添加血清或血液的培养基上生长良好。在血琼脂上生成灰白色，湿润而粘稠的菌落，不溶血；在普通琼脂上形成细小透明的露珠状菌落；在普通肉汤中，初均匀混浊，以后形成黏性沉淀和菲薄的附壁菌膜；明胶穿刺培养，沿穿刺孔呈线装生长，上粗下细。本菌的抵抗力不强，在直射阳光和干燥的情况下迅速死亡；6010min可杀死；一般消毒药在几分钟或十几分钟内可杀死。3石炭酸和0.1升汞水在1min内可杀菌，10石灰乳及常用的甲醛溶液34min内可使之死亡。在无菌蒸馏水和生理盐水中迅速死亡，但在尸体内可存活13个月，在厩肥中亦可存活一个月。用特异性荚膜抗原（k抗原）吸附于红细胞上作被动血凝试验，分为a、b、d、e和f五型血清群；利用菌体抗原（o抗原）作凝集试验，将本菌分为12个血清型。若将k、o两种抗原组合在一起，迄今已有16个血清型。该病的病型，宿主特异性，致病性，免疫性等，都与血清型有关。本菌可使鸡、鸭等发生禽霍乱，使猪发生猪肺疫，使各种牛、羊、兔、马以及许多野生动物发生败血症。1.2 溶血性巴氏杆菌概述形态、培养和抵抗力与多杀性巴氏杆菌基本相似，但在血琼脂上新分离菌菌落产生溶血，连续继代培养后，溶血性减弱或消失，在羔羊血琼脂上可生成双溶血环。在麦康凯琼脂上能缓慢生长，菌落为红色，不产生靛基质，一般能发酵乳糖，产酸，对家兔无致病力。根据生化反应和致病性的不同，可分为a和t两个生物型；a型引起牛、绵羊肺炎和新生羔羊败血症；t型引起3月龄以上的羔羊败血症。另外还可按其可溶性荚膜抗原（k抗原）用间接红细胞凝集试验分为12个血清型，其中3、4、10属于t生物型，其余各型均属于a生物型，所有血清型都可见于绵羊、山羊，牛仅见1型。1.3 多杀性巴氏杆菌毒力因子及免疫原的研究细菌的毒力因子对其致病性和在宿主体内的存活及繁殖能力都有重要的作用。有些毒力因子还具有较强的免疫原性，因此对这些毒力因子的研究有望为该病的预防和治疗提供科学的理论依据。随着生物技术的迅速发展，对多杀性巴氏杆菌细胞表面成分的免疫特性研究及其作为保护性抗原的可能性探索引起学者们的广泛兴趣。目前已经确定的多杀性巴氏杆菌的毒力因子及免疫原主要包括荚膜、外膜蛋白、脂多糖及能引起猪萎缩性鼻炎的菌株中的pmt毒素等。1.3.1 荚膜荚膜(capsule)是细菌合成并分泌于菌体外堆积的黏液性多糖或多肽类物质，具有黏附、抗吞噬等作用，另外在营养缺乏时还可以作为营养物质被吸收。多杀性巴氏杆菌的荚膜主要成分为透明质酸、n一乙酰葡糖胺聚合体和葡萄糖醛酸，其抗原性可用于细菌的分型和鉴定。英膜也是多杀性巴氏杆菌重要的毒力因子，多杀性巴氏杆菌的强毒菌株都有荚膜，而弱毒菌株一般都是无荚膜的，有研究结果表明，引起猪萎缩性鼻炎的多杀性巴氏杆菌荚膜缺失突变株的致病力明显下降。此外，荚膜进入机体后可诱导机体产生一定的保护性免疫反应。巴氏杆菌抗血清的杀伤活性与荚膜的存在与否有关，存在荚膜的多杀性巴氏杆菌抗血清的杀伤活性明显强于无荚膜者。pruimboom等研究结果表明，有荚膜的多杀性巴氏杆菌对噬菌作用的抵抗能力远远高于无荚膜的菌株。对于细菌性疾病的免疫预防，目前所使用的疫苗主要是灭活菌苗和减毒的活菌苗。但是用强毒菌株制备疫苗不但对生产条件要求高，而且存在一定的安全隐患。强毒株在致弱的过程中荚膜上的某些化学物质如果缺失，则会导致其免疫原性有所降低，这可能是某些弱毒疫苗免疫效果不尽如人意的原因，因此人们希望找到一种安全高效的疫苗，而荚膜既保持了病原菌株的免疫原性，又不存在安全隐患，无疑是较好的疫苗候选抗原。entomack等1研究结果表明，多杀性巴氏杆菌荚膜的致病能力与荚膜中39 ku蛋白的含量有关。entomack等1在猪多杀性巴氏杆菌对hela细胞附着能力的研究中发现，死菌苗菌株对小鼠的毒力和对hela2 3细胞的附着能力强于活菌苗株，同时在死菌苗菌株的荚膜中存在39 ku的特异蛋白，而此蛋白在活菌苗菌株中不存在。上述结果也表明，39 ku的荚膜蛋白与多杀性巴氏杆菌的致病力相关。1.3.2 外膜蛋白革兰氏阴性菌的外膜蛋白(outermembrane proteins，omps)在致病菌对宿主的感染和致病过程中起着重要的作用。多杀性巴氏杆菌omps包括主要蛋白和微量蛋白两种，两者在细胞中的拷贝数差别较大。这些蛋白位于致病菌和宿主细胞的接触面上，这些蛋白的功能受到各种选择压力的影响。omps能从不同程度展示不同菌株间的变化，这可以用来评定菌株间的差异，从而确定与流行病学的关联。主要蛋白包括外膜蛋白h(omph)、外膜蛋白a(ompa)、铁调节蛋白等。主要蛋白在细胞内表达的拷贝数可达到2105左右。微量蛋白种类较多，其在细胞内的拷贝数为103104，另外omps的数量及种类也因菌株和培养条件的不同而有所不同。外膜蛋白是多杀性巴氏杆菌的主要免疫原，应用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白制备的疫苗对小鼠、鸡和兔进行免疫显示了明显的保护力。ompa蛋白又称为热修饰蛋白，该蛋白经sds加热后进行sds-page时，其泳动速度明显减慢，这种热修饰可能是由于ompa蛋白富含8-折叠结构，且在自然情况下不形成对sds抵抗的寡聚体(oligomer)，加热时分子构象易发生改变从而导致不对称性增加的结果。omph是多杀性巴氏杆菌菌体最主要的外膜蛋白之一，属于孔蛋白，其分子质量为3239 ku，具有一般孔蛋白的特性，能诱导很高水平的保护性抗体。吴斌等2利用pcr方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的omph基因，并构建了原核表达载体pet28b-omph，进行了表达，sds-page结果显示表达蛋白为35 ku。多杀性巴氏杆菌多种外膜蛋白均可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答。confer等4用多杀性巴氏杆菌接种犊牛，刺激其产生抗多杀性巴氏杆菌omps的抗体，并用elisa方法检测其效价，结果发现，有6种omps血清抗体与抵抗攻毒有关，并可增强巨噬细胞的吞噬能力和活化补体，抑制细菌与宿主的黏附，提示其在保护牛多杀性巴氏杆菌引起的肺炎方面有着重要的作用。rimler等4 5研究结果发现，体内生长的菌株对外膜相关抗原具有交叉保护作用，而体外培养的菌株只能对同型的攻毒提供保护作用。chevalier等认为37 ku的外膜蛋白是主要的孔蛋白，truscott等报导50ku的外膜蛋白具有抗噬菌细胞的作用，证明抗375ku的外膜蛋白单克隆抗体在动物试验中具有保护作用。omph蛋白也是多杀性巴氏杆菌的一种主要的保护性抗原，免疫保护试验结果表明，omph蛋白能够对同源菌产生保护力6。因此，通过对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白免疫原性及保护性的研究，使得开发多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗成为可能。1.3.3 脂多糖脂多糖(1ipopolysaccharide，lps)是革兰氏阴性菌致病物质一内毒素的物质基础，在革兰氏阴性菌崩裂时释出，是很强的发热原。目前人们普遍认为脂多糖(lps)在多杀性巴氏杆菌的致病过程中起着重要的作用。研究结果表明，多杀性巴氏杆菌的lps在对嗜中性粒细胞的黏附中起着辅助作用4。从血清型为b：2的菌株中分离到的lps被认为是一种内毒素，静脉注射lps能够引起动物产生出血性败血症的症状，然而幼龄火鸡对从a型多杀性巴氏杆菌中分离的lps具有一定的抵抗力，与之相反的是人们发现鸡胚和小鼠对多杀性巴氏杆菌lps毒素高度敏感。除了具有致病性外，多杀性巴氏杆菌的lps能够诱发体液免疫，因此被认为是一种保护性抗原。adler等7 8对多杀性巴氏杆菌lps的免疫原性进行了研究，研制的多杀性巴氏杆菌lps单克隆抗体具有调理小鼠巨噬细胞吞噬能力的作用，强毒攻击后可为试验动物提供部分保护力。1.3.4 多杀性巴氏杆菌毒素多杀性巴氏杆菌毒素(pasteurella multocida toxin，pmt)是一种由产毒素多杀性巴氏杆菌产生的能引起猪进行性萎缩性鼻炎的皮肤坏死毒素9；是一种有丝分裂原，它与哺乳动物细胞上的受体结合进入细胞后，可以启动dna的合成，独自就可引起细胞生长和分裂。pm能使破骨细胞数量增多、功能增强而使骨的吸收能力增强，同时又能使成骨细胞的前体细胞生长加快而不能再分裂，已成熟的成骨细胞进行性变性而又得不到补充，从而骨的合成能力下降，致使鼻甲骨生长过程中的合成与吸收作用失去平衡而萎缩。1.4 多巴氏杆菌重要基因的研究随着基因组序列的测定，目前人们已经明确一些基因在多杀性巴氏杆菌致病及免疫保护方面具有重要的作用，许多研究者正致力于多杀性巴氏杆菌一些重要基因的研究工作。当前研究的基因主要有荚膜合成基因、溶血基因等。1.4.1 荚膜合成基因多杀性巴氏杆菌的荚膜具有群特异性，4种不同血清型的荚膜合成基因区的荚膜合成位点结构十分相似，都分为3个区域。第1个区域和第3个区域所包含的基因与荚膜多糖转运到细胞表面和荚膜的磷脂取代反应有关。第2个区域的基因负责荚膜多糖的生物合成，其编码的蛋白质能催化组成有活性的单糖及荚膜多糖，并且能催化形成udp一葡糖醛酸及udpn一乙酞葡萄糖胺，主要用于荚膜透明质酸的合成和组装10 11。但不同血清型与荚膜合成有关的基因的具体结构和功能有所差异，基因编码的蛋白也有所不同，但执行的功能是相似的。1.4.2 溶血基因多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下有溶血特性，能溶解牛、马和羊的红细胞。cox等12扩增了多杀性巴氏杆菌溶血基因ahpa的全序列，发现所有多杀性巴氏杆菌中都存在ahpa基因。townsend等12于1998年用全基因扣除杂交法发现的一个克隆片段，将其称为kmtl基因。用这个克隆片段与多杀性巴氏杆菌pst i酶切片段进行杂交，发现其抗原能与所有多杀性巴氏杆菌杂交，但b和e群株的片段长度有所不同。从kmtl内部设计的引物能从所有多杀性巴氏杆菌菌株中扩增出460 bp的片段。核酸杂交和pcr检测证明，此基因在所有多杀性巴氏杆菌中都存在，且在gen-bank中核酸库检索没有相似序列，是多杀性巴氏杆菌独有的序列，即kmtl基因是多杀性巴氏杆菌的一个种特异性基因，该基因的具体功能至今不清楚。目前已经利用kmtl基因作为目的基因，建立了多种用于检测多杀性巴氏杆菌的pcr方法。1.4.3 磺胺耐药基因近年来，随着临床分离到的多杀性巴氏杆菌耐药株的不断增多和耐药水平的不断提高，给临床抗感染治疗带来了新的难题。特别是针对禽霍乱治疗药物之一的磺胺已在临床治疗上表现出极高的耐药性。因此，开展动物源性巴氏杆菌磺胺耐药基因的研究显得尤为重要。巴氏杆菌的耐药性由质粒介导，磺胺耐药基因(sul基因)位于14222237 bp处，全长约为816 bp，g+c含量约为561。金天明等13 14成功地将sul基因克隆到原核表达载体pet一28a(+)中，将构建好的pet-28a(+)-sul 11原核表达质粒转化到受体菌bl_2l(de。)，经iptg诱导后，检测到sul ii外源基因有较高的表达水平，表达量为11。1.4.4 toxa基因toxa基因编码产生皮肤坏死毒素(pmt)，此基因长4381 bp，编码1465 ku的蛋白质，位于负调节基因txar基因之后。王大鹏等1运用pcr技术成功扩增了猪源d型产毒多杀性巴氏杆菌的全毒素toxa基因，并将其克隆到pmdl8一t上。序列分析表明，该pcr产物中含有完整的toxa基因序列，与genbank上所报导的5个toxa基因序列的大小完全一致，其核苷酸序列同源性都在998以上，推测该基因非常保守。1.5 本研究的目的和意义多杀性巴氏杆菌的基因组较大，所含基因也较多，且血清型多，感染的宿主范围广泛，并有宿主特异性。巴氏杆菌病是禽类的一种接触性传染病。该病仍难得到控制，对世界养禽业造成了很大的经济损失。预防该病仍使用疫苗，所使用的疫苗包括灭活苗和弱毒苗，但它们均有各自固有的缺点，全菌灭活苗仅仅只诱导产生血清型特异性免疫保护。弱毒苗虽能够提供有限的异源保护，但有时会诱导暴发禽霍乱。目前对多杀性巴氏杆菌的研究仍处于检测诊断和基因克隆分析的初步阶段，研究方向包括荚膜，菌毛，外膜蛋白。菌毛对多杀性巴氏杆菌的特异性保护抗原成分，菌毛主要有菌毛蛋白构成。ptfa基因编码禽多杀性巴氏杆菌的菌毛蛋白，通过对ptfa基因原核表达载体的构建成功克隆出ptfa基因可以了解禽多杀性巴氏杆菌菌毛蛋白的致病性机理，并可筛选有用的抗原基因用于巴氏杆菌病的诊断与防制。本研究以禽多杀性巴氏杆菌主要菌毛蛋白编码基因ptfa为基础构建了原核表达质粒pet30a，导入大肠杆菌感受态细胞中进行了表达及检测。旨在为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌病新型有效疫苗奠定一定的基础。17第2章 实验内容第2章 实验内容2.1 实验材料2.1.1 菌种供体菌：禽巴氏杆菌 受体菌：实验室保藏菌种大肠杆菌。2.1.2 载体pet30a2.1.3 主要试剂胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、琼脂糖、异丙醇、异戊醇、卡那霉素、tae、naoh、氯仿、tris饱和酚、甘油、edta硼酸、冰乙酸、edta、乙酸钾、mgcl2、eb，以上试剂均为国产分析纯。2.1.4 分子生物学试剂ptfa引物1、2，由上海英俊生物技术有限公司合成，dna合成酶，dntps，t4dna连接酶，maker del2000，6loading buffer，10pcr buffer，凝胶回收试剂盒，pet30a质粒，限制性内切酶hind 、ecor 等。2.2 培养基及主要试剂配制2.2.1 培养基配制（1）tsa液体培养基： 胰蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 氯化钠（nacl） 5.0g ph 7.2 lb液体培养基18： 胰蛋白胨 10.0g 酵母提取物 5.0g 氯化钠（nacl） 10.0g ph 7.0以上两种培养基分别称取，试剂加入950 ml去离子水，定容到1000 ml，121高压灭菌20 min，室温保存备用。将配制的tsa液体培养基分装，按每三角瓶25ml或每试管5ml的量分装，备用。（2）lb固体培养基：加琼脂粉15g于1000 mllb液体培养基中，121高压灭菌20 min，冷却至50左右，倒平板，无菌检验后，4贮存备用。（3）含卡那霉素平板：将配制成50mg/ml的卡那霉素按1l/ml的比例加入到冷却到40的含琼脂的lb培养基中，摇匀，迅速倒平板。（4）含卡那霉素液体lb：将配置成50mg/ml的氨苄青霉素按1l/ml的比例加入到冷却到40的lb液体培养基中，摇匀，用5ml无菌移液管进行分装。以上试剂加入950ml去离子水，调节ph值为7.0，补足水至1000ml，121灭菌20min。接种后37培养24h或37、125rpm摇床培养24h。2.2.2 缓冲液配制（1）te缓冲液的配制 tris-hcl 10mmol/l edta 25mmol/l（2）50tae缓冲液的配制 tris 242g na2edta.2h2o 37.2g 称取上述物质放于1l的烧杯中，然后加入800ml的去离子水完全解，加入57.1ml的醋酸，充分混匀，加去离子水定容至1l，室温备用。2.2.3 琼脂糖凝胶电泳缓冲液、胶的配制（1）1tae 将50tae按1：49的比例进行稀释即是。（2）琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 0.01g/ml；加50tae 25ml(1%琼脂糖) ； 琼脂糖 0.009g/ml；加50tae 25ml(0.9%琼脂糖) ； 琼脂糖 0.015g/ml；加50tae 25ml(0.15%琼脂糖) ； 加热完全溶胶后倒入制胶板。2.2.4 其他相关试剂或溶液的配制（1）10%sds：取10g电泳级sds溶于80ml去离子水中，调至ph7.2，定容至100ml，室温保存。（2）50mg/ml卡那霉素：用灭菌水配制成50mg/ml的溶液，无菌过滤器过滤后，置-20冰箱保存。（3）溶液： 葡萄糖 50mmol/ml tris-hcl 25mmol/ml edta 10mmol/ml （4） 溶液：0.4mol/ml naoh和2% sds用前等体积混合。（5）溶液： 5mol/l kac 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml（6）氯仿：异戊醇：体积比24：1。（7）酚：氯仿：异戊醇：体积比25：24：1。（8）70%乙醇：70ml无水乙醇，用去离子水定容至100ml。2.3 主要仪器tg16-w微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司； gmsx-280手提式压力蒸汽消毒器：北京市永光明医疗仪器厂；hh-s恒温水浴锅：江苏金坛市亿通电子有限公司；dycz-28a型电泳槽：北京市六一仪器厂；电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；移液器：大龙医疗设备（上海）有限公司；fm50雪花制冰机：北京长流科学仪器公司；lx-100手掌型离心机：江苏海门市麟麟医用仪器厂；pcr仪：德国生产；sw-cj-1f型单人双面超净工作台：苏州净化设备有限公司；电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；微波炉：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司等。2.4 方法2.4.1 菌种的活化与保藏（1）菌种的活化按上述培养基的配方配好tsa液体培养基，分装到6只试管（5ml/管）和6个锥形瓶（25ml/管）中，121高压蒸汽灭菌20min，备用，按下述方法进行活化。挑取实验室保存的巴氏杆菌平板单菌落，接种于试管中，贴上标签（16），37、150rpm摇床过夜培养。按1：10的比例扩大培养，即吸取2.5ml的活化菌液接种于锥形瓶中，37、150rpm摇床过夜培养。（2）菌种的保藏将灭菌好的35%的甘油与扩培菌液按1：1的比例保藏于1.5ml的ep管中，即吸取200l的扩培液与200l的甘油混匀，贴好标签（16），-80冻存。2.4.2 巴氏杆菌基因组dna的提取按下述步骤提取基因组dna：（1）取约10.0ml对数生长期的巴氏杆菌扩培液于5.0ml ep管中，12000rpm离心1min（分4ml、4ml、2ml三次取），弃去上清液，沉淀加入500l的te缓冲液，摇匀，使细胞重悬；（2）加入30l的10%sds,3l蛋白酶k，混匀，37，1h；（3）加入100l的氯化钠（5m）混匀，80l的ctab/nacl，混匀，65保温20min；（4）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25241）混合液，混匀，12000rpm离心5min，取上清于一新的ep管中；（5）用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25241）混合液抽提，混匀12000rpm离心5min，将上清移至另一新的ep管中；（6）用等体积的氯仿/异戊醇（241）混合液抽提，将上清移至另一新的ep管中；（7）加入二倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20保存1020min，沉淀dna，12000rpm离心10min，弃去上清；（8）用75%乙醇洗涤沉淀两次，12000rpm离心10min，弃去上清，室温干燥沉淀；（9）将沉淀溶于100l 含酶的te中，-20保藏。2.4.3 引物的设计与合成根据文献报导的禽多杀性巴氏杆菌型菌毛基因设计一对引物，对染色体dna进行扩增，引物由上海英骏生物技术有限公司合成：引物 ptfa 1：5 tgcaagcttatgaaaaaagccattttc 3引物ptfa 2：5tgcgaattcttatgcgcaaaatcct32.4.4 ptfa基因的克隆（1）目的基因的pcr扩增17 按下面的反应体系进行扩增：（下面单位均为l） 反应加样体系： 50体系 dntps mixture 1 10pcr buffer 5 引物1（20l /ml） 1 引物2（20l /ml） 1 模板dna 1 taq酶 0.5 无菌水 40 反应体系在冰上进行加样，加样完成后用微型手掌离心机离心，放入pcr仪中进行扩增。 pcr扩增体系设置如下： 热盖温度99 预变性 94 5min 变性 94 1min 退火 55 1min 延伸 72 1min 30个循环，72延伸5min。（2）1%琼脂糖凝胶电泳检验 称取0.25g的琼脂糖于干净锥形瓶中，加入25ml的50te缓冲液加热溶解制胶； 按下述量进行加样： 2l pcr产物+1l 6loading buffer+1ldna染料；3l dl2000 maker+1ldna染料； 120v，91ma，100w跑电泳；用紫外透射仪观察结果。2.4.5 pcr产物的凝胶回收（1）用大号制胶梳子制作好1%琼脂糖凝胶，将pcr产物大量加样，跑电泳；（2）用干净的手术刀将凝胶电泳的pcr产物目的dna片段尽量和其他的dna分开，切割下的dna片段用于回收，放入1.5ml离心管中，称重；（3）根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300-600l的比例加入 buffer b2。注意：、凝胶浓度1%，每100mg凝胶加入300lbuffer b2；、凝胶浓度1%，1.5%，每100mg凝胶加入400lbuffer b2；、凝胶浓度1.5%，2.0%，每100mg凝胶加入500lbuffer b2； 、凝胶浓度2.0%，每100mg凝胶加入600lbuffer b2称量加入琼脂块前后的ep管的重量： 前 0.909g 0.913g后 1.347g 1.336g差额 0.438g 0.423g 按400l /100g所加的bingding buffer 为1752l和1692l。（4）将ep管置于50水浴锅中5-10mim，使胶彻底溶化，加热溶胶时，每2min混匀一次；（5）当目的基因500bp时加入所使用的buffer b2体积13的异丙醇，混匀。当目的基因500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤6（6）将融化好的溶液全部移入吸附柱，8000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（7）向吸附柱中加入500 lwash solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。注意：wash solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。（8）将空吸附柱和收集管加入离心机，9000g离心1min。（9）在吸附膜中加15-40l的elution buffer，室温静置2min，9000g离心1min； 将所得到得dna溶液置于-20，或用与后续实验。2.4.6 酶切目的基因和质粒质粒酶切体系如下（10l体系）：pet30a 2lecor 0.5lhind 0.5l10tango buffer 2l无菌水 5l同时做4管，37水浴4h，取2l进行0.9%琼脂糖凝胶电泳目的基因酶切体系如下（10l体系）：ecor 1.0lhind 1.0l10tango buffer 2lpcr回收产物 6l2.4.7 感受态细胞的制备（1）前夜接种受体菌，挑取单菌落于lb培养基中37摇床培养过夜（约16小时）； （2）取1ml过夜培养物转接于100mllb培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5小时（250-300rpm）； （3）将0.1mcacl2溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 （4）吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； （5）4下3000g冷冻离心5分钟； （6）弃去上清，加入100l预冷0.1mcacl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； （7）4下3000g冷冻离心5分钟； （8）弃去上清，加入100l预冷0.1mcacl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； （9）以pet30a质粒进行转化以检测转化效率。2.4.8 连接反应 连接反应体系为：（以下单位均为l） t4dna连接缓冲液 2 pcr酶切产物 6 pet30a 酶切载体 10 t4dna连接酶（5u/l） 2 加无菌水补足20l。将反应体系16过夜。2.4.9 转化（1）含卡那霉素培养基的制备：按上述的配方配制lb培养基，灭菌、冷却至45左右时加入卡那霉素，倒平板（含琼脂）或分装试管（不含琼脂），备用；（2）大肠杆菌菌种的保藏：连接反应时，挑取-80冻藏的感受态细胞划线接种于不含卡那霉素的平板上，37过夜培养；挑取单菌落接种于含有5ml液体lb培养基的试管中，37、150rpm摇床过夜培养；吸取200l的菌液以11的比例与35%甘油混匀-80保藏（贴标签为菌种：大肠杆菌）；（3）取200l -80冻藏的感受态细胞，加入重组质粒10l，同时用加入2l的pet30a质粒做对照，冰上放置30min；（4）将体系放到42水浴锅中保温90s；（5）冰浴2min；注：以上在超净台、且冰上操作，全程保持低温，在感受态细胞融化的短时间内把操作完成，避免使感受态细胞不再敏感。（6）向每个反应管中加入800l的lb培养基，37、150rpm摇床培养1h；（7）4000rpm室温离心2min，使细胞沉淀，吸去上清液800l（约200l的培养液残留于管内，以增加细胞的浓度），再将细胞重悬；（8）将适当体积的复苏细胞（约100l）涂布在含有卡那霉素的lb平板上，正置30min；倒置平皿，37培养1216h；（9）观察结果。2.4.10 重组质粒的提取（1）挑取筛选平板上的单菌落接种于含有卡那霉素的lb液体培养基中，37、150rpm摇床过夜培养；（2）吸取约1.5ml培养液于1.5ml ep管中，8000rpm室温离心2min，弃去上清液；（3）加入100l溶液于含菌ep管中，漩涡震荡将沉淀重悬，室温放置10min；（4）加入200l溶液，轻轻混匀，冰上碱裂解不超过5min；（5）加入150l溶液（冰上预冷），盖紧管口，轻轻混匀，冰上放置15min，让质粒dna复性；（6）12000rpm室温离心10min，将上清液移于另一1.5ml ep管中；（7）向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25241）抽提，反复混匀，12000rpm室温离心5min，将上清液移于另一ep管中；（8）向上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇（241）抽提，反复混匀，12000rpm室温离心5min，将上清液移于另一ep管中；（9）向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，室温静置30min，12000rpm室温离心10min，吸去上清液；（10）用1ml 70%乙醇洗涤两次（每次12000rpm室温离心5min），吸去上清液，室温干燥；加入20l的te缓冲液（含有20微克/ml的胰rna酶的te缓冲液），使质粒dna完全溶解，进行琼脂糖凝胶电泳后-20保藏。2.4.11 pcr扩增检验目的基因按下述反应体系加样和pcr扩增：（以下加单位均为l） 反应加样体系： 50体系 dntps mixture 1 10pcr buffer 5 引物1（20l /ml） 1 引物2（20l /ml） 1 质粒dna 1 taq酶 0.5 无菌水 40反应体系在冰上进行加样，加样完成后用微型手掌离心机离心，放入pcr仪中进行扩增。 pcr扩增体系设置如下： 热盖温度99 预变性 94 5min 变性 94 1min 退火 55 1min 延伸 72 1min；30个循环，72延伸5min。第3章 结果与分析第3章 结果与分析3.1 基因组dna的pcr扩增采用提取禽巴氏杆菌基因组做模板，用上海英俊生物技术有限公司生产的引物进行pcr扩增，扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，从图3-1中可以看出提取的基因组dna的pcr产物的条带，对应maker所在的位置大约为435bp，与目的基因的预期大小相符合，证明了成功的扩增出了含有目的基因的片段。 1 2 m500250 图3-1基因组dna pcr产物1.0%琼脂糖凝胶电泳；m：maker dl2000；1、2为目的基因的pcr产物。fig.3-1 1% agarose gel electrophoresis of the genomic dna pcr product; m: the dna maker dl2000(bp); 1,2 : pcr product of the target gene 3.2 感受态大肠杆菌的制备取大肠杆菌菌种接种于普通培养基活化，制备感受态细胞，并转化空载体pet30a，结果如图： 图3-2 经质粒转染的大肠杆菌感受态在含卡那霉素培养基上的生长状况fig.3-2 the escherichia coli which is transfected by plasmid in the growth medium containing kanamycin status3.3 重组质粒的pcr扩增鉴定从下面电泳图中可以看出提取的重组质粒的pc