药学本科毕业论文-黄连解毒汤所含黄酮成分对K562ADM细胞多药耐药相关基因表达的影响.doc

药学院毕业论文题目：黄连解毒汤所含黄酮成分对k562/adm细胞多药耐药相关基因表达的影响姓名： 学号： 年级：08级1班 专业：药学本科 指导教师： 职称：助理研究员 学科：中药药理学 二一二 年六月八 日目录中文摘要3英文摘要41.文献综述51.1mdr的实验研究51.1.1p-gp结构及生物学特征51.1.2mdr及mdr的分子遗传学51.1.3mdr-1的表达水平51.2mdr的临床研究61.2.1检测mdr-1rna水平61.2.2mdr的逆转61.2.3利用mdr对肿瘤进行基因治疗71.3 中药对抑制mdr前景展望72.实验部分92.1实验材料92.1.1细胞系和培养基92.1.2试剂92.1.3仪器92.2实验方法92.2.1细胞培养102.2.2药物处理102.2.3 mtt 比色法测细胞增殖抑制102.2.4半定量rt-pcr检测mdr-1、topo基因mrna表达102.2.5统计学处理方法113.实验结果113.1adm对k562细胞及k562/adm细胞增殖抑制作用的影响113.2 黄芩苷对k562/adm细胞增殖抑制的影响113.3京尼平苷对k562/adm细胞增殖抑制的影响123.4黄芩苷、京尼平苷作用后k562/adm细胞中mdr-1、topo及caspase-3基因表达的变化124.讨论15参考文献17致谢19黄连解毒汤所含黄酮成分对k562/adm细胞多药耐药相关基因表达的影响学 生 指导教师 中文摘要目的: 研究黄连解毒汤中黄酮成分对人类红白血病耐药细胞( k562/adm 细胞) 的增殖抑制作用及相关因子表达的影响，并对其作用机制进行初步的探讨。方法: 采用mtt 法检测黄连解毒汤中黄酮成分对细胞增殖抑制的影响。半定量rt-pcr 法检测mdr-1，topo及caspase-3基因的表达。结果: 黄芩苷、京尼平苷对增值抑制作用明显且呈一定剂量依赖性。pcr结果显示黄芩苷、京尼平苷均可以通过降低mdr-1、topo的表达，升高caspase-3基因的表达，发挥逆转白血病细胞mdr的作用。结论:黄连解毒汤中黄芩苷、京尼平苷为其干预与逆转肿瘤多药耐药的有效成分。其作用机制与改变mdr-1，topo及caspase-3基因的表达有关。关键词：黄芩苷 京尼平苷 k562/adm 细胞 多药耐药英文摘要influence of flavonoids ingredients extract from huanglian jiedu decoction on expression of k562/adm cells multidrug resistance related geneabstract: objective to investigate the reversal effect of the flavonoids ingredients extract from huanglian jiedu decoction on proliferation inhibition of mdr of myelo genous leukemia k562/ adm cells and on expression of k562/adm cells multidrug resistance related gene, discuss the possible correlative mechanism. methods the inhibitory rates of these cells were measured by mtt assay and define the effective chemical constituents. the mdr-1，topoand caspase-3 were measured with rt-pcr. results baicaln、geniposide could inhibit the growth of k562/adm cell ,the relation of dosage-effct. baicaln、geniposide can decrease expression of mdr-1 and topo,at the same time it can increase expression of and caspase-3.conclusion defined baicaln、geniposide is effective chemical consituents at work，its mechanism may be related to down- regulating of the mdr-1，topoand caspase-3 expresion.key words: flavonoids ingredients k562/ admcells mdr1.文献综述 肿瘤细胞的多药耐药(mdr)是肿瘤化疗有效率偏低的主要原因之一。在mdr中多药耐药基因(mdr)和由此编码的膜糖蛋白p(p-gp),近年来研究有较大的进展,并且部分研究已由实验转入临床,本文就mdr实验和临床两方面研究作简要概述。在临床肿瘤的综合治疗中,化疗联合方案的应用,已成为肿瘤治疗主要方法之一,但化疗仍存在很多问题,其中肿瘤细胞的多药耐药(mdr)尤为突出且研究最多,部分研究已由实验转向临床,将为临床肿瘤化疗提供明确的指导方向,从而提高肿瘤化疗的有效率。1.1mdr的实验研究1.1.1p-gp结构及生物学特征1970年juliano等首先在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现一种分子量约为170kd的膜糖蛋白。以后进一步研究发现,这种p-gp是一种膜通透性糖蛋白分子量在150kd180kd之间一般认为p-gp具有atp依赖性主动转运泵作用【2】,可将药物由细胞内泵出细胞外,使药物在胞内浓度不断下降,其细胞毒作用因而减弱或消失而出现细胞的mdr。p-gp的含量与抗药水平相平行,由多药耐药基因(mdr)编码。1.1.2mdr及mdr的分子遗传学用仓鼠mdr细胞株扩增序列作探针【1】,从人mdr的kb细胞株中克隆出二同源的基因组序列称mdr-1和mdr-3。mdr-1转录产物为5.0kb的mrna,在mdr细胞中高度表达,mdr-3的表达水平与mdr无关。现已证实人的mdr-1和mdr-3紧密连锁于染色体7q21。1.1.3mdr-1的表达水平用类属特异性探针检测mdr-1在人组织中的表达,发现mdr-1表达具有组织特异性。正常人的肾、肾上腺、大肠、肝等组织中。表达水平较高,而骨髓、肌肉、皮肤及神经组织中mdr-1的表达水平很低。1.2mdr的临床研究在临床肿瘤化疗有效率较低的情况下,随着mdr实验研究的深入,目前部分已转入临床,以指导临床化疗,提高其有效率。1.2.1检测mdr-1rna水平在实验研究mdr中【3】,已知肿瘤发生后肿瘤组织水平有所升高,并且目前已可能运用核酸分子杂交、免疫组化、pcr技术对肿瘤组织mdr-1rna表达水平进行检测,为临床指导首次化疗、复发患者化疗、逆传mdr提供依据,从而提高化疗的有效率。临床可依据mdr-1rna的检测结果针对性选择有效的药物,制定合理的化疗方案,最大可能地避免使用交叉耐药的药物而产生mdr,争取有利时机提高化疗疗效。但是,由于肿瘤mdr-1rna表达具有异质性【4】,也就是说在肿瘤中有时只有一小群肿瘤细胞表达该基因,那么在抽提肿瘤组织检测mdr-1rna时,可能不能准确反映该肿瘤的mdr-1rna水平。因此,这一情况要求实验和临床能够建立一套方便准确的检测方法。1.2.2mdr的逆转目前临床化疗中mdr型药物主要有蒽环类、长春碱类、鬼臼毒素类及其某些抗生素疏水性化合物【5】,这些药物在使用几个疗程后mdr-1的表达水平常升高,从而使化疗的有效率降低。克服此障碍,肿瘤化疗可取得决定性的突破。在这方面有关逆转mdr,使用mdr拮抗剂,体外实验中也已证实能逆转mdr药物有【6】:钙通道阻断剂:异搏定、garoverine;调钙素抑制剂:酚噻嗪、三氟吡啦嗪、clomipraminc;免疫调节剂:环抱素-a;奎尼丁类:奎尼丁、奎宁;合成异戊二烯样药物:n-(p-甲苯基)双苯丙胺等。这些药的在逆转mdr中,概括主要有三条途径实现:抑制mdr-1基因表达;抑制p-gp功能;使用免疫治疗药物。1.2.3利用mdr对肿瘤进行基因治疗肿瘤组织中mdr-1表达水平升高,说明mdr-1表达程度与mdr程度有正相关关系,是肿瘤化疗的一大障碍。但如果利用mdr-1将其导入正常细胞可使正常细胞耐受大剂量的化疗药物的细胞毒作用,从而更有效地杀伤和清除肿瘤细胞。1.3 中药对抑制mdr前景展望 黄连解毒汤系清热解毒的代表方，具有清热解毒之功效，主治实热火毒证。近年来研究证实，黄连解毒汤可影响 mdr模型小鼠s180肿瘤细胞的凋亡及相关因子的表达，提示黄连解毒汤具有肯定的抗肿瘤作用，但与其作用相关的指标成分研究尚不明确。黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，现代研究证实，黄连、黄柏中主要含有小檗碱型生物碱及黄酮类、环烯醚萜类成分。其中，黄芩苷为黄芩的主要成分，京尼平苷为栀子中环烯醚萜苷中的主要成分。因此，我们通过体外试验来研究这两种主要成分对肿瘤细胞 mdr 的作用和机制，为寻找新的mdr 逆转药物提供实验依据。参考文献1.walloner j,pepisch d,gsur a,et al.mdr i gene expression and itsclinical relevance in primary gastric carcinomas.cancer,1993,71:6676712.kramer r,weber tk,morss b,et al.constitute expression of mul-tidrug resistance in human colorectal tumorsandlines. br j cancer,1993,67:9599683.synder ds,wu y,wang jl,et al.ribozyme-mediated inhibitionof bcr-abl gene expression in a philadelphia chromosome positive cellline.blood 1993,5(3):2212274.nooter k,stoter g:molecular mechanisms of multidrug resistance incancer chemotherapy.pathol res pract,1996,192(7):7687805.孙燕主编.临床肿瘤内科手册.第3版.北京:人民卫生出版社,1996,1961976.郭静竹.利用pcr技术检测多药耐药基因在白血病患者中的表达.中华血液学杂志,1994,15(7):3623642.实验部分2.1实验材料2.1.1细胞系和培养基人慢性粒细胞白血病红白血病细胞株k562的耐阿霉素（adriamycin，adm）细胞株k562/adm由山东省医学科学院基础所免疫室提供。rpmi-1640（gibco产品）用三蒸水完全溶解，加入规定量的nahco3和hepes（华美公司产品），0.22um微孔滤膜，过滤除菌，4保存备用。小牛血清购自杭州四季青公司，56水浴30分钟灭活，4保存备用。2.1.2试剂黄芩苷、京尼平苷由山东省中医药研究院提供（纯度 90%），adm系浙江海正药业股份有限公司产品，rpm1640稀释至1mg/ml贮存液，-20保存。mtt 、dmso购自sigma公司，mtt以pbs溶液配制成5mg/ml浓度，0.45m滤器过滤分装，4避光保存。rna提取及rt-pcr所需试剂及引物均购自上海博亚生物技术有限公司，引物按文献合成。2.1.3仪器超净工作台，苏州净化设备厂产品；co2培养箱，日本hirasawa公司产品wj-6c型；紫外分光光度仪，日本日立公司产品，v-2000型；稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂产品，dyy-2型；gel doc1000凝胶图象分析仪，bio-rad公司产品；pcr扩增仪ptc150型，minicycler,美国 mj research公司产品；低温高速离心机，hettch vniieisal 16r 德国产品；低温冰箱（-20），ultra，日本sony公司产品。2.2实验方法2.2.1细胞培养k562/adm细胞以含10%新生牛血清、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、300mg/l l-谷氨酰胺的rpm1640培养液常规传代培养，在37、5%co2、饱和湿度条件下培养和传代。定期加入adm（1g/ml）以刺激mdr-1/p-gp持续高表达。k562 细胞平时用含10%小牛血清的1640 培养液培养两周后用于实验。2.2.2药物处理对数生长期k562/adm细胞培养液中分别加入10 g/ml黄芩苷、20 g/ml京尼平苷及不同浓度的盐酸小檗碱（0、5、10、15、20、25、30g/ml）共孵育72 代。2.2.3 mtt 比色法测细胞增殖抑制以5104个/ml浓度接种于96孔板，每孔100 l。分别加入0.2和0.4 g/ml不同浓度的adm，预留不加药物的阴性对照孔和只加rpmi1640培养基的空白对照孔，37，5% co2条件下培养24 h、48 h、72 h后，每孔加5 mg/ml mtt溶液10l，继续培养4 h，2000 rpm、10 min离心，加二甲基亚砜每孔150l，充分震荡，使细胞溶解，酶标仪（bio-rad550）测定570 nm至630 nm波长光密度（a值）。每组3复孔，同时设不加药的阴性对照组和调零孔。测定每孔的光吸收值，计算细胞增殖抑制率、ic50及耐药逆转倍数。2.2.4半定量rt-pcr检测mdr-1、topo基因mrna表达收集50g/ml黄芪苷、100 g/ml京尼平苷及相应对照组作用不同时段的k562/adm细胞（1107），pbs洗3次，trizol法提取总mrna，1.5%琼脂糖凝胶电泳测定rna的浓度及质量。用mmlv逆转录酶逆转录cdna，然后pcr扩增各组细胞cdna的mdr-1、topo及caspase-3基因，并同时扩增相同cdna的-actin 作为内参照。pcr扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，以dl2000为marker，geldos1000凝胶图像分析仪分析扫描各条带，以-actin基因作为内参照，测定各组目的基因光密度相对表达量。2.2.5统计学处理方法每组实验重复三次，采用spss统计软件分析，所有数据以s表示，百分率比较用2检验，组间比较用方差分析，所有数据均用spss13.0统计软件分析。3.实验结果3.1adm对k562细胞及k562/adm细胞增殖抑制作用的影响 mtt实验显示，不同浓度adm对k562细胞及k562/adm细胞作用于72h后，k562细胞增殖抑制率较k562/adm细胞高，本实验选用的k562/adm细胞为稳定的耐药细胞株。具体数值见表1。表1：不同浓度adm（72h）作用于k562、k562/adm细胞后的增殖抑制率(%)药物浓度（g/ml） 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6k562 80.463.12 78.152.36 77.123.15 76.093.27 77.633.43k562/adm 15.723.27* 28.52.23* 31.943.82* 16.462.75* 24.082.15*注：k562/adm与k562比较，*，p0.053.2 黄芩苷对k562/adm细胞增殖抑制的影响体外作用48 h后，0.2 g/ml adm对应的未加中药单体组和黄芩苷组的增殖抑制率分别是（6.611.8）%和（48.352.26）%。而0.4 g/ml adm对应的未加中药单体组和黄芩苷组的增殖抑制率分别是（15.242.86）%和（44.21.93）%。（图2）图2 经黄芩苷处理后adm对k562/adm细胞生长增殖抑制的影响（mtt法）注：由上图可以看出，经黄芩苷处理后，adm对细胞的增殖抑制率较未处理明显提高。3.3京尼平苷对k562/adm细胞增殖抑制的影响 体外作用48 h后，0.2 g/ml adm对应的未加中药单体组、京尼平苷组的增殖抑制率分别是（6.611.8）%和（41.681.31）%。而0.4 g/ml adm对应的未加中药单体组、京尼平苷组的增殖抑制率分别是（15.242.86）%和（452.36）%。（图3）图3经京尼平苷处理后adm对k562/adm细胞生长增殖抑制的影响(mtt法)注：由上图可以看出，经京尼平苷处理后，adm对细胞的增殖抑制率较未处理明显提高。3.4黄芩苷、京尼平苷作用后k562/adm细胞中mdr-1、topo及caspase-3基因表达的变化以-actin基因作内参照，半定量分析pcr扩增产物光密度相对表达量显示，未经中药处理的细胞均表达mdr-1、topo及caspase-3基因，如图5-10所示。图5 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内mdr-1基因表达变化量电泳图，m为marker（dl2000）m 阴性对照 黄芩苷组 京尼平苷组m 阴性对照 黄芩苷组 京尼平苷组-actinmdr-1（157bp）图6 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内mdr-1基因表达变化量电泳图的半定量柱状图，m为marker（dl2000）；图7 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内topo基因表达变化量电泳图，m为marker（dl2000）-actintopo （322bp)m 阴性对照 黄芩苷组 京尼平苷组图8 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内topo基因表达变化量电泳图的半定量柱状图，m为marker（dl2000）图9 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内caspase-3基因表达变化量电泳图，m为marker（dl2000）-actincaspase-3(296bp)m 阴性对照 黄芩苷组 京尼平苷组图10 50 g/ml黄芩苷、100 g/ml京尼平苷共孵育72h后k562/adm细胞内caspase-3基因表达变化量电泳图的半定量柱状图，m为marker（dl2000）4.讨论肿瘤细胞产生多药耐药的途径包括多个方面：肿瘤细胞多次接触化疗药物后，诱导肿瘤细胞的膜结构发生改变；诱导肿瘤细胞的耐药基因过度表达；诱导药物代谢酶的活性增加，肿瘤细胞还可以通过改变靶作用部位，加强dna修复等途径逃避药物的杀伤作用【1】。许多耐药逆转剂为钙拮抗剂，因其毒副作用大、靶点单一、生物制剂在体内不稳定、半衰期短【10】等问题，还不能大量运用于临床，然而这却增加了中医药临床应用的可能性及必要性。现代研究表明, 中药逆转白血病mdr 已取得不少的成绩。从单味药到中药复方以及联合用药均收到了明显疗效，在临床上逐渐被人们所重视。如，补骨脂素、汉防己甲素、姜黄素、鸦胆子油、白花蛇舌草注射液、六神丸等，能不同程度地干预及逆转肿瘤细胞的多药耐药性【11-16】。本实验采用人慢性粒细胞白血病红白血病细胞株k562，以持续加入adm刺激mdr/p-gp的高表达，建立肿瘤细胞多药耐药模型。由实验结果可知，黄连解毒汤中所含的主要黄酮成分黄芩苷、京尼平苷对k562/adm耐药肿瘤细胞的增值有明显抑制作用，且呈一定的剂量依赖性。黄芩苷和京尼平苷对k562/adm细胞细胞内mdr-1基因表达呈明显抑制作用，并使topo基因表达逐渐降低,caspase-3基因表达逐渐增强。提示：黄连解毒汤逆转k562/adm细胞多药耐药的作用可能是通过改变mdr-1、 topo、caspase-3等因子的表达有关。人类基因组中存在两个mdr基因，即mdrl和mdr2基因。研究表明，只有mdrl基因的表达水平与人体肿瘤细胞耐药有关【8】。mdr-1介导p-gp的表达。p-糖蛋白的表达能将疏水亲脂性的药物泵出细胞外，使药物在细胞内的蓄积减少，产生耐药的作用【9】。topo在基因复制、转录、修复及重组中发挥重要作用。topo介导的耐药机制为：耐药细胞相关基因的改变，直接影响topo与atp或dna的结合；dna拓扑异构酶含量或活性改变，使药物通过topo介导的抗肿瘤作用降低；dna拓扑异构酶调控因素的变化，包括：topo基因调控异常，topomrna水平下降，导致酶量、活性降低；topo肿瘤抑制药致topo突变；topo同功酶的改变和磷酸化修饰，干扰药物、酶和dna三者之间的作用关系。肿瘤细胞内topo表达增强下降使肿瘤对抗肿瘤药物敏感性下降，可引起肿瘤细胞的耐药【17】。caspase是与细胞因子的成熟和细胞凋亡有关的酶家族，其耐药机制与caspase基因的表达受抑制有关。近来研究表明，许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用的。细胞接受凋亡信号后,线粒体内膜发生改变,使内膜离子通道梯度丧失,线粒体内膜电位丧失,线粒体蛋白释放入胞质而激活caspase-3,产生氧自由基,线粒体钙离子向胞质外流,进而导致凋亡的发生【18】。该实验结果在一定程度上揭示了黄芩苷、京尼平苷的作用机制，并为深入研究逆转mdr的药物及临床中西医结合治疗白血病提供了实验依据。参考文献1梁兴杰，赵宇亮. 新型纳米药物克服肿瘤化疗抗药性j.中国基础科学，2010，05：18-22.2孙付军，宋卫国，李贵海，等.黄连解毒汤70%醇提物对mdr模型小鼠s180肿瘤细胞凋亡因子表达的影响j.中华中医药杂志，2010，25（4）：610-612.3刘明霞，孙付军，王春芳，等.黄连解毒汤70%醇提物对mdr模型小鼠细胞凋亡及相关因子表达的影响j中药材，2009，32（8）：1270-1272.4李贵海，孙付军，陈锋，等.黄连解毒汤醇提物预防给药对mdr模型小鼠相关基因表达产物的影响j.中国中药杂志，2007，32（18）：1906-1908.5李贵海，孙付军，董学，等.黄连解毒汤70%醇提物对小鼠s180细胞mdr相关因子表达的逆转作用j.2007，38（7）：1050-1052.6洪筱坤，王凌，王智华.黄连解毒汤中生物碱的多组分分析研究j.上海中医药大学学报，1999