毕业设计（论文）-虎皮兰总黄酮的抑菌活性研究.doc

吉 林 农 业 大 学 学 士 学 位 论 文 题目名称：_虎皮兰总黄酮的抑菌活性研究_ 学生姓名： 院 系：生命科学学院 专业年级：2011级制药工程 指导教师： 职 称： 教授 2015年5月20日 目 录题目i摘要及关键词i1 前 言11.1虎皮兰的研究现状11.1.1虎皮兰中的营养成分11.1.1.1氨基酸类11.1.1.2糖类物质11.1.1.3甾体皂苷11.1.2虎皮兰的药理作用21.1.2.1消炎、镇痛21.1.2.2抗过敏21.2黄酮的研究现状21.2.1 黄酮的药用价值21.2.2 抗氧化作用21.3 研究目的及意义32 材料与方法32.1 实验材料与仪器32.1.1 材料32.1.2 试剂32.1.3 仪器32.2 实验方法32.2.1虎皮兰中粗黄酮提取液的制备32.2.2培养基的制备32.2.3细菌的活化及菌悬液制备42.2.4含菌平板制备42.2.5滤纸片法42.2.6虎皮兰总黄酮最低抑菌浓度（mic）的测定43 结果与分析43.1虎皮兰中黄酮的抑菌效果43.1.1抑菌圈的确定43.1.2 最小抑菌浓度（mic）的测定64 讨论65 结论7参考文献7致 谢10 虎皮兰中黄酮的抑菌活性的研究姓 名：王宝翔专 业：制药工程指导教师：李泽鸿摘要：本文以虎皮兰中提取的黄酮为研究对象，进行了虎皮兰中黄酮抑菌的实验研究。试验结果表明虎皮兰中提取的粗黄酮对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有一定抑制作用。其中对沙门氏菌、大肠杆菌抑制效果最好，对枯草芽孢杆菌抑制效果次之，对金黄色葡萄球菌抑菌效果不甚明显。抑菌圈分别达到16.1mm、17.7mm、14.5m m、9.0mm。关键词：虎皮兰；黄酮；提取工艺slndied on antifungal activity of total flavonoids tiger piran name：wang baoxiang major：pharmaceutical engineering tutor：li ze hongabstract: in this paper tiger piran total flavonoids for the study, conducted the experimental study of total flavonoids antibacterial tiger piran. the results showed that crude flavonoids tiger piran e. coli, salmonella, staphylococcus aureus, bacillus subtilis certain extent. which for salmonella, e. coli best inhibitory effect on bacillus subtilis inhibitory effect, followed by staphylococcus aureus antibacterial effect is not obvious. inhibition zone reached 16.1mm, 17.7mm, 14.5mm, 9.0mm.keywords: sansevieria trifasciata; flavonoids; extraction process1 前 言虎尾兰（sansevieria trifasciata）又称虎皮兰，百合科，虎尾兰属。原产非洲西部1，适应环境能力强，叶纤维强韧，可用于编织2-4。目前在我国各地均有种植，可作为室内观叶植物进行盆栽，因其能够很好的吸收室内甲醛，可以净化空气，被人们称为“天然的清道夫”5。在中国的种植品种主要是长有淡黄色金边的金边虎尾兰s.trifasciata prain var. laurentii (de wildem.) n. e. brown 和柱叶虎尾兰 s. canaliculata carr。虎尾兰中的色素是一种性能较好的色素，是一种极具开发前景的天然色素资源6。此外，虎皮兰中所含多种人体必需的微量元素，vc含量较高，所含重金属元素的量远低于我国食品重金属残留限量国家标准7。而在药理作用方面，虎皮兰可治疗咳嗽、哮喘、润脾肺8。1.1虎皮兰的研究现状1.1.1虎皮兰中的营养成分张璐9对虎尾兰中不同的微量元素以及四种重金属元素进行了含量测定，其常量元素含量的检测结果为：钙172.85mg.g-1，镁42.87mg.g-1，钾0.1212mg.g-1，钠0.0687mg.g-1；微量元素的测定结果为：铁0.1066mg.g-1，锰0.0770mg.g-1，铜0.0073mg.g-1，锌0.0040mg.g-1。1.1.1.1氨基酸类虎尾兰中氨基酸的检测结果为：虎尾兰中氨基酸种类齐全，全部氨基酸的总体质量分数可高到6.386，其中含有的人体必需氨基酸平均质量分数为2.384，另外有报道虎尾兰中维生素c的含量为0.4780mg/100g。虎皮兰中所含氨基酸含量丰富且种类齐全7。1.1.1.2糖类物质虎尾兰中含有大量的多糖，含量高达29.1%，张帆在对其多糖的研究中分出了tps-h、tps-a、tps-b、tps-c四个组分8。1.1.1.3甾体皂苷甾体皂苷是一种天然有机化合物在自然界中分布很广10，很多的报道中都指出在虎尾兰属的植物中含有大量的皂苷类化合物11-13。虎尾兰作为典型虎尾兰属植物也含有大量皂苷。张璐通过超声波法摸索出提取虎皮兰中总皂苷的最佳条件9。yoshihiro mimaki等人通过甲醛提出虎尾兰粗提物，利用气相色谱-质谱、核磁共振结合的方法从虎尾兰中分离出12种甾体皂苷、10种新成分14。1.1.2虎皮兰的药理作用1.1.2.1消炎、镇痛早在09年，anbu jeba sunilson j等人15通过建立两种模型（1、小鼠前爪注射福尔马林2、给小鼠背部注射啤酒酵母悬液）来研究虎尾兰乙醇提取物对小鼠抗疼痛的影响，实验结果表明虎尾兰乙醇粗提液可以作用于小鼠的外周神经和中枢神经，延长小鼠的痛阈值，具有镇痛作用，尤其受到福尔马林刺激的实验鼠表现出的镇痛效果更好。jimuty roy等人16采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法观察其抗炎作用，发现虎皮兰乙醇提取物能抑制由二甲苯所致的炎症反应，抑制小鼠耳朵肿胀，具有消炎作用。此后研究人员还发现虎尾兰的水提物也具有消炎的功效17-18。1.1.2.2抗过敏在印度虎皮兰的叶子和根茎被民间用于治疗支气管疾病、咳嗽、哮喘、蛇毒和昆虫叮咬等。通过构建小鼠模型对虎皮兰乙醇提取物进行研究，发现提取液可以抑制牛奶引起的嗜酸性粒细胞和白细胞增多，其作用原理可能在于虎皮兰醇提液中含有黄酮类化合物抑制肥大细胞释放炎症介质。1.2黄酮的研究现状黄酮及其化合物已经成为人体必需的营养素之一。黄酮类化合物在植物的活性成分中所占比例较大，五分之一的药用植物中含有较高的黄酮类物质，药用价值及营养价值显著。近些年来，人们对黄酮的探究越来越深，发现其药理作用广泛。而一些黄酮类化合物已运用到生产中，如从豆科类植物中分离出的大豆异黄酮成分对降低胆固醇，降低心血管疾病的发病率，美国食品与药物管理局于1999年已将其推荐健康食品19。还有如儿茶素类因其对脂肪肝，肝脏解毒等具有显著疗效，在欧洲应用广泛20。1.2.1 黄酮的药用价值由于黄酮可在植物中大量提取，且无毒，因此近几年中，研究人员开始分离提取大量的新型生物类黄酮，并不断研究其生物活性，使黄酮的应用范围越来越广泛，不仅仅局限在食品领域，还在临床医药领域广泛应用。1.2.2 抗氧化作用黄酮类物质的显著性质之一就是具有清除自由基的作用，研究表明，其能够较好的清除抗氧化自由基，阻断自由基链反应，可以起到预防和断链的双重作用，所以黄酮是优良的天然抗氧化剂21。1.3 研究目的及意义本试验旨在研究虎皮兰中总黄酮的提取及其抑菌活性研究。 在查阅大量文献的基础上发现虎皮兰繁殖率高、生命力强、资源丰富。而且有报道虎皮兰中含有丰富的皂苷类、多糖类化合物，并已经证明其具有相应的特异性细胞活性，但未见任何对于虎皮兰中黄酮功效的研究的报道。因此，以虎皮兰为原料对虎皮兰中总黄酮提取工艺及抑菌活性进行了系统研究。为深入研究其药用价值提供了良好的理论基础及参考价值，为虎皮兰资源的开发利用提供坚实的理论依据。2 材料与方法2.1 实验材料与仪器 2.1.1 材料虎皮兰（阴干、粉碎过筛）、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（以上菌种皆由吉林农业大学生命科学学院提供）2.1.2 试剂蒸馏水；无水乙醇；石油醚;乙酸乙酯。以上均为分析纯试剂。牛肉膏、蛋白胨、琼脂、nacl、1mol/l naoh, 1mol/l hcl2.1.3 仪器 粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；电子天平；kq-3200e超声波发生器（昆山市超声波仪器有限公司）； re-52a旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)； t6新世纪分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；恒温培养箱（bpx-82电热恒温培养箱）；电炉（北京科伟永鑫设备仪器，电子可调电炉）；冰箱（容声冰箱bcd-198e）；工作台（dl-cj-1nd超净工作台）；摇床（hzq-d卧式空气恒温振荡器）；ldzx-50kb高压灭菌器（上海申安）；烘箱（dhg-9241型电热恒温干燥箱）；漏斗；分液漏斗；无菌培养皿；无菌试管；灭菌的1ml枪头；玻璃涂棒；滤纸；镊子；三角瓶(250ml)；大烧杯（1000ml）；ph试纸。2.2 实验方法2.2.1虎皮兰中粗黄酮提取液的制备电子天平精确称取10g虎皮兰粉末，浸泡12h，在乙醇浓度60%、液料比25:1、温度80下，超声34min后，抽滤得滤液，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，备用。精密量取0.15g上述提取物，充分溶于10ml蒸馏水中，配成浓度为15mg/ml的虎皮兰粗黄酮提取备用液，使用0.45m微孔滤膜过滤除渣，置于4冰箱保存。2.2.2培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基：蒸馏水1000ml、nacl 5g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂1520g 、ph 7.07.2 ，121灭菌20min。肉汤液体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、nacl 0.5g、蒸馏水100ml、ph 7.07.2 ,分装与三角瓶中，121灭菌20min。2.2.3细菌的活化及菌悬液制备用100ml锥形瓶配制25ml的肉汤液体培养基，在121高压灭菌20min.烘干后冷却至室温，备用。取在-20下保存的大肠杆菌、球菌，在超净台中，点燃的酒精灯附近进行，用接种环蘸取大肠杆菌菌液接种，上述配好的液体培养基中，经摇匀后的菌体悬浮液，使得菌悬液中细菌数介于1x1071x108 ,按以上方法配置枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌悬液。2.2.4含菌平板制备在已灭菌的无菌操作台中，将灭菌的培养基到入灭菌培养皿中，琼脂的厚度盖过板面少许即可，待完全冷却凝固后，用移液枪吸取100l菌悬液，注入培养皿内，用涂布棒迅速均匀涂布，为含菌平板。2.2.5滤纸片法将滤纸片打成统一大小圆片，直径6mm，高压灭菌20min，分别浸泡在15mg/ml的虎皮兰提取液中2h，取出吹干水分，紫外灭菌，备用。在无菌操作台中，将含有虎皮兰黄酮的滤纸片贴放在含菌的培养皿中，在37培养箱中培养16h，测量抑菌圈的大小，判断虎皮兰粗黄酮的抑菌情况。同时将浸泡过蒸馏水、晾干的灭菌滤纸片作对照。2.2.6虎皮兰总黄酮最低抑菌浓度（mic）的测定采用试管法22 取36支已经灭菌的试管分成4组，每组9支并标号。用移液枪吸取1ml肉汤液体培养基于每支灭菌试管内，另外分别吸取1ml待测定的样品于每组的第一支试管内，吹匀，使待测样品液于液体培养基混匀，再从每组的第1管中吸取1ml混匀液到该组对应的第二管中，按照上述方法，依次到第8管，再从第8管中吸取1ml混匀液舍弃，第九组设为细菌对照组，不加待测样品液。4组试管分别加入大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌各50l。再取9支已灭菌的试管，稀释的方法同上，但不加菌液，作为药液对照组。将上述所以试管放置在37摇床中震荡培养24h，观察最终结果。3 结果与分析3.1虎皮兰中黄酮的抑菌效果3.1.1抑菌圈的确定由图1可以看出，虎皮兰中粗黄酮浓度为15mg/ml时对四种细菌均有一定抑制作用，其中对沙门氏菌和大肠杆菌抑制作用尤为明显。如表2所示，虎皮兰总黄酮对金黄色葡萄球菌低度敏感，对枯草芽孢杆菌中等敏感，对大肠杆菌和沙门氏菌高度敏感。表2虎皮兰中黄酮滤纸片抑菌圈直径(mm)tab.3-7 the sansevieria trifasciata flavonids bacteriostatic circle diameter of filter空白平行试验（1）平行试验（2）大肠杆菌6.0mm16.0mm16.2mm沙门氏菌6.0mm18.0mm17.4mm金黄色葡萄球菌6.0mm9.0mm9.0mm枯草芽孢杆菌6.0mm14.0mm15.0mm注：抑菌圈直径小于12mm为低度敏感；抑菌圈1216为中等敏感；抑菌圈直径1620mm为高度敏感；抑菌圈直径大于20mm为极敏感23。 a枯草芽孢杆菌24h b 大肠杆菌24hc金黄色葡萄球菌24h d沙门氏菌24h 图1虎皮兰黄酮提取液抑菌圈fig. 3.23bacteriostatic ring of sansevieria trifasciata total flavonids3.1.2 最小抑菌浓度（mic）的测定由表3我们可以看出，大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的mic均为3.75mg/ml，而金黄色葡萄球菌的mic较高为7.5mg/ml。这与上面抑菌圈的抑菌效果比较接近，这一结果和文献24中所提到的有关抑菌效果的研究基本一致，黄酮的种类以及其所含取代基团的差异都会影响黄酮类化合物的抑菌活性。表3 虎皮兰总黄酮提取液的mict管号稀释倍数大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌11:221:4+31:8+41:16+51:32+61:64+71:128+81:256+9-+对照组mic/mgml-13.753.757.53.75ab. 3-8 the mic of sansevieria trifasciata total flavonids extracts注：最低抑菌浓度判定标准：依据参考文献，观察细菌对照组菌出现浑浊状，而药物对照组不长菌即成透明状的前提下，去观察实验组试管的浑浊度，来判断不同浓度的虎皮兰提取液的抑菌作用。如果试管内稍微浑浊有少数的菌落生长，用“+”表示，如果试管中相对浑浊有稍多菌落生长，用“+”表示，如果试管中完全浑浊，菌落长势良好，用“+”表示25。4 讨论试验对虎皮兰中黄酮的粗提取液进行抑菌试验，由于虎皮兰中的黄酮溶解性较小，尤其溶化后的组分溶解性更小，因此采用粗品做抑菌试验。实验结果显示，虎皮兰黄酮对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较好的抑制作用。其中对沙门氏菌、大肠杆菌抑制效果最好，对枯草芽孢杆菌抑制效果次之，对金黄色葡萄球菌抑菌效果不甚明显。主要原可能是因为菌活性不一，菌的生长机理不同，因此黄酮抑菌效果不同26,27。还可能是因为粗黄酮成分过于复杂，不同成分之间相互作用，导致对细菌正常的生物膜结构的破坏程度不同，从而影响其整体的抑菌效果28。本试验未检测虎皮兰黄酮对真菌的抑制效果，因此，会在以后的进一步活性实验中要从更深入的方面进行研究。5 结论虎皮兰黄酮的粗提物的抑菌研究试验表明虎皮兰粗黄酮对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有一定抑制作用。抑菌圈分别达到16.1mm、17.7mm、9.0mm、14.5mm。参考文献1 中国植物志编委会. 中国植物志1280卷m. 北京: 科学出版社, 1961-2004.2 v.s.sreenivasan, s.somasundaram, d. ravindran, et al. microstructural, physico-chemical and mechanical characterisation of sansevieria cylindrical fibres-an exploratory investigationj. materials and design, 2011, (32): 453-461. 3 v.s.sreenivasan, d. ravindran, v.manikandan, et al. influence of fibre treatments on mechanical properties of short sansevieria cylindrical polyester compositesj. materials and design, 2012, (37):111-121.4 k. ramanaiah, a.v. ratna prasad, k. hema chandra reddy. mechanical thermophysical and fire properties of 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