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第四章 dna的合成 原核细胞含一个染色体，真核细胞含多个染色体，细胞 分裂前， 原核细胞含一个染色体，真核细胞含多个染色体，细胞 分裂前，dna会发生复制（会发生复制（dna replication）。复制完毕则 细胞分裂。 ）。复制完毕则 细胞分裂。 dnadna合成合成合成合成复制复制复制复制 染色体外的遗传因 子，如细菌质 粒，、细胞器的 染色体外的遗传因 子，如细菌质 粒，、细胞器的 dna。有的受染色 体控制，而与染色 体 。有的受染色 体控制，而与染色 体dna同步复制， 有的不受控制则在 细胞周期的任何时 期都可复制。 同步复制， 有的不受控制则在 细胞周期的任何时 期都可复制。 细菌染细菌染细菌染细菌染 色体色体色体色体 质粒质粒质粒质粒 病毒侵入细胞后即能复制。若整合到染色体中，则 作为染色体的一部分而被复制。 病毒侵入细胞后即能复制。若整合到染色体中，则 作为染色体的一部分而被复制。 病毒dna 一、一、dna复制的概述复制的概述 复制（复制（replication）：以亲代dna分子为模板指导合成相同的子代dna 分子的过程 以亲代dna分子为模板指导合成相同的子代dna 分子的过程。 1. dna复制的方式复制的方式半保留复制（半保留复制（semiconservative replication） dna复制方式有三种可能性，即全保留、半保留和分散式。复制方式有三种可能性，即全保留、半保留和分散式。 亲代： 子代： 亲代： 子代： 全保留全保留半保留半保留分散式分散式 （1）meselson等的氮同位素试验（1）meselson等的氮同位素试验证明了dna复制为半保留复制机理证明了dna复制为半保留复制机理 第一节dna的复制 15n/ 15n 用含用含 15n氯 化铵连 续培养 许多代 氯 化铵连 续培养 许多代 半保留复制试验半保留复制试验 14n/ 15n 用含用含14n培养 基培养 培养 基培养1代代14n/ 14n 14n/ 15n 用含用含14n培养 基培养 培养 基培养1代代 （2）cairns(1963 )放射自显影法放射自显影法 用带用带3h的的t 标记标记e.coli dna。用溶菌酶去掉细胞壁，释放出完整的。用溶菌酶去掉细胞壁，释放出完整的 dna铺在透析胶上，盖上感光胶片，若干星期后铺在透析胶上，盖上感光胶片，若干星期后3h处则被处则被-射线感光， 显影后，就勾划出 射线感光， 显影后，就勾划出dna分子形状在光学显微镜下可观察分子形状在光学显微镜下可观察 c非复制部分，感光少，一半有 放射性，一半没有放射性。 非复制部分，感光少，一半有 放射性，一半没有放射性。 a、b为复制后的双链。为复制后的双链。 b与与c感光相同。感光相同。 a为为b感光的二倍两股链都有放射性感光的二倍两股链都有放射性 2. 复制的过程复制的过程 （1）顺序性顺序性指指dna复制时是先局部解开两条 链，再复制且边解链边复制。 复制时是先局部解开两条 链，再复制且边解链边复制。 （2）复制的起始位点复制的起始位点 原点（原点（origin）局部双链解开，形成复制眼 （ ）局部双链解开，形成复制眼 （replication eye）。）。 复制 起点 复制 起点 双向复制双向复制，即形成两个复制叉。如，即形成两个复制叉。如e.colidna等。等。 （3）复制方向复制方向 单向复制单向复制，即只形成一个复制叉（，即只形成一个复制叉（replication fork） （4）双向复制的对称性双向复制的对称性对称复制：两个复制叉移 动速度相同。这样对于环形 对称复制：两个复制叉移 动速度相同。这样对于环形dna来说，其终点在原 点 来说，其终点在原 点180处，如处，如e.coli。 起点起点 终点终点 不对称复制：两个复制叉移动速度不同。如枯草 杆菌染色体 不对称复制：两个复制叉移动速度不同。如枯草 杆菌染色体dna，一个复制叉移动，一个复制叉移动1/5，一个移动，一个移动 4/5。 起点起点 终点终点 半不连续复制半不连续复制 先导链、后随链、冈崎片段先导链、后随链、冈崎片段先导链、后随链、冈崎片段先导链、后随链、冈崎片段 冈崎片段冈崎片段：冈崎（：冈崎（okazaki）用）用 3h-t 标记噬菌体感染的标记噬菌体感染的e.coli，然后短时间内分 离 ，然后短时间内分 离dna，则得到，则得到1000个碱基左右的片段， 真核生物则为 个碱基左右的片段， 真核生物则为100-200个核苷酸片段，称为 冈崎片段。 个核苷酸片段，称为 冈崎片段。 结果：半不连续复制结果：半不连续复制 （6）复制子复制子（replicon）从一个原点起始复制 所能复制的 ）从一个原点起始复制 所能复制的dna 原核细胞原核细胞只有一个原点，即只有一个复制子。只有一个原点，即只有一个复制子。 e.coli复制一次需复制一次需40min。 问题问题：真核生物：真核生物dna比比e.coli的的dna大的多复制叉移动速度 慢 大的多复制叉移动速度 慢10倍（复制叉速度：倍（复制叉速度：e.coli 5000/min，真核，真核 10003000/min）。据此计算，真核细胞）。据此计算，真核细胞dna复制需用几个 星期，实际上只需用 复制需用几个 星期，实际上只需用68h。 真核细胞真核细胞dna有多个原点。整个分子分为多个复制子，每个 长度 有多个原点。整个分子分为多个复制子，每个 长度100 200bp ，且都为双向复制。，且都为双向复制。 1.大肠杆菌大肠杆菌dna聚合酶聚合酶 （1）种类与反应特点：）种类与反应特点：dna聚合酶聚合酶 i、ii、iii、共五种。、共五种。 iiiiii 亚基数亚基数1410 m.w103 00088 000830 000 聚合作用聚合作用 连续聚合作用连续聚合作用小小较小较小很大很大 聚合速度聚合速度(n/s)1620402501000 53 外切酶外切酶 35 外切酶外切酶 功能功能 复制中去除引 物填补缺口 参与损伤修复 复制中去除引 物填补缺口 参与损伤修复 可能参与损 伤修复 可能参与损 伤修复 dna复制的主要酶复制的主要酶 二、大肠杆菌dna的复制 （一）参与复制的酶和因子 二、大肠杆菌dna的复制 （一）参与复制的酶和因子 dna聚合酶、是修复酶，存在与聚合酶、是修复酶，存在与sos修复系统修复系统 dna聚合酶催化反应的要点：dna聚合酶催化反应的要点： 底物：底物：四种四种dntp（datp、dgtp、dctp、dttp） 聚合方式：新核苷酸加载合成链的聚合方式：新核苷酸加载合成链的3端，端，即即合成方向 为 合成方向 为5 3。 条件：条件：必须必须有引物有引物存在。存在。 能量：来源于能量：来源于dntp形成链中的形成链中的dnmp时释放的能量时释放的能量 dntp + 核苷酸链核苷酸链n ppi +核苷酸链核苷酸链n+1 dna聚合酶聚合酶 ppi + h2o 2pi 焦磷酸酶焦磷酸酶 dna聚合酶催化机理 机制机制 （2）dna聚合酶iii dna聚合酶dna聚合酶 的三维结构的三维结构 palm 手掌域的功能手掌域的功能 a.两个催化位点，一个掺入正确的dntp,另一 个去除错误的dntp a.两个催化位点，一个掺入正确的dntp,另一 个去除错误的dntp b.聚合部位功能：含两个金属离子，促进催化 反应；通过与新和成的dna的双螺旋小沟形成 多个氢键，检查新掺入的核苷酸碱基配对的正 确性 b.聚合部位功能：含两个金属离子，促进催化 反应；通过与新和成的dna的双螺旋小沟形成 多个氢键，检查新掺入的核苷酸碱基配对的正 确性 c.外切核酸酶活性和校对功能位点c.外切核酸酶活性和校对功能位点 只有一个催化中心，依靠酶与底物结合的立体特只有一个催化中心，依靠酶与底物结合的立体特 异性对错误碱基识别 ：异性对错误碱基识别 ： a.错误的错误的dntp b.错误的ntp 手指域功能手指域功能 a.引入引入dntp，并将正确的，并将正确的dntp送到催 化部位。 送到催 化部位。 b.弯曲模板，以利于模板的碱基与结合 的核苷酸形成氢键。 弯曲模板，以利于模板的碱基与结合 的核苷酸形成氢键。 c.稳定焦磷酸稳定焦磷酸 拇指域功能拇指域功能 与合成的与合成的dna相互作用，以维持引物和 活性部位的正确位置，维持聚合酶与其 底物的强有力作用。 相互作用，以维持引物和 活性部位的正确位置，维持聚合酶与其 底物的强有力作用。 dna聚合酶的校对作用dna聚合酶的校对作用 错误配对的形成：碱基 互变异构为异构体是就 可能形成错误配对（ 错 误率 错误配对的形成：碱基 互变异构为异构体是就 可能形成错误配对（ 错 误率10-5）。）。 错误配对可以通过聚合 酶的外切酶活性去除 错误配对可以通过聚合 酶的外切酶活性去除 dna聚合酶聚合酶iii组份及其结合方式：组份及其结合方式： 全酶全酶mw 亚基数功能亚基数功能 132000 2 53聚合聚合 27000 2 35外切、校对外切、校对 10000 2 组建核心酶组建核心酶 71000 2 核心酶二聚化核心酶二聚化 52000 2 atp 酶，形成 复合物酶，形成 复合物 35000 1 与亚基结合，形成 复合物与亚基结合，形成 复合物 33000 1 形成 复合物形成 复合物 15000 1 形成 复合物形成 复合物 12000 1 形成 复合物形成 复合物 37000 4 两个亚基形成滑动夹子两个亚基形成滑动夹子 组成核心酶组成核心酶组成核心酶组成核心酶 夹子装置器夹子装置器夹子装置器夹子装置器 夹子的结构与作用夹子的结构与作用夹子的结构与作用夹子的结构与作用 夹子的作用夹子的作用： 包围结合新合成的双链包围结合新合成的双链dna以及结合有 引物 以及结合有 引物-模板的聚合酶模板的聚合酶 保证聚合酶极快地重新结合于引物保证聚合酶极快地重新结合于引物-模板 结合部位 模板 结合部位 增加聚合酶聚合反应的持续性增加聚合酶聚合反应的持续性(5000nt) 夹子装置器：夹子装置器： 组成：多种蛋白的复合体组成：多种蛋白的复合体 作用：打开夹子，包围作用：打开夹子，包围dna，把包围的，把包围的dna 送到核心酶送到核心酶 夹子装置器 2. 引发酶 （ 引发酶 （primase） 又称为又称为dnag 功能：可以从无到有 地以 功能：可以从无到有 地以dna为模板， 催化合成 为模板， 催化合成一小段与一小段与 dna互补的互补的rna即 引物 即 引物 引物：引物：1060个核 苷酸 个核 苷酸 引物酶本身无活性，只有与另外引物酶本身无活性，只有与另外6种蛋白质结合为种蛋白质结合为引发体 （ 引发体 （primosome）才可催化引物的合成。才可催化引物的合成。 c c b b n n n dna i n n n dna c b i 引发 酶 引发 酶 n n n dna c b i 引发 酶 引发 酶 引发体可沿引发体可沿dna链链53移动到一定位置即可合成引物。移 动和引发由 移动到一定位置即可合成引物。移 动和引发由atp供能供能n有有atp酶活力。酶活力。dnab可识别与可识别与dna 结合的起始位置。结合的起始位置。 引发前体引发前体 引发体引发体 引物体蛋白引物体蛋白mw亚基数亚基数功能功能 引发酶引发酶600001合成引物合成引物 dnab3000006可移动的启动因子、可移动的启动因子、atpase dnac*250001预引发预引发 n预引发预引发 natpase、识别起点、识别起点 n 110001预引发预引发 i参与引物合成参与引物合成 * 引发体中含6个dnac 引发体蛋白性质与功能 3. 3. dnadna连接酶连接酶连接酶连接酶 （ligaseligase） 功能功能功能功能：将复制过程中形成的将复制过程中形成的将复制过程中形成的将复制过程中形成的 dnadna片段用片段用片段用片段用3 3 5 5磷酸二酯键连接起来。磷酸二酯键连接起来。磷酸二酯键连接起来。磷酸二酯键连接起来。 5 3 53 repii 4. dna解螺旋酶解螺旋酶(helicase)（解链酶） 功能： （解链酶） 功能：dna的双螺旋解链，解开一 对碱基，需两分子 的双螺旋解链，解开一 对碱基，需两分子atp， 作用点： ， 作用点：dna上局部单链处，向双 链方向解链。 种类： 上局部单链处，向双 链方向解链。 种类：e.coli有四种解螺旋酶，有四种解螺旋酶，i、 ii、iii和和rep蛋白。蛋白。 i、ii、iii中任一 种沿模板 中任一 种沿模板5-3 方向移动，方向移动，rep蛋白沿 模板 蛋白沿 模板3 -5方向移动。方向移动。 4. dna解螺旋酶解螺旋酶(helicase)（解链酶） 功能： （解链酶） 功能：dna的双螺旋解链，解开一 对碱基，需两分子 的双螺旋解链，解开一 对碱基，需两分子atp， 作用点：作用点：dna上局部单链处，向双 链方向解链。 上局部单链处，向双 链方向解链。 种类：种类：e.coli有四种解螺旋酶，有四种解螺旋酶，i、 ii、iii和和rep蛋白。蛋白。 i、ii、iii中任一 种沿模板 中任一 种沿模板5-3 方向移动，方向移动，rep蛋白沿 模板 蛋白沿 模板3 -5方向移动。方向移动。 mw：74000，四聚体 可与由解链酶解开的单链 结合 功能：防止单链再次形成 双链，防止核酸酶水解多核 苷酸链，保护 ，四聚体 可与由解链酶解开的单链 结合 功能：防止单链再次形成 双链，防止核酸酶水解多核 苷酸链，保护dna。 原核 。 原核ssb对单链对单链dna结 合有高度协同性真核 结 合有高度协同性真核ssb无协 同性，可能机制不同。 可以重复使用。 无协 同性，可能机制不同。 可以重复使用。 mw：74000，四聚体 可与由解链酶解开的单链 结合 ，四聚体 可与由解链酶解开的单链 结合 功能功能：防止单链再次形成 双链，防止核酸酶水解多核 苷酸链，保护 防止单链再次形成 双链，防止核酸酶水解多核 苷酸链，保护dna。 原核原核ssb对单链对单链dna结 合有高度协同性真核 结 合有高度协同性真核ssb无协 同性，可能机制不同。 可以 无协 同性，可能机制不同。 可以重复使用重复使用。 5 3 5 53 5. 单链结合蛋白单链结合蛋白（single strand binding protein ssb） 6. dna拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase） 解链 双螺旋存 在张力 张力解除 解链 双螺旋存 在张力 张力解除 拓扑学拓扑学：研究曲线、曲面的空间关系与内在数学性质，不考虑量度。：研究曲线、曲面的空间关系与内在数学性质，不考虑量度。 dna构象的拓扑关系构象的拓扑关系：引入负超螺旋（右旋），减少螺旋；引入正超螺 旋（左旋），增加螺旋。 ：引入负超螺旋（右旋），减少螺旋；引入正超螺 旋（左旋），增加螺旋。通过催化通过催化dna拓扑结构的变化，拓扑结构的变化，减少由于解链形成 的张力和合成的子代 减少由于解链形成 的张力和合成的子代dna形成双螺旋。形成双螺旋。 控制控制dna拓扑结构的酶为拓扑结构的酶为dna拓扑异构酶拓扑异构酶 i型拓朴异构酶型拓朴异构酶首先在大肠杆菌中发现，过去称为首先在大肠杆菌中发现，过去称为-蛋白，分子量为蛋白，分子量为 110000，一条肽链，它可切断，一条肽链，它可切断dna一条链，增加活减少一个螺旋，再接起 来，不需供给能量。 一条链，增加活减少一个螺旋，再接起 来，不需供给能量。 机理机理： ii型拓扑异构酶型拓扑异构酶e.coli中，中，mw=1400000为四聚体，为四聚体，a2b2， 真核生物中该酶分子量为 ， 真核生物中该酶分子量为390000二聚体，它可使二聚体，它可使dna两条链 同时断裂，然后再连接，结果 两条链 同时断裂，然后再连接，结果引入负超螺旋，也可将两个环状引入负超螺旋，也可将两个环状 dna分子解开或形成联环分子解开或形成联环，需，需atp供给能量。供给能量。 拓扑异构酶ii催化机理 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶 的功能拓扑异构酶 的功能 （1）双链）双链dna超螺旋与松弛态的相互转换超螺旋与松弛态的相互转换 （2）单链结状）单链结状dna和环状无结状和环状无结状dna的相互转换的相互转换 （3）单链互补环状）单链互补环状dna正、负链形成环状正、负链形成环状dna （4）双链环状）双链环状dna环连或解环连环连或解环连 （ 5 5 ）去除解螺旋的张力）去除解螺旋的张力）去除解螺旋的张力）去除解螺旋的张力 (二二)dna复制机理复制机理 复制 起点 1. 起始起始 dna分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用 下， 分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用 下，dna部分解链，形成了一个部分解链，形成了一个“复制眼复制眼”（replication eye） 起始子起始子（replicator）和起始因子和起始因子（initiator） 起始子：起始子：dna复制起始的序列 起始因子：识别并作用起始子， 启动复制的蛋白质 复制起始的序列 起始因子：识别并作用起始子， 启动复制的蛋白质 起始子结构起始子结构 起始因子结合序列和起始因子结合序列和dna解链序列解链序列 大肠杆菌大肠杆菌dna复制起始子序列与起始机理复制起始子序列与起始机理 13核苷酸序列：核苷酸序列：gatctatttattt，oric的解链区的解链区 9核苷酸序列：核苷酸序列：ttatccaca，dnaa的结合区域的结合区域 复制起始所需的蛋白因子复制起始所需的蛋白因子 dnaadnaa: :结合结合结合结合4 4个个个个9bp9bp序列，形成起始复合体，每个复合体序列，形成起始复合体，每个复合体序列，形成起始复合体，每个复合体序列，形成起始复合体，每个复合体 2020- -3030个；促进个；促进个；促进个；促进3 3个个个个13bp13bp区解链；引导区解链；引导区解链；引导区解链；引导dnabdnab- -dnacdnac复合体复合体复合体复合体 进入解链区，形成前引发复合体。进入解链区，形成前引发复合体。进入解链区，形成前引发复合体。进入解链区，形成前引发复合体。 dnabdnab：是：是：是：是dnadna解链酶；促进引发酶结合，形成引发解链酶；促进引发酶结合，形成引发解链酶；促进引发酶结合，形成引发解链酶；促进引发酶结合，形成引发 体。体。体。体。 dnacdnac：是：是：是：是dnabdnab的载体，形成的载体，形成的载体，形成的载体，形成dnabdnab- -dnacdnac复合体；促复合体；促复合体；促复合体；促 进进进进dnabdnab结合于解链区。结合于解链区。结合于解链区。结合于解链区。 huhu：诱导双链：诱导双链：诱导双链：诱导双链dnadna弯曲，与弯曲，与弯曲，与弯曲，与rnarna环有利于解旋；辅助环有利于解旋；辅助环有利于解旋；辅助环有利于解旋；辅助 dnaadnaa促进促进促进促进3 3个个个个13bp13bp区的解链。区的解链。区的解链。区的解链。 rnarna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶：合成：合成：合成：合成rnarna短链并形成环。短链并形成环。短链并形成环。短链并形成环。 dna复制所需的酶和蛋白质因子复制所需的酶和蛋白质因子 复制叉模型复制叉模型 dna 分子中正在 复制的部位，称 为复制叉。它是 由两股解开的亲 代链和在其上新 合成的子链、 酶、因子组成。 dna 分子中正在 复制的部位，称 为复制叉。它是 由两股解开的亲 代链和在其上新 合成的子链、 酶、因子组成。 dna 分子中正在 复制的部位，称 为复制叉。它是 由两股解开的亲 代链和在其上新 合成的子链、 酶、因子组成。 dna 分子中正在 复制的部位，称 为复制叉。它是 由两股解开的亲 代链和在其上新 合成的子链、 酶、因子组成。 引物体引物体 引物酶引物酶 因子因子 解螺旋酶解螺旋酶 ssb(单链结合蛋白单链结合蛋白) 5 5 3 3 复制叉移 动方向 复制叉移 动方向 dna聚合酶聚合酶 dnadnadnadna复制起始复制起始复制起始复制起始 复制叉蛋白的相互作用复制叉蛋白的相互作用 聚合酶与解链酶相互作用：聚合酶的作用 是通过夹子装置器与解链酶作用的，可以激活 解链酶的活性 聚合酶与解链酶相互作用：聚合酶的作用 是通过夹子装置器与解链酶作用的，可以激活 解链酶的活性 解链酶与引发酶的相互作用：可以激活引发酶 的活性（约 解链酶与引发酶的相互作用：可以激活引发酶 的活性（约1000倍），这种作用对于调节冈崎 片段的长短是十分重要的。 倍），这种作用对于调节冈崎 片段的长短是十分重要的。 聚合酶、解链酶与引发酶他国相互作用形成 的复制体（ 聚合酶、解链酶与引发酶他国相互作用形成 的复制体（ replisome ）其作用是很协调的。）其作用是很协调的。 dna 5 dna 3 3 5 a-t-g-g-c-a-a-a-t t-a-c-c- g-t-t-t-a rna 5 dna 3 3 5 a-t-g-c-c-a-g-a-t u-a-c-g-g-u-c-u-a 5 5 3 3 53 5 53 3 5 3 5 53 atp gtp utp ctpppi datp dgtp dttp dctp ppi dna聚合酶 2. 2. 延长延长 5 3 5 53 5 3 5 53 dna复制的 延长机理 复制的 延长机理 5 3 3 3 5 5 3 5 冈崎片段冈崎片段 （okazaki fragment） 原核生物原核生物 10002000个 核苷酸 个 核苷酸 复制机理：半不连续复制 attgcug taacgac a auugcug taacgac a uugcug taacgac atugcug taacgac a dttp u dttp u auugcug taacgac datp dgtp g c u g dctp dttp dgtp dna聚 合酶 i attgctg taacgac a attgctg taacgac a attgctg taacgac a atp或nad amp或nmn 连接酶 attgctg taacgac a 35 35 dna聚 合酶 聚 合酶 i 5 3 3 5 连接酶连接酶 ssb 引物体引物体 dna聚 合酶 聚 合酶 iii 解螺旋酶解螺旋酶 dna复制系统 dna拓扑 异构酶i dna拓扑 异构酶i dna拓扑 异构酶ii dna拓扑 异构酶ii 3. 终止终止 e.colidna 复制在终止区终止。 终止区结构： 复制在终止区终止。 终止区结构： ter：终止区多拷贝序列，每个：终止区多拷贝序列，每个20bp。是一个复制叉的终止 区。两个区是交叉的，只有通过另一个终止区，才能到达自己 的终止区。 。是一个复制叉的终止 区。两个区是交叉的，只有通过另一个终止区，才能到达自己 的终止区。 tus蛋白：识别、结合蛋白：识别、结合ter区，形成区，形成ter-tus复合体。复合体。tus可阻止 一个方向复制叉的解链，但为另一个方向的复制叉让路 可阻止 一个方向复制叉的解链，但为另一个方向的复制叉让路 dnadnadnadna复制复制复制复制 （二）真核生物（二）真核生物dna的复制的复制 1.复制需要的酶与因子复制需要的酶与因子 （1）真核生物真核生物dna聚合酶聚合酶： 共有五种，为共有五种，为dna聚合酶、 、聚合酶、 、 mw11012000 11012000 450004500060000 60000 122000 122000 250000250000 亚基数亚基数48个48个1 1 4个相同亚基4个相同亚基1 1 1 1 35外切酶 活性 外切酶 活性 无无无无有有有有有有 功能功能 合成引物与 一小段 合成引物与 一小段dna dna损伤修 复 损伤修 复 线粒体线粒体dna 的复制的复制 复制的 主要酶 复制的 主要酶 修复修复 dna聚合酶 合成rna-dna引物 四聚体结构 p180 p58 p49 p70 p180：dna聚合酶活性亚基聚合酶活性亚基 p49：引发酶活性亚基：引发酶活性亚基 p58：p49稳定和活性所必须稳定和活性所必须 p70：组装作用：组装作用 5 3 5 5 3 3 引物引物 dna dna聚合酶完成聚合酶完成 dna（dna聚合酶完 成） 聚合酶完 成） 聚合酶交换机制 真核生物真核生物真核生物真核生物dnadnadnadna复制有关的酶、蛋白质及其功能复制有关的酶、蛋白质及其功能复制有关的酶、蛋白质及其功能复制有关的酶、蛋白质及其功能 酶、蛋白酶、蛋白酶、蛋白酶、蛋白功功功功能能能能 rparparparpa单链单链单链单链dnadnadnadna结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白 pcnapcnapcnapcna夹子作用，激活聚合酶夹子作用，激活聚合酶夹子作用，激活聚合酶夹子作用，激活聚合酶 rfcrfcrfcrfc 激活聚合酶，促进激活聚合酶，促进激活聚合酶，促进激活聚合酶，促进pcnapcnapcnapcna结合于引物结合于引物结合于引物结合于引物- - - -模板链模板链模板链模板链 polpolpolpol 合成合成合成合成rnarnarnarna- - - -dnadnadnadna引物引物引物引物 polpolpolpol 主要聚合酶主要聚合酶主要聚合酶主要聚合酶 polpolpolpol 填补缺口填补缺口填补缺口填补缺口 fen1/rnaseh1fen1/rnaseh1fen1/rnaseh1fen1/rnaseh1去除引物去除引物去除引物去除引物 dnadnadnadna连接酶连接酶连接酶连接酶i i i i连接冈崎片段连接冈崎片段连接冈崎片段连接冈崎片段 dnadnadnadna解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶解螺旋解螺旋解螺旋解螺旋 topotopotopotopo i i i i 或或或或 iiiiiiii消除螺旋的张力消除螺旋的张力消除螺旋的张力消除螺旋的张力 其它因子其它因子其它因子其它因子 2.真核生物真核生物dna复制机制复制机制 （1）起始）起始 有起始子和起始因子（起始区识别复合体有起始子和起始因子（起始区识别复合体orc、cdc6、 cdt1、cdk、ddk等）等） 前起始复合体（前起始复合体（pre-replicative complex ，pre-rc）的形成的形成 前起始复合体被两个蛋白激酶前起始复合体被两个蛋白激酶cdk 和和 ddk活化，组 装，形成起始复合体 活化，组 装，形成起始复合体 dna复制起始的细胞周期控制复制起始的细胞周期控制 前起始复 合体的形 成是基础 前起始复 合体的形 成是基础 cdk活性是 调节关键 cdk活性是 调节关键 （2）延长与原核生物机理基本一致，酶与蛋白差异如下（2）延长与原核生物机理基本一致，酶与蛋白差异如下 组成组成组成组成原核生物原核生物原核生物原核生物真核生物真核生物真核生物真核生物 复制酶复制酶复制酶复制酶dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶iiiiiiiiiiiidnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 / / / / 复制连续性因子复制连续性因子复制连续性因子复制连续性因子 夹子夹子夹子夹子pcnapcnapcnapcna 夹子装配器夹子装配器夹子装配器夹子装配器 复合物复合物复合物复合物rfrfrfrf- - - -c c c c 引物合成引物合成引物合成引物合成引发酶（引发酶（引发酶（引发酶（dnagdnagdnagdnag）dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 去除引物去除引物去除引物去除引物dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶i i i irnaseh1rnaseh1rnaseh1rnaseh1和和和和mfmfmfmf- - - -1 1 1 1 填补缺口与连接填补缺口与连接填补缺口与连接填补缺口与连接dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶i i i i、连接酶、连接酶、连接酶、连接酶dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 、连接酶、连接酶、连接酶、连接酶1 1 1 1 解螺旋解螺旋解螺旋解螺旋解链酶（解链酶（解链酶（解链酶（dnabdnabdnabdnab）t t t t抗原抗原抗原抗原 消除拓扑张力消除拓扑张力消除拓扑张力消除拓扑张力iiiiiiii型拓扑异构酶型拓扑异构酶型拓扑异构酶型拓扑异构酶iiiiiiii型拓扑异构酶型拓扑异构酶型拓扑异构酶型拓扑异构酶 单链结合单链结合单链结合单链结合ssbssbssbssbrprprprp- - - -a a a a （3）终止）终止 两复制叉相遇，其机理与原核生物相似。两复制叉相遇，其机理与原核生物相似。 一个复制眼的两复制叉，其连接与复制中冈崎一个复制眼的两复制叉，其连接与复制中冈崎 片段连接相同片段连接相同 （4）端粒的复制与端粒的复制与端粒酶端粒酶（telomerase） 端粒dna端粒dna 串联重复序列，每个拷贝很短，碱基数目精确串联重复序列，每个拷贝很短，碱基数目精确 人：人：ttaggg,上千拷贝，共上千拷贝，共15kbp 酵母：酵母：g(gg)t,200-400bp 尖毛虫：尖毛虫：ggggtttt，20bp 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 酵母：酵母：raplp、rif、kup等蛋白。等蛋白。 raplp与与rif复合体 结合端粒重复序列并可控制端粒 复合体 结合端粒重复序列并可控制端粒dna的长度；的长度； kup蛋 白可保护端粒 蛋 白可保护端粒 人：人：trf1、trf2、tinf等。等。 trf1是重复序列结合 蛋白， 是重复序列结合 蛋白， trf2也是重复序列结合蛋白，并能保护端粒也是重复序列结合蛋白，并能保护端粒 端粒酶 组成 端粒酶 组成：蛋白质与：蛋白质与rna 性质性质：两个亚基，一个为催化亚基，另一个为调节亚基：两个亚基，一个为催化亚基，另一个为调节亚基 功能功能：以酶分子中的：以酶分子中的rna片段为模板，在染色体片段为模板，在染色体dna3-端合成一段端合成一段dna accccaac 35 3 aaccc 5 5 ttgggtt 3 tggggttg3 rna 端粒酶机理端粒酶机理 端粒酶机理端粒酶机理 端粒合成的终止：端 粒结合蛋白结合到一 定数目端粒合成就停 止 生理意义 端粒合成的终止：端 粒结合蛋白结合到一 定数目端粒合成就停 止 生理意义：端粒酶可 以补充染色体末端的 自然丢失，防止细胞 衰老。 ：端粒酶可 以补充染色体末端的 自然丢失，防止细胞 衰老。 四、不同四、不同dna 的复制方式的复制方式 （一）（一）原核生物原核生物dna复制方式复制方式 1. 凯恩斯模型凯恩斯模型（型）（型）（ cairns model ）双链环状）双链环状dna的复制方式的复制方式 拓扑异 构酶 2. 滚环模型滚环模型（rolling circle model）双链环状）双链环状dna复 制方式 复 制方式 5 3 5 3 膜 5 3 5 3 5 3 3. 单链环状单链环状dna复制方式复制方式 5 3 5 3 5 3 + 5 3 4. 线粒体线粒体dna复制方式复制方式d环复制模型环复制模型 4. 4. 线粒体线粒体线粒体线粒体dnadna复制方式复制方式复制方式复制方式d d环复制模型环复制模型环复制模型环复制模型 重链 轻链 一、一、反转录（逆转录）反转录（逆转录） 1. 概念概念以以rna为模板合成为模板合成dna的过程的过程 2. 反转录酶反转录酶存在于真核生物的存在于真核生物的rna肿瘤病毒中。肿瘤病毒中。 催化过程：催化过程： rna 第三节第三节 dna的其他合成方式的其他合成方式 dna nnmp 正链正链正链正链rnarna 引物引物引物引物trnatrna结合于结合于结合于结合于rnarna近近近近 5 5端端端端 开始合成负链开始合成负链开始合成负链开始合成负链dnadna 到到到到rna5rna5端停止，合成了端停止，合成了端停止，合成了端停止，合成了 带强终止子的负链片段带强终止子的负链片段带强终止子的负链片段带强终止子的负链片段 rna5rna5端端端端r r区降解区降解区降解区降解 负链负链负链负链dnadna片段跳到片段跳到片段跳到片段跳到rna3rna3 端，以其端，以其端，以其端，以其r r区与区与区与区与rna3rna3端端端端 r r区互补区互补区互补区互补 合成负链合成负链合成负链合成负链dnadna 移去移去移去移去trnatrnatrnatrna引物引物引物引物 rnarnarnarna降解，留下部分片降解，留下部分片降解，留下部分片降解，留下部分片 段作为段作为段作为段作为dnadnadnadna合成引物合成引物合成引物合成引物 合成带强终止子正链合成带强终止子正链合成带强终止子正链合成带强终止子正链 dnadnadnadna 正链正链正链正链dnadnadnadna跳到负链跳到负链跳到负链跳到负链dnadnadnadna的的的的 3 3 3 3端互补结合端互补结合端互补结合端互补结合 完成正链完成正链完成正链完成正链dnadnadnadna合成合成合成合成 完成负链完成负链完成负链完成负链dnadnadnadna合成合成合成合成 反转录的特点反转录的特点 1.1.1.1.三种反应三种反应三种反应三种反应(rna(rna(rna(rnadnadnadnadna，rnarnarnarna降解，降解，降解，降解，dna dna dna dna dna)dna)dna)dna)由一个酶催化由一个酶催化由一个酶催化由一个酶催化 2.2.2.2.负链负链负链负链dnadnadnadna合成的天然引物是合成的天然引物是合成的天然引物是合成的天然引物是trnatrnatrnatrna，是引物，是引物，是引物，是引物 的的的的3 3 3 3端端端端18bp18bp18bp18bp与与与与rnarnarnarna互补结合。正链合成的互补结合。正链合成的互补结合。正链合成的互补结合。正链合成的 天然引物是分解后的天然引物是分解后的天然引物是分解后的天然引物是分解后的rnarnarnarna片段片段片段片段 3.3.3.3.实现了两次跳跃实现了两次跳跃实现了两次跳跃实现了两次跳跃 4.cdna4.cdna4.cdna4.cdna的两条链是分步合成的的两条链是分步合成的的两条链是分步合成的的两条链是分步合成的 二、二、二、二、基因扩增（人工体外合成基因扩增（人工体外合成基因扩增（人工体外合成基因扩增（人工体外合成dnadna） 加热加热 降温降温 引物、底物 循环操作 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（pcr） 系统系统：模板（：模板（dna片段）、酶、引物、底物（片段）、酶、引物、底物（4种种dntp） 过程过程： pcr过程过程 一、一、dna的损伤的损伤 1.dna复制中的损伤复制中的损伤 （1）碱基错配）碱基错配 碱基会发生互变异构，互变异构体则会形成错配碱基会发生互变异构，互变异构体则会形成错配 第四节第四节 dna的损伤与修复的损伤与修复 a -c或或c -a g -t或或t -g （2）核苷酸插入或删除）核苷酸插入或删除 dna聚合酶dna聚合酶“打滑打滑”，结果为模板链或新生链碱基，结果为模板链或新生链碱基“环出环出”，后续碱 基配对还是正确的。多发生于同种碱基连续出现的部位。 ，后续碱 基配对还是正确的。多发生于同种碱基连续出现的部位。 aaaaa （3）校对的“疏忽” 2.环境因素对环境因素对dna的损伤的损伤 (1)因素：化学因素：诱变剂因素：化学因素：诱变剂 碱基类似物碱基类似物 还有活性氧、烷化剂等还有活性氧、烷化剂等 物理因素物理因素 紫外线：引起紫外线：引起t-t二聚体二聚体 电离辐射：碱基脱落、断链等电离辐射：碱基脱落、断链等 （2）损伤种类）损伤种类 碱基聚合碱基聚合 碱基错配碱基错配 脱氨基脱氨基 cu 5-mc t 碱基丢失碱基丢失 断链：单链断裂、双链断裂断链：单链断裂、双链断裂 1、错配修复 dam甲基化酶使母链位于5gatc序列中腺甘 酸甲基化 甲基化紧随在dna复制之后进行 根据复制叉上dna甲基化程度，切除尚未 甲基化的子链上的错配碱基 二、二、 dna损伤的修复损伤的修复 发现错配碱基发现错配碱基 在水解atp的作用下， muts， mutl与碱基错配 点的dna双链结合 在水解atp的作用下， muts， mutl与碱基错配 点的dna双链结合 muts-mutl在dna双链上 移动，发现甲基化dna 后由muth切开非甲基化 的子链 muts-mutl在dna双链上 移动，发现甲基化dna 后由muth切开非甲基化 的子链 甲基化指导的错配修复示意图甲基化指导的错配修复示意图 错配碱基位于 切口3 错配碱基位于 切口3下游端下游端， 错配碱基位于切 口5 错配碱基位于切 口5上游端，上游端， 2 2、切除修复、切除修复、切除修复、切除修复 （1 1）碱基切除修复）碱基切除修复）碱基切除修复）碱基切除修复 一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然 后改变配对性质，造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配