嘧菌酯对荔枝霜疫霉病菌不同发育阶段的生物活性.pdf

嚓菌醋对荔枝霜疫霉病菌不同 发育阶段的生物活性 潘汝谦，徐大高，张金妹“ 陈维信 2 ( 华南 农业大学， 资源环境学院， 2 园 艺学院，广州 5 1 0 6 4 2 摘要: 本文在离体下测 定了啼菌 醋 ( a w x y s 1 o 0 1 ,1 1 ) 对荔枝霜疫霉病菌 ( p e ro n o p h y t h o r a l a c h ii c h e n e x k o e t a l . ) 不同发育阶段的生物活 性:啥菌 醋对 荔枝霜疫 霉病菌菌 丝生长的e c m 是。 . 3 2 1 2 留 n il 、 对抱子囊间 接萌发的 e c , 值是0 . 1 0 5 4 p g / m l 、 对游动抱子游动性的最低抑制浓度 ( m i c ) 是。 . 0 2 5 w m 、 对休止抱子萌发的e c m 值 是0 .0 1 1 马 rg / m l o 结果表明， 嗜菌酣对荔枝霜疫霉菌 不同 发育阶段都具有生物活性， 同时表现出良 好的 杀菌 作 用和 抑菌作用， 又以杀菌活性更为强烈。在40w“的浓度下， 水杨基氧肘酸 ( s a li c y 断d a o - a c i d , s h a m)对荔枝霜疫霉病菌的菌丝生长没有影响;但是 s h a m十啥菌酣处理作用于荔枝霜疫霉病菌菌丝生长 的e c ,n 值 是。 . 1 6 6 4 p g / m l ， 其p 值 ( p = e 与 ( 单独杀菌剂) / e c ,( 杀菌 剂十 s h a m ) ) 是1 . 9 3 . 表明s h a m对 啥菌醋抑制 荔枝霜 疫霉病菌菌丝生长 有增效作用;同时也表明荔枝霜疫霉病菌的旁路氧化酶 ( a l te rn a ti v e o x i d a s e , a o x)是在呼吸传递的主途径受到嗜菌幽阻断后才诱导激活的。 关键词: 杀菌剂; 荔枝霜疫霉病菌 ( p e o n o p h y th o r a lit . w) ;生 物活性; 嚓菌酷 t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f a z o x y s t rob i n o n d i f f e r e n t d e v e lo p m e n t s ta g e s o f p e r o n o p h y th o r a l it c h i i . p a n r u g ia n t , x u d a g a o t , z h a n g j in m e i t， c h e n w e . . ( t c o l le g e o f r e s o “ 二 a n d e m ri ro n m e n t , 2 c o l le g e o f h o r t i c u l t rt re s c ie n ce , s o u t h c h i n a a g ri c u l t u r a l u n i v e r s 妙，g u a n g z h o u 5 1 0 6 4 2 , c h i n a .) a b s tr a c t : t h e b i d 嗜c a l a c ti v iti e s o f a m x y s tr o b i n o n fw 喇 d e v e l o p m e n t o f p e ro n o p h y th o m l v c h is i c h e n e x k o e t a 1 . ( t h e c a u s a l a g e n t o f l y c h e e d o w n y b li g h t ) , a n d t h e s y n e r g is m o f s h a m to a xo x y s u o b i n o n t h e m y c e li a g ro w th o f p . h tc h i ， te s te d to t w o . t h e e c m v a lu e o f “x y s tro b in o n n ry c e li a l g ro w th , s p o r a n g ia l i n d i re c t g e r m i n a ti o n ( 场r e l e a s in g - p - ) , a n d c y s t s p o re g e n n in a t io n o f p . l it c h is w a s 0 . 3 2 1 2 1s g / n il , 0 . 10 5 4 p g / n d , a n d 0 . 0 1 1 9 11 留n d , r e a p e c ti v e ly . a n d t h e m i c ( n u n i m a l in h i b ito ry c o n c e n tr a t io n ) o f a z o x y s tr o b i n o n t h e in u ti l ity o f w o s p o n s o f p . l ti c la i w a s 0 . 0 2 5 w n d . t iw r es ul ts a u g g e s te d t h a t m o x “ b in p o s s e s s es b o th f u n g is ta t ic a n d f u n g ic i d e l a c ti v ity to p . iit c h i i . s h a m ( s a lic y lh y d ro x a rn ic a c i d ) h a d on e ff e c t o n n ty c e li a l g r o w th o f p. h t a u i a t e o n c e n tr a ti o n of 4 0 p g / m l , b u t th e e c a v a lu e o f a wx y s tro b i n w ith s h a m ( 4 0 p g / ru l ) t o t h e m y c e l ia l g ro w t h o f p . l iw h i i w a s 0 . 1 6 6 4 w n il . a r id th e p v a lu e ( p = e c n ( fu n g ic id e s - s h a m ) / e c o ( f m 心 c i d e r + s h a m ) ) . 1 . 9 3 . i t d e m o n s tr a t e d t h a t s h a m h a d s y n e r g is ti c e ff e c t o n th e i n h i b i t io n o f a w x y s tro b i n a g a in s t p . li td u i . i t a ls o i rt t p l ie d t h a t a l te rn a ti v e o x id a s e ( a o x ) w o u l d b e in d u c e d in p . i ltc ti i w h e n th e 二 p a th w a y w a s d is - r u 户 司 场a z o x y s t m b i n . k e y w o r ds : f u n g ic id e ; p a o n a p h y d w ra l iw l d i ; b io l o g ic a l a c ti v i ty ; a a o x y s . 现 在广东省 中山市 工作。 啥菌酣对荔枚霜痰霉病菌不同发育阶段的生物活性 21 9 荔 枝 是 华 南 地 区 的 重 要 水 果 之 一， 荔 枝 霜 疫 霉 病( p e r o n o p h y t h 。 二l i tc h i i c h e n e x k o e t a l . ) 是荔枝生产上最重要的 病害， 药 剂防 治是目 前最主要的防治方法u - z j 嗜球果伞素 ( s t io b il - ， ) 杀 菌 剂 3 1 的 阿 米 西达( a m i s ta r ， 中 文 通 用 名为 啼 菌 醋， a z o x y s t r o b i n )自2 0 0 2 年 引 进 我 国 后，己 被使用于荔枝霜疫霉病的防治 上2 1 。 该类杀菌剂的广谱生物活 性以 及独特的 作用方 式 3 - 5 1 ， 引 进国 内 后， 立 即 受 到 广 泛的 关 注， 对 嗜 菌 醋 的 研 究 论 文也 很多 6 3 。 但 是， 有 关 啼 菌醋对荔枝霜 疫霉病菌的生物活性还没有报 道。 本文研究了啥菌醋对荔枝霜 疫霉 病菌不同 发 育阶 段的 影响以 及水杨基氧厉酸 ( s a l i c y l h y d m x a n u c a c i d , s h a m ) 对啥 菌酷作用于 荔枝霜疫 霉 病菌的增效作用。 1 材料与方 法 1 . 1 供试病原菌、 供试杀菌荆与试剂 荔 枝霜疫霉 菌 ( p e ro n o p h y th o r a l it c h i i ) ，由 本实验室分离和保存。 2 5 %阿米西达 ( a n u s - ta r )悬浮剂， 购自 先正 达公司; 水杨基氧脂酸， 购自s i g m a 公司。 1 . 2 咄菌醋对荔枝a疫霉 菌的生 物活性 荔枝霜疫霉病 菌保 存培养均在菜豆煎汁琼脂培养基上 ( 莱豆2 0 0 g ， 琼脂2 0 g ， 水1 0 0 0 ml).荔枝霜疫霉菌在菜豆煎汁琼脂培 养基中 培养4 d ， 备用。 1 . 2 . 1 对菌丝生长的影响 药剂对荔枝霜疫霉病菌的菌丝生长的毒 力测定方法是用含毒介质培养的 生长速率法 3 1 分别在定量 ( 4 9 m 1 )的 溶融状态 ( 大约4 5 cc)的菜豆煎汁琼脂培养基中 加人 l a药剂悬浮 液，制 成含毒 培养平板。 用灭菌的打孔器 ( 直径5 。 ) 沿菌落边缘打取大小、生长一致的菌 块， 作为接种 体。 接种后置培养箱中恒温 ( 2 4 9 c )培养4 d 。用直尺量菌落的直径， 与对照 的菌落直径比 较， 计算各浓度抑制菌落生长的 百分率。 并计算e c 5o 值。 抑菌百分率= ( 对照菌落直径一 处理菌落直径) / 对照菌落直径x 1 0 0 % 1 . 2 . 2 对抱子沈间接萌发的影响 药 剂 对 荔 枝 霜 疫 霉 病 菌 的 抱 子 囊 萌 发 的 毒 力测 定 用 泡 子 萌 发 法 ，。 先 在 莱 豆 煎 汁 琼 脂 培 养基上培养4 d 的菌落中， 加人5 m 1 灭菌蒸馏水， 轻轻摇动， 成熟的 抱子囊就会从抱子 囊梗 上脱落并悬浮于水中形成抱 子囊悬浮液。 吸取5 0 0 p 置于菜豆煎汁琼脂培 养基平板上， 用灭 菌的曲 玻棒将饱子囊悬浮液均 匀地涂布开，置2 4 恒温培养3 d ，获得生长比 较一致的新鲜 的 抱子囊。 再在新的抱子囊培养平板 上加人5 m 1 灭菌蒸馏水， 参考上述方法， 制成抱子囊悬 浮液， 备用。 将2 0 p 7 的抱子囊悬浮 液， 滴加到凹 玻片上，再将同 体积的杀菌剂加入到抱子囊悬浮液 中。 将玻片 置于2 4 的 恒温培养箱中 保湿培养6 h ， 然后在显微镜下观察杀菌剂对泡子囊间 接萌发 ( 抱 子囊释 放游动抱子， 变成空 囊)的 影响。 随机数3 0 0 个抱子囊， 观察其空抱子囊 的 百分 率。 校正萌发率( %) = 处理组的萌 发率/ 对照 组的 萌发率x 1 0 0 % a ， 计算抑制百分率并 计算 e c x 值。 1 . 2 . 3 对游动艳子游动性的影响 按上述 方法 制备 抱子囊悬浮液。 取适量抱子囊悬浮液， 置4 冷刺激2 0 m in , 然后取出 放在2 4 下回 暖l o m in ， 大量 抱子 囊就会间接萌 发， 释放出 游动 抱子， 即可获得游动 抱子悬 浮液。游动抱子在水中不停地游动。备用。 将1 5 .1 的 游动抱子悬浮液， 加到凹玻片上， 再将同体积的杀菌剂的加人到游动抱子悬 2 2 0中国植物病害化学防治研究 ( 第五卷) 浮 液中， 在显微镜下观察， 如果游动抱子在1 0 m i n 内 也停止 游动， 那就按上述方法加人更低 浓度的杀菌剂， 直至观察到游动抱子在1 0 m in 内 不停止游动为止， 其上一个浓度即 为杀菌剂 对 游 动 抱 子 游 动的 最 低 抑 制 浓 度 ( m i n i m a l i n h i b i to ry c o n c e n t r a t io n ， 简 称m i c ) o 1 . 2 . 4 对休止袍子萌 发的 影响 按照 上述方法制备游动抱子悬浮液， 用试管 取一定体积的 悬浮液，在旋涡混合器 ( x w - 8 0 a ) 上振荡6 0 秒钟， 使游动泡子停止游动， 即可获得 休止抱子悬浮 液。 将 1 5 川的休止抱子悬浮 液， 加到凹 玻片上， 再将同体积的杀菌 剂加人到抱子悬浮液中。 然 后置于2 4 恒温 培养4 h ， 在显微镜下观察休止 抱子的萌 发， 随机观测2 0 0 个休止抱子的 萌发， 计算萌 发率并计算其e c 50 值。 1 . 3 s h a m对唔菌醋 作用子荔枝箱疫霉病菌菌丝生长的增 效作用 将s h a m 配 制 成2 0 0 0 留n il 的 母 液， 崛 菌 醋 稀 释 成 系 列 浓 度 悬 浮 液 ， 分 部吸 取1 m 1 s h a m 和药 剂悬浮液，同时加人到装有定量 ( 4 8 m 1 )的溶化 ( 大约4 5 9 c )的菜豆煎汁琼脂培养基 中， 迅速摇匀， 并立即倒到消毒的培养皿中， 制成系 列含毒培养平板， 使每个平板均含有 4 0 w m l 的 s h a m 。按上述方法进行菌块的接种，培养，结果观测和计算。求 e c , ( + s h a m ) ， 并 与e c m( 一 s h a m )比 较， 按h e l g e s i e ro tz k i d 的 公 式 ( 4 求p 值: p 二 e c , ( f m 心 t i d e s 一 s h a m ) / e c 5d ( fm l g i c id e s 十 s h a m ) 当p i 时， 说明s h a m有增效作用。当p 二 1 或p 1 时， s h a m没 有增效作用。 2 结果与 分析 2 . 1 呛菌l ? 对荔枝霜疫霉菌的生物活性 咯菌酷对 荔枝霜疫霉病菌菌丝生长、 抱子 囊间 接萌发和 休止抱子萌 发的e c m 值和对游动 抱子游动性的m i c 值均见表 t o 表 1 啥菌醋对荔枝藉疫易病菌 ( p . g t c h i l 】的生物活性 病原菌的发育阶段 菌丝生长 抱子囊间接萌发 游动抱子的游动性 休止饱子萌发 矿 卜表 示相关系 数极显 著。 回归方程 y = 5 . 4 2 9 9 + 0 . 8 7 1 5 x y =7 . 2 1 7 6 + 2 . 2 6 9 1 x 相关系数“ 0 . 9 7 0 3 “ 0 . 9 6 8 5 冬 . e c , 或m i c 值 ( r+ y1 n , 1 ) y= 9. 4 9 9 1十 2 . 3 4 01 x9 7 3 5 0 . 3 21 2 0 . 1 0 5 4 0 . 0 2 5 0. 0 1 1 9 从表1 可见， 喻菌醋对荔 枝霜 疫霉病菌 生活史的各个发育阶 段， 包括菌 丝生长 ( e c h o 值 为。 . 3 2 1 2 1 e g / n d ) ,抱子囊间接萌发 ( e c ,o 值为。 . 1 0 5 4 t, g / m l ) 、 游动抱子的游动 ( m i c 值为 0 . 0 2 5 w n il )和 休止抱子的萌发 ( e c h o 值为0 . 0 1 1 9 w n l )均有比较强的 抑制作用， 尤其是游 动抱子的游动和 休止抱子的萌发对嚓菌醋非常敏 感。 2 . 2 s h a m对喷 菌醋 的作用于荔枝霜疫霉病菌菌丝生 长的 增效作用 在s h a m 浓度为4 0 1a g / n d 时， 其对荔枝霜 疫霉病菌的 菌丝生长没有影响。 但是在这个浓 度下， s h a m + 啼菌醋 共同 作用于 荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的e c 5o 值为0 . 1 6 6 4 1, g / n d( 回 归方 程为y 二 5 . 5 8 8 9 十 。 . 7 5 6 2 x ,: 二 0 . 9 8 9 0 ， ， 极显著) 。与单独的嚏菌酷对荔枝霜疫霉病菌菌 丝生长的e c so 值 ( 0 . 3 2 1 2 1x g / m l ) 进行比 较， 其p 值为: 尸 二 单独呛菌醋的e ql 值/ ( s h a m 十 啥菌醋) 处理的e c , o 值= 1 . 9 3 啥菌醋对荔枝霍疫霉病菌不同发育阶段的生物活性 2 2 1 可见， p值大于1 ， 说明s h a m对喷菌醋作用于荔枝霜疫霉病菌的菌丝生长有增效 作用。 3 讨论 嗜 球果伞素 ( s t ro b i l u r i n s )杀菌剂由于起源于木材腐烂担子菌嗜球果伞菌 ( s tr o b d u r u s t e n a c e l l u s )等 真菌而名。 嗜球果伞素杀菌剂 具有极其广谱的生物活性， 是第一个能够同时防 治高等真菌和 低等的卵 菌的 新杀菌剂， 同时它对病原 菌的 不同 发育阶段， 特别是 需要能量 较 多的发育阶 段尤 其敏 感。 嗜球果伞素杀菌剂的毒性基团均含有r - 甲氧基丙烯酸 ( 卜 m e t b o x y - a c ry li c a c i d ) ， 所以又 称为甲 氧基丙烯酸类杀菌剂。嗜 球果 伞素 及其相关化合物的 作用机理是 与病原菌呼吸传递链的复合 体l ii的 细胞色素b 蛋白 的0 0 位点结合， 阻止电子从细胞色素b 到细胞色素d的电 子传递， 从而阻碍能量的合 成。因 此， 它们也被称为复合体m呼吸抑制 剂 ( c o m p l e x ii i r e s p i ra t io n i n h i b i t o rs ) ，或者0 0 位点抑制剂 ( o o i n h i b i to r s , o o l s ) a 啥菌醋是嗜 球 果 伞 素 杀 菌 剂 的 代 表 性 品 种 之 一 3 1 。 从 我 们的 研 究 结 果 可 知 ， e 菌 酷 对 属于 卵 菌 的 荔 枝 霜 疫霉病菌生活史的 不同发育阶段， 如菌丝生长、 抱子囊间接萌发、 游动 抱子的 游动以及休止 抱子的萌 发均有强烈的抑制作用或 者杀菌作用。 游动抱子的游动和 休止 抱子的 萌发对啥菌醋 尤其 敏感。因为， 这两个真菌的发 育阶 段都是对能量的需求比 较多的阶段，因 此对能量抑制 剂比 较敏感。 结果间接证明了啼菌 醋对能量合成的 抑制作用。 当 呼吸 链电 子传递过程的主路 ( t h e ， ， p a t h w a y )的呼吸复合体i n 受到嗜球果伞素 杀菌剂的 抑制时， 一些病原菌能通过呼吸旁 路传递电 子，由 旁路氧化酶 ( a l te rn a t i v e o x i d a s e , a o x ) 获得 能 量 而 继 续 生 存 s 。 但 当 主 、 旁 路 都 受 到 杀 菌 剂的 抑 制 时， 就 能比 较 彻 底 地 影 响 能量的合成。s h a m 是旁路氧化酶 ( a o x ) 抑制剂。在不同的病原菌中， 旁路氧化酶的作用 是不同的: 许多病 原菌的 旁路氧化酶是杀菌剂抑制主 路氧 化途径后才诱导激活的， 也有一些 病原菌的旁路氧化 酶是本来就存在的 ( c o n s t i t u t i v e )或者是固 有的， 也有一些病原菌没有检 测到旁路氧化酶的活 性。 如果旁路氧化酶在病原 菌中 存在的 话， 那么， 不管它是 被诱导激 活 的 还 是固 有 的， s h a m 对 嗜 球果 伞素 杀 菌 剂 都 表 现 增 效作 用 a - s 。 我 们的 研 究 结 果表 明 ， 离 体下s h a m对荔枝霜 疫霉病菌的 没有明显的抑制 作用， 但是在s h a m与啥菌醋 共同 存在的 条 件下， 对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长 表现出 增效作用; 这些结果 进一步表明了 咯菌醋对荔枝霜 疫霉病菌的 作用机理是作用于能 量的 生成， 而且， 在荔枝霜疫 霉病菌的 菌丝生长过程中， 旁 路氧化酶是被诱导激活的。 参考文献