酶法处理烟叶碎片制备烟草浸膏.doc

酶法处理烟叶碎片制备烟草浸膏庞登红1，李丹2，熊国玺3，王娜3，陈守文1*，1. 华中农业大学农业 微生物国家重点实验室，湖北 武汉 4300702. 湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北 武汉 4300513. 武汉黄鹤楼天然香料有限公司，湖北 武汉 430040EMAIL:摘 要：为了实现烟叶碎片的再利用，本文开展了中性蛋白酶处理烟叶碎片提取物制备烟草浸膏的工艺研究。优化了pH调节剂、酶添加量、酶处理温度和酶处理时间，优化条件为：pH调节剂为1 mol/L氢氧化钠溶液，中性蛋白酶添加量为6.0g/L，酶处理温度为40，酶处理时间为4h。与对照比较，酶法浸膏能改善烟气状态，降低刺激性，减少残留；烟叶碎片提取物中氨基酸含量增加了211.1%-316.7%，还原糖含量增加了8.0%-8.8%，蛋白质含量减少了11.2%-43.0%；且此酶法浸膏中含吡喃和吡嗪环状小分子结构的香气物质含量增加了5.5%，高分子醇、酸和烷烃含量减少45.5%，以及尼古丁含量降低了5.5%。关键词：烟叶碎片；烟草浸膏；中性蛋白酶；气质分析中文分类号：Q814.9Tobacco extract made from tobacco fragments with enzymePANG Deng-hong(1), LI Dan(2),XIONG Guo-xi(3), WANG Na(1), CHEN Shou-wen(1)1. State Key Laboratory of Agricatural Microbiology，Huangzhong Agricatural University, Wuhan, 430070, China2. Technology Center of China Tobacco Hubei Industrial CO., LTD , Wuhan, 430051, China3. Wuhan Huanghelou Natural Flavours CO., LTD, Wuhan, 430040, ChinaAbstract：For recycling tobacco fragments, the technique about tobacco extract from tobacco fragments with neutral proteinase was studied. The enzyme treatment conditions were optimized, including pH regulator, enzyme concentration, treatment temperature and treatment time. The optimal conditions were as follows: the extract pH regulator was 1 mol/L sodium hydroxide, 6.0 g/L neutral proteinase , 40 for 4 h. Compared to the control, the enzymatic extract could ameliorate state of the smoke, reduce its thrill and hangover. Its free amino acid content was stepped up 211.1%-316.7% and reduce sugar content were improved of 8.0%-8.8%, while the protein content was reduced by 11.2%-43.0%. The contents of its aroma compound with ring-like structure such as pyran and pyrro were increased of 5.5%, while the contents of its macromolecule compounds such as mellow and paraffin was reduced by 45.5% and nicotin were decreased of 5.5%.Key words: Tobacco Fragments; Tobacco Extract, Neutral Proteinase; GC/MS Analysis作者简介：庞登红（1983-），男，重庆潼南人，华中农业大学微生物国家重点实验室发酵工程在读硕士，主要从事生物技术制备烟用香精香料的开发研究工作。通讯作者：陈守文（1968-），男，湖北黄石人，教授，博士生导师，主要从事微生物发酵的研究。Email:我国烟草植物的种植面积和产量均居世界首位，每年烟叶产量274.4万吨，在烟草复烤、运输、储存和卷烟生产加工等过程中，有大量的烟叶碎片产生。因此，如何将烟叶碎片变废为宝，已成为一个丞待解决的问题1-4。邱承宇等在混合烟丝中加入不同比例的烟叶碎片，既提高混合烟丝的填充值、降低烟支单重、减少卷烟焦油量的产生，且对感官质量无太大影响，又充分利用烟叶原料，为卷烟降耗、降焦工艺提供了一种新的参考方法5；谭新良等将烟叶碎片通过制浆方法生产烟草薄片6，但未见烟叶碎片制备烟草浸膏的报道。烟草浸膏作为烟叶碎片的高附加值产品，解决了烟叶碎片制备烟丝对高品质的要求和烟叶碎片制备烟草薄片低效益的问题。烟草浸膏在卷烟中具有丰富烟香，体现烟草本香的作用，但由于烟草浸膏中蛋白质含量高，使得其在卷烟中具有增加刺激性和残留的缺点。中性蛋白酶作为一种水解酶，其对烟草中蛋白质的降解作用最为明显7。因此，本文选用中心蛋白酶处理烟叶碎片制备烟草浸膏。1 材料和方法1.1材料1.1.1材料 烟叶碎片（武汉卷烟厂）；五元空白烟丝（武汉卷烟厂）；中性蛋白酶（杭州中香化学有限公司 5万U）；二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（AR 天津市风船化学试剂科技有限公司）；氨水（AR广东光华化学有限公司）；纯净水（武烟自用纯净水）；茚三酮、正丙醇、正丁醇、乙二醇、醋酸钠、冰醋酸、亮氨酸、异丙醇、抗坏血酸、葡萄糖、3，5二硝基水杨酸试剂、酒石酸钾纳、亚硫酸钠、苯酚、无水硫酸钠、磷酸氢二甲（AR 国药集团化学试剂有限公司）。1.1.2 仪器 TRACE GC Ultra-DSQ型气-质联用仪（美国热电科技有限公司）；数显电热恒温干燥箱（武汉鼎立烘箱炉业有限公司）；旋转蒸发器RE-5IAA（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D循环式真空泵、电热套（巩义市予华仪器有限公司）；数显恒温水浴锅 HH-6（常州澳华仪器有限公司）；冰箱（博西华家用电器有限公司）；猴头喷雾器；打烟机（德国FABRIQUE EN ALLEMAGNE公司）。1.2 工艺和方法1.2.1酶法浸膏的制备烟叶碎片浸膏的制备工艺如图1，其中，对照样为不用中性蛋白酶的处理样。装入2000ml烧瓶电热套回流提取3h65再次浓缩至20g-17沉降处理24h80浓缩至100g80浓缩至100g烟草浸膏产品品微孔滤膜过滤调节pH值冷却、纱布过滤100g烟叶碎片和1500ml自来水中性蛋白酶处理烟草浸膏粗品3倍质量95%酒精溶液处理图1 烟叶碎片浸膏的制备工艺流程Figure 1 The technique flow chartof tobacco fragment extract1.2.2 烟草浸膏的评吸评价准确称取0.04g烟草浸膏至5ml小烧杯，加1.60g蒸馏水稀释，用喉头喷雾器均匀喷洒于40g 五元空白烟丝，装入封口袋，吹气使封口袋鼓起，将袋口封住，放在烘箱中80烘0.5h，打烟给专业评吸人员评吸。评吸打分参照郑州烟草院单体/香精作用评价原始记录表。评分表格如下：表1 烟草浸膏评吸表Table 1 The sense-somoking table of the tobacco extract 样品香气特征烟气特征口感特征总分香气质香气量杂气透发性劲头浓度细腻柔和程度刺激程度干燥程度回 甜余 味上表中每一评分项目的分值从1.0到5.0，每0.5分一个档次。评吸时对每一项进行打分，最后算其总分。1.2.3还原糖、蛋白质和氨基酸测定采用DNS法测定还原糖含量、茚三酮比色法测定游离氨基酸含量，考马氏亮蓝法测定蛋白质的含量8。取100g烟叶碎片，按1.2.1工艺制备烟叶碎片提取物，并测定酶法处理前后烟叶碎片提取物的蛋白质、氨基酸和还原糖的含量。1.2.4气质分析样品前处理 取25ml三角瓶，准确称取3g烟草浸膏样品，向三角瓶内加入10mL纯净水和10l的乙酸苯乙酯作为内标物，摇匀，再加入5ml二氯甲烷，120r/min摇床机械震荡15min，静置分层，取出二氯甲烷相，浓缩至1ml ，进行气质分析。设所有检测出的物质相对于内标的校正因子9为1，采用相对定量的方法计算各致香成分的含量。 GC/MS条件 色谱柱：HP-5MS(50m0.25mm0.25m)毛细管柱；进样温度：250；不分流进样；载气：He，1 ml/min；升温程序：从50（1min）以5/ min升到250（5min）；传输线温度：250；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50-650amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。2 结果与分析2.1 酶处理条件的优化2.1.1 pH调节剂的优化 分别选用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水将烟叶碎片提取液的pH值调节至7.0，探讨pH调节剂对烟草浸膏的评吸影响，评吸结果如图2。图2 不同碱性物质调节烟叶碎片提取液pH对烟草浸膏评吸结果的影响Figure 2 The effect of different pH regulator on sense-smoking of tobacco extract 从图2中看出，用氢氧化钠调节pH值制备的烟草浸膏评吸得分最高，与其他碱性物质调节pH相比，其感官评吸优点为：具有回甜感，刺激性较低，改善余味。因此，本实验选用氢氧化钠作为pH调节剂。2.1.2 酶添加量的优化 分别添加3.0 g/L、6.0 g/L、9.0 g/L、12.0 g/L中性蛋白酶，探讨酶添加量对烟草浸膏评吸影响，评吸结果图3：图3 酶添加量对烟草浸膏评吸的影响Figure 3 The effect of enzyme concentration on sense-smoking of tobacco extract从图3看出，添加6.0 g/L酶处理所得烟草浸膏的评吸得分最高，与其他添加量的酶处理相比，其感官评吸优点为：改善余味，因此，酶的添加量确定为6.0 g/L。2.1.3 酶处理温度的优化分别选用酶处理烟叶碎片提取液的处理温度35、40、45、50、55，探讨酶处理温度对烟草浸膏评吸影响，评吸结果如图4：图4酶处理温度对烟草浸膏评吸的影响Figure 3 The effect of enzyme treatment temperature on sense-smoking of tobacco extract 从图4中看出，当处理温度为40时，所得烟草浸膏的评吸得分最高，与其他处理相比，其感官评吸优点为：香气量较高，具有回甜感，改善余味。因此，选用酶的作用温度为40。2.1.4 酶处理时间的优化选择酶的水浴时间为0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、16.0h，探讨酶处理时间对烟草浸膏评吸结果的影响，评吸结果如图5：图5酶处理时间对烟草浸膏评吸的影响Figure 3 The effect of enzyme treatment time on sense-smoking of tobacco extract 从图5中看出，酶水浴时间4h后所得浸膏的评吸得分最高，与其他处理相比，其感官评吸优点为：香气量和烟气劲头较高，干燥程度减轻。因此，选用酶的处理时间为4.0h。2.5酶处理对烟叶碎片提取物还原糖、氨基酸和蛋白质浓度的影响酶法烟草浸膏制备过程中还原糖、氨基酸和蛋白质的含量，如表2：表2 酶处理对烟叶碎片提取物还原糖、氨基酸和蛋白质浓度的影响Table 2 The effect of enzyme treatment on the reducing sugar, free amino acid and protein of tobacco extract 测定项目 加酶前（%） 加酶后（%）还原糖量21.520.3323.380.51氨基酸量0.360.071.310.12蛋白质量5.510.524.020.36在表2中，酶处理后还原糖和氨基酸含量增加，蛋白质含量减少。说明加入中性蛋白酶后，中性蛋白酶使得烟叶碎片提取物中蛋白质水解产生游离氨基酸，并且有可能提高烟叶碎片提取物中还原糖的释放。2.6 酶法浸膏和对照浸膏的成分比较 将烟叶碎片提取物用氢氧化钠调节pH值7.0后，向其中加入6.0g/L中性蛋白酶并在40水浴4h，制得烟草浸膏，按2.3的方法进行GC/MS分析，并与对照浸膏的香气物质含量进行比较。分析结果如下： 表3 酶法浸膏和对照样的成分比较Table 3 The comparation of the enzymatic extract and the control序号RT英文名化学名称匹配度对照样（%）酶处理样（%）14.031,2-Propanediol1,2-丙二醇78.580.120.1529.41Ethanol, 2,2-oxybis2,2-氧代二乙醇83.670.150.14311.36Benzenemethanol苯甲醇73.680.170.30412.802,4-Hexadienedioic acid糠酸庚酸乙酯69.380.240.14513.22Heptanoic acid, ethyl ester92.190.551.05613.43Butanoic-acid,3-methyl-,3-methylbutyl ester异戊酸异戊酯94.240.831.61714.492,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4(H)吡喃-4-酮1815.06Naphthalene,1,2,3,4-tetrahydro1,2,3,4-四氢萘76.690.25915.182H-Pyran-2-one,5,6-dihydro-6-pentyl6-戊基-2-,5,6-二氢化-2氢-吡喃68.510.260.321016.134H-Pyran-4-one,2-ethyl-3-hydroxy-2-乙基-3-羟基-4H-吡喃-4-酮85.910.251117.82B-PHENYLETHYL ACETATE乙酸苯乙酯（内标物）80.9426.9727.331220.28Pyridine,3-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-, (S)-尼古丁60.0253.0150.071323.00Benzaldehyde, 3-ethoxy-4-hydroxy-乙基香兰素62.810.180.201426.803-Hydroxy-damascone3-羟基-大马酮68.160.310.431527.08Megastigmatrienone巨豆三烯酮63.460.140.191627.512-Cyclohexen-1-one,4-(3-hydroxy-1-butenyl)-3,5,5-trimethyl-4-（3-羟基-1-丁烯）-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮 87.080.410.821728.892-Pyrrolidinone, 1-methyl-5-(3-pyridinyl)-1-甲基-5-（3-吡啶基）-2-吡咯烷酮86.670.240.321829.514-(1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol4-(1E)-3-羟基-1-丙烯基)-2-羟基苯甲醚76.260.230.141930.14Benzyl benzoate苯甲酸苄酯95.841.192.462030.462-ethenyl-4,5-(methylenedioxy)benzaldehyde2-乙烯基-4,5-亚甲二氧基苯甲醛89.300.280.362131.32-Himachalene-雪松烯68.190.420.172731.72Widdrol hydroxyether韦得醇羟基醚70.590.240.122232.613-HYDROXYSOLAVETIVONE3-羟基莎草酮74.270.120.232334.03Cyclopentacpyran-3(5H)-one, 1,4-diethyl-6,7-dihydro-1,4-二乙基-6,7-二羟基-环戊烯并吡喃-3(5H)-酮92.031.321.872434.652-Isopropyl-6,6-dimethyl-1-oxaspiro2.5octane-4,8-dione2-异丙基-6,6-二乙基-1-氧杂螺2.5 辛烷-4,8-二酮88.510.122536.97Cholestan-3-ol,2-methylene-, (3,5)-2-甲基-胆固醇87.820.350.192637.69Octadecanoic acid硬脂酸84.740.380.122738.26(1S,2E,4S,5R,7E,11E)-Cembra-2,7,11-trien-4,5-diol(1S,2E,4S,5R,7E,11E)-西松烷基-2,7,11-三己烯-4,5-二醇52838.394,8,13-Cyclotetradecatriene-1,3-diol,1,5,9-trimethyl-12-(1-methylethyl)-1,5,9-三甲基-12-(1-异丙基)-4,8,13-环十四碳烯-1,3-二醇73.190.380.302941.25Pyrazine,2,5-dimethyl-3-(3-methyl-3-butenyl)-6-(3-methylbutyl)-2,5-二甲基-3-(3-甲基-3-丁烯)-6-(3-甲丁基)- 吡嗪73.880.160.153042.15Phenol,2,2-methylenebis6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl2,2-亚甲基6-(1,1-二甲乙基)-4-甲基苯酚96.461.241.01注：符号“”表示未检出从表3看出，含吡喃、吡嗪等环状小分子结构的香气物质含量增加了50.1%，而一些对烟气不利的高分子的醇、酸和烷烃，如(1S,2E,4S,5R,7E,11E)-西松烷基-2,7,11-三己烯-4,5-二醇、1,5,9-三甲基-12-(1-异丙基)-4,8,13-环十四碳烯-1,3-二醇、硬脂酸等含量减少了45.5%，以及对人体危害性极大的尼古丁含量降低5.5%。其原因在于，中性蛋白酶处理烟叶碎片提取物，水解烟叶碎片提取物中蛋白质，释放氨基酸和还原糖，氨基酸和糖类在浓缩时发生美拉德反应，增加了含吡喃、吡嗪等环状小分子结构的香气物质，且在浓缩过程中，提取物受热后发生复杂的物理化学变化，某些对烟气不利的醇、酸、烷烃和对人体有害的尼古丁降解。3 结 语 本文研究了中性蛋白酶处理烟叶碎片提取物制备烟草浸膏的工艺。实验结果表明，酶处理的优化条件为：氢氧化钠调节pH7.0，向烟叶碎片加入6.0g/L中性蛋白酶,并在40水浴处理4h；与对照样相比，酶法烟草浸膏能使卷烟抽吸时的烟气状态得到改善，刺激性降低，残留减少；且经酶处理后，烟叶碎片提取物的还原糖和氨基酸含量增加，而其蛋白质含量减少；将酶法烟草浸膏与对照样进行成分比较，结果表明，含吡喃、吡嗪、吡啶、吡咯等环状小分子结构的香气物质含量增加了50.1%，而一些对烟气不利的高分子的醇、酸和烷烃减少了40%-50%，对人体有害的尼古丁含量降低了5.5%。因此，中性蛋白酶处理烟叶碎片制备烟草浸膏，既可以有效地利用烟叶碎片，增加其经济效益，还提供了一种制备烟草浸膏的新方法。参考文献（References）1 Meher K.K., Panchwagh A.M., Rangrass S.,et al.Biomethanation of tobacco wasteJ.Evromental Pollution.1995, 90(2):199-2022 胡小玲,岳红,管萍,等.以废次烟叶生产硫酸烟碱新方法的研究J.化学与应用.2000, 12(2):224-226 HU Xiao-ling，GUAN Ping， Studies new method of the production nicotine sulfate with inferior tobacco leaf J.Chemical Research and Application. 2000, 12(2):224-2263 胡有持,张建勋.烟叶碎片与降耗J.烟草科技.1996（5）：12-15 HU You-chi, ZHANG Jian-xun. 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