HPLC测定人血浆中紫杉醇浓度.doc

HPLC测定人血浆中紫杉醇浓度中国色谱网(2010-7-20 14:12:04) 摘要目的：建立人血浆中紫杉醇HPLC测定法，为人体内药代动力学研究和药效学评价提供方法学基础。方法：取血浆300l，以地西泮为内标，采用有机相(叔丁基甲醚)两步提取。常温下氮气吹干，残渣用移动相溶解，进样20l。色谱条 件：Shim-PackCLC-ODS柱；流动相：甲醇-乙腈-水(254039)；流速为1.2ml*min-1，检测波长227nm。结果：本法在0.035.00mg*L-1间线性良好，相关系数r=0.9999(n=7)。高中低浓度的3个质控样品日间内变异性RSD都在2.31%4.90%之间，回收率在97.4%103.3%之间，血浆最低检测浓度为0.008mg*L-1。结论：本方法能简便、准确地测出血浆中微量药物的含量，适于研究需要。紫杉醇被誉为90年代抗肿瘤药三大成就之一，对铂耐药的卵巢癌疗效较好，作为应用于临床的新型药物，它既是妇科卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌的 一线用药，也是肿瘤晚期仍行之有效的化疗药物，临床上对其给药方案和剂量确定有许多不同的观点，仍需借助药-时数据进行客观的评价。低浓度紫杉醇测定一直 是困扰研究的大问题。国外文献报道的固相提取和预柱分离过程需要较高的成本，技术要求复杂，因而限制了对紫杉醇的研究。我们建立了测定人血浆中紫杉醇的 HPLC法，取样量小，灵敏度高，快速简便。为确定合理的治疗方案和治疗剂量，以及药代动力学分析和药效学评价提供了方法学基础。1、材料与方法1.1 仪器与色谱条件美国Warters-M510泵和U6K进样阀；日本岛津SPD-2AS型可变波长紫外检测器和C-R2AX数据处理 机；100lHamilton进样器(美国)；液体混合器(UpwardsBiosystemsLtd.，台湾)；LG15-W高速微量离心混合器(上 海)；PING-PONG卧式振荡器(BlockScientific，德国)；Milipore超纯水系统(法国)。Shim-PackCLC-ODS 柱(6.0mm150mm)，流动相：甲醇-乙腈-水(254039)，流速为1.2ml.min-1，检测波长为227nm，纸速 2mm.min-1，室温下操作，检测灵敏度0.0005AUFS。1.2 药品与试剂紫杉醇对照品(中国医学科学院药物研究所)；地西泮对照品(北京市药品检验所)；叔丁基甲醚(瑞士FlukaChemicAG)，甲醇和乙腈(北京昌化精细化工厂，色谱纯)；水为实验用超纯水。1.3 储备液紫杉醇标准品适量制成200mg.L-1的溶液(甲醇-水=41)，410储存备用，每4周配一次。地西泮水溶液(1.2mg.L-1)作为内标。1.4 样品处理1.4.1 血浆样本精密吸取待测血浆300l置于1.5ml具塞塑料离心试管中，先后加入20l1.2mg.L-1内标和1ml叔丁基甲醚，于卧式振荡器上混合 3min后，3000g离心3min，将800l上清液移至另一1.5ml的具塞塑料试管中。用800l叔丁基甲醚，重复上述操作合并上清液，氮气 吹干，溶于120l流动相中，吸取20l进样。1.4.2 标准曲线的制备用空白血浆分别配制浓度为0.03，0.10，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00mg.L-1的紫杉醇血浆标准系列。其余操作同血浆样本处理过程。以紫杉醇浓度c为横坐标，紫杉醇峰高与内标峰高之比为纵坐标绘制标准曲线。1.4.3 质控样品以配血浆标准样品同样方法，另行配制紫杉醇的质控样品，浓度分别为0.25，2.50，4.00mg.L-1。它们将作为“未知样品”随机分散于 每批待测血样和血浆标准样品进行测定，以每次的标准曲线计算出质控样品测定浓度。以质控样品测定浓度与标示浓度的比值计算方法的精密度、重现性和回收率。2、结果2.1 色谱行为紫杉醇在227nm处显示最大吸收。选用227nm作为检测波长时，所用色谱条件下基线波动小，紫杉醇和内标峰形尖锐。空白血浆层析图谱中对应紫杉醇和内标的保留时间12.2min和9.7min处无峰出现，与各杂质峰分离良好。2.2 线性关系和灵敏度血浆中紫杉醇浓度在0.035.00mg.L-1范围内，r=0.9999(n=7。检测器灵敏度为0.0005AUFS，以基线噪音3倍计算，最低检测浓度为0.008mg.L-1。2.3 精密度和重现性制作血浆标准曲线，按血样项下操作，测定质控样品浓度，考察批内和批间变异。分试管制作同浓度样品，测定批内误差，日内变异性，结果见表1。一批同浓度样品系列分散在2周内同上制作，测定批间误差，日间变异性。2.4 方法回收率高、中、低3个浓度的质控样品按未知样本随标准曲线同时测定，计算出质控样品的批内，批间和回收率数据。不论方法质控，还是每次的样品测定，均附带一套标准曲线和质控样品数据。2.5 干扰试验我们对地塞米松、西咪替丁、苯海拉明等临床与紫杉醇合用的辅助药物进行了考察，结果表明，这些药物在紫杉醇和地西泮的保留时间处均无峰出现。3、讨论3.1 在相对较低的UV波长测定时一般要求生物样品提取尽可能完全和干净。因此文献多采用固相提取和预柱分离，操作手段繁杂，技术要求高。通过试验表明，叔丁基 甲醚是紫杉醇良好的提取剂。在样本的提取过程中，采用适当体积的有机相两次提取浓缩方式，令紫杉醇富集，标准曲线的浓度可低至0.03mg*L-1，且紫 杉醇和内标出峰处无杂峰干扰。我们采用的这种提取的方法操作简便，不需要配置固相分离柱，能较好适应目前大多数实验室条件，同时也保证了检测灵敏度。3.2 目前国外文献所用内标大多采用cephalomanmine，N-cyclohexyl-benzamine，2，-benzyl-2，2- dimethyl-propionanilide3种，多为厂家直接提供，价格昂贵。在色谱条件下，还要通过梯度洗脱，才能与紫杉醇之间产生一合适的分 离。经过多次尝试，发现地西泮作为内标，在本流动相下，峰型尖锐，与紫杉醇分离良好，出峰时间较短，工作效率提高。且此药物价格便宜，易于获得，有利于国 内研究单位开展工作。此外文献方法所用血浆多在0.5ml左右，这样临床采血量将相应增加。本方法以较少血浆就能满足测定需要，最大限度地减少病人痛苦。信息来源：中国色谱技术网欢迎您下载我们的文档，后面内容