a-淀粉酶的生产工艺.doc

宜宾职业技术学院宜宾职业技术学院 论文 -淀粉酶的生产工艺 系系 部部 生物与化工工程系 专专 业业 名名 称称 酿 酒 技 术 班班 级级 酿 酒 11103 姓姓 名名 王梦韵 李艳梅 严红俊 学学 号号 201117315 201117404 201117346 指指 导导 教教 师师 兰 小 艳 二二一二年十月二十九日一二年十月二十九日 - -淀粉酶的生产工艺淀粉酶的生产工艺 摘要 -淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽 糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆 饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图， 详细的介绍了-淀粉酶的生产工艺。 关键词：关键词：-淀粉酶；生产工艺设计；深层发酵法 Alpha amylase production technology Abstract Alpha amylase widely distributed in animals, plants and microbes, can be hydrolyzed starch produce dextrin, maltose, oligosaccharide and glucose and so on, it is the industrial production in the most widely used one of enzyme preparation. At present, the alpha amylase has been widely used in modified starch and starch sugar, baking industry, brewing, alcohol industry, hair leaven and textile and many other industries. The design of amylase fermentation, respectively with corn flour for carbon source, nitrogen source for bean cake, with BF - 7658 bacillus subtilis strains for the production, at the same time, make the production process flow diagram, detailed introduces the alpha amylase production technology. Keywords: Alpha amylase, Production process design; Deep fermentation 目录目录 前言1 1 -淀粉酶的生产方法1 1.1 生产方法的选择.1 1.2 -淀粉酶培养基的制作. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 1.2.1 耐高温 -淀粉酶的生产方法. .4 1.2.2 耐高温 淀粉酶的生产原料. 4 1.2.3 耐高温 淀粉酶培养基制作. 5 1.2.4 耐高温 淀粉酶的另一种生产方法.5 1.2.5 用菌种枯草芽孢杆菌来提取耐高温 淀粉酶.5 2 -淀粉酶的菌种选育6 2.1 菌株与培养方法.6 2.1.1 培养基 .7 2.1.2 仪器设备 .7 2.2 实验方法 .7 2.2.1 细菌的分离与初步鉴定.7 2.2.2 紫外线诱变育种7 2.3 诱变方法以及变异菌株的筛选.7 3 -淀粉酶分离纯化8 3.1 -淀粉酶的分离.8 3.2 实验方法9 3.2.1分析和测试方法.10 4 讨论10 5 结论10 第 1 页 前言 根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为-淀粉酶、-淀粉酶、葡 萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。其中，-淀粉酶（-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是 胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的-1，4糖苷键，而 生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为-构型，故称-淀粉酶。 -淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到 高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最 为广泛的酶制剂之一。它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。不 同来源的-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌淀 粉酶。目前，-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、 酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。如在淀粉加工业 中，微生物-淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒 率。其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提 高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。 相对地，关于-淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道。-淀粉酶抑制剂 是糖苷水解酶的一种。它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食 物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖份吸收、降低血糖和血脂的含量， 减少脂肪合成，减轻体重。有报道表明，-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的 耐糖量。这一领域研究自2O世纪8O年代和9O年代十分活跃，但目前-淀粉酶抑 制剂的研究工作仍处于基础阶段，至今仍未得到有效合理的开发应用。 -淀粉酶的生产工艺淀粉酶的生产工艺 1 -淀粉酶的生产方法淀粉酶的生产方法 1.1生产方法的选择生产方法的选择 枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型-淀粉酶菌种，国内普遍采用深 层发酵法生产工业粗酶。我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱 变，选育适用于固体发酵的新菌体BF76581。该菌为短杆状，革兰氏阳性， 两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿 润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。 第 2 页 固体培养枯草杆菌BF76581生产-淀粉酶 将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37培养三天，然后转接到种子液体培养 基上 （豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间， 当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆 饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到3840）在厚层通风 制曲箱内，通风保持3742，培养48小时出曲风干。 麸曲用1食盐水34倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵 溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40烘干、磨粉即为成品。 深层发酵法生产-淀粉酶 斜面菌种制法同前。将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同 前种子培养基），37培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。然后 接种到500升种子罐，37搅拌通风培养1214小时。当菌体进入对数生长期 （镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液 =6.36.8，酶活510单位毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37，通风， 搅拌，培养4048小时。中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的 13，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。停止补料后68 小时罐温不再上升，菌体衰老，80形成空泡，每23小时取样分析一次，当 酶活不再升高，可结束发酵。而后向发酵液中添加 2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，5055加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶， 促使胶体凝聚而易于过滤。冷却到35，加入硅藻土为助滤剂过滤。滤液加 2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析， 盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于40烘干，磨粉而成。按此工艺，由酶液到粉 状酶制剂的收率为70。 对于固体发酵有以下缺点： 1. 限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较 适合于真菌。 2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生 产时，常限制其大规模的产能。 3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体 第 3 页 发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件 不易一致，再现性差。 4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到 均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观 察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。 6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。 7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。 而对于发酵罐深层培养具有生 产周期短、产量高、效益大等优点故选用层发酵法生产-淀粉酶。 1.2 -淀粉酶培养基的制作淀粉酶培养基的制作 （1）培养基的类型 培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可 以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用 到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。 （2）孢子培养基 孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对 这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会 引起菌体变异。对孢子培养基的要求：营养不要太丰富；所用无机盐的浓 度要适量；注意培养基的pH和湿度。 -淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5、豆饼粉3、蛋白胨0.25%、 琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。 （3）种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮 成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生 素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体 生长和繁殖。 -淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化 钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.17.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。 （4）发酵培养基 第 4 页 发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求， 使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的 能力，但要注意成本和能耗。 -淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70、小米糠20、木薯粉10%、烧 碱0.5%，加水使水量达60，常压蒸汽灭菌1h. 本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下： 孢子锥形 瓶种子罐发酵罐 （1）孢子制备 将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形 瓶中，在35静置培养24天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。 (2)种子制备 将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加 MgSO47H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.77.0），37培养3天。然后接入到 20L种子罐，37搅拌，通风培养1214小时。此时菌种进入对数生长期（镜 检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.36.8,酶活510U/mL），再接种到发酵罐。 (3)发酵罐培养 培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6、豆粕水解液 67、Na2HPO412H2O0.8、(NH4)2SO4 0.4、CaCl2 0.2、NH4Cl0.15、豆油1kg、深井水20L，调pH至 6.57.0。 发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%5%种子培养成熟液。培养条件 为：温度371，罐压0.5kgcm2，风量120h 为1：0.48vvm，20 h后 1：0.67vvm，培养时间为 28 36 h。 1.2.11.2.1 耐高温耐高温 -淀粉酶的生产方法淀粉酶的生产方法 耐高温 淀粉酶生产工艺，采用地衣芽孢杆菌为菌株，通过一级种子罐 发酵、大罐发酵、过滤、成品处理制得。 1.2.21.2.2 耐高温耐高温 -淀粉酶的生产原料淀粉酶的生产原料 有采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1.5 吨种子罐发酵 ，玉米 淀粉 6%10%，玉米浆 1%3%，豆粕 2%5%，磷酸二氢钾 0.3%0.6%，磷酸 第 5 页 氢二钾 0.5%2%，柠檬酸钠 0.1%0.3%，35 吨发酵罐发酵, 玉米淀粉 15%30%， 玉米粉 5%10%，豆粕 1%8%，玉米浆 2%5%，磷酸二氢钾 0.1%0.8%，磷 酸氢二钾 0.8%2%，柠檬酸钠 0.05%0.4%等。 1.2.3 耐高温耐高温 淀粉酶培养基制作淀粉酶培养基制作 （1） 选取菌种：采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)。 （2） 1.5 吨种子罐发酵 ，培养基配方：玉米淀粉 6%10%，玉米浆 1%3%， 豆粕 2%5%，磷酸二氢钾 0.3%0.6%，磷酸氢二钾 0.5%2%，柠檬酸钠 0.1%0.3%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后 pH6.2-6.5；用茄子瓶接入种母，温度 371，通风量 25-40m/h，pH 值 6.4，培 养时间 24-36 小时。 （3） 35 吨发酵罐发酵，培养基配方：玉米淀粉 15%30%，玉米粉 5%10%， 豆粕 1%8%，玉米浆 2%5%，磷酸二氢钾 0.1%0.8%，磷酸氢二钾 0.8%2%，柠檬酸钠 0.05%0.4%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温 淀粉酶液化，pH6.2-6.4；温度 421，风量 400-1000m/h，pH 值 6.4-6.8，培养 时间 80-100 小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为 150280g/L 为 发酵初糖浓度，以质量百分比 40%70%的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在 DE 值降至 1060mg/ml 时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持 发酵液中 DE 值约为 1060mg/ml，控制总糖浓度达到 220320g/L 时停止补料。 （4） 提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用超滤膜浓缩，保持 料液浓缩过程中温度 2045；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预 涂工艺进行过滤除菌，最终生产出成品。 1.2.41.2.4 耐高温耐高温 -淀粉酶的另一种生产方法淀粉酶的另一种生产方法 向成熟的发酵液中加入占发酵液重量 1-3的钙离子保护剂或 2-5淀 粉中的至少一种，在 70-90的条件下，进行热处理。将制得的纯化的耐高温。 淀粉酶送至压力喷雾塔进行喷雾干燥，制得酶粉，将酶粉调配后，分装即得成 品。该耐高温。淀粉酶呈固体状态，酶活力达 2 万单位g 以上，具有较高的 稳定性，易贮存和运输。 1.2.5 用菌种枯草芽孢杆菌（用菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T2 来提取耐高温来提取耐高温 淀粉酶淀粉酶 第 6 页 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一， 主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产 淀粉酶的枯草 芽孢杆菌 T2 生产 淀粉酶。 （一）用此菌种来提取 淀粉酶的生产原料 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T2，蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可 溶性淀粉 2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。 （二）此培养基的制备 1.培养基的制备与灭菌 发酵培养基：蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可溶性淀粉 2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。分装于 100mL 锥形瓶中，每瓶 50mL，121灭菌 20min。 2.接种与产酶培养 接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培 养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。 37振荡培养 48 h。 3.离心 将发酵液置高速冷冻离心机中 10000r/min 离心 10 min，除菌体，上清液即 为 淀粉酶粗酶液。 此此上上所所诉诉由由王王梦梦韵韵所所做做 2 -淀粉酶的菌种选育淀粉酶的菌种选育 -淀粉酶生产：以枯草芽孢杆菌 14140 为出发菌株,经亚硝基胍反复多次处 理和筛选生产 -淀粉酶。分离纯化：以 CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统, 通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最佳反应条件为：萃取温度 40，水 相组成为 NaCl0. 03 mol/L，pH 12. 0，有机相：无机相=12，振荡时间 10 min；反萃取最佳条件为：温度 60，水相组成为 KCl3 mol/L，pH 4. 0，有机 相无机相=21，反萃取振荡时间 10 min。在上述条件下，经过一个萃取与 第 7 页 反萃取循环后，-淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。 2.1 菌株与培养方法菌株与培养方法 2.1.1 培养基培养基 BY 斜面培养基每 100 g 含可溶性淀粉 1 g ，牛肉膏 1 g，蛋白胨 1 g，酵母 膏 0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂 2 g. BY 发酵培养基每 100 g 含可溶性淀粉 5 g，牛肉 膏 1 g，蛋白胨 1.5 g，酵母膏 0.2 g，NaCl 0.5g，CaCl21 g。调节 pH7.0，经 121，灭菌 30 min，备用。 2.1.2 仪器设备仪器设备 全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心 机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH 试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试 管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、 记号笔等。 2. 2 实验方法实验方法 221 细菌的分离与初步鉴定：细菌的分离与初步鉴定： 将土壤系列稀释，把 10-3 、 10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27倒 置培养 2 天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养 2 天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算 D/d 值。保菌供下次实验 用。 222 紫外线诱变育种：紫外线诱变育种： 取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其 表面；用紫外线处理平板 0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理 2 次 重复；放到黑暗中倒置培养，37培养 48h，分别计数诱变组和对照组平板上 的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈 直径和菌落直径，计算 D/d 值；将 D/d 值最大的菌种保存到斜面培养基上。 2.3 诱变方法以及变异菌株的筛选诱变方法以及变异菌株的筛选 诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。 以 NTG 为诱变剂，按一定处理剂量 (g/ml)，在一定 pH 值的缓冲液中 30恒温振荡处理 14 h。 第 8 页 经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。 经稀释涂布在含有 1%淀粉 BY 固体培养基上，经 24 h 培养形成小菌落。 把单菌落分别移植于含 2%淀粉 BY 液体培养基中，30培养 36 h。 用 2#定性滤纸制成 5 mm disc(小圆纸片)，并用 2%琼脂 BY 培养基灭菌 后加入较大剂量青霉素(抑菌)。倒入 200 mm300mm 长方形不锈钢玻璃培养皿 中，冷却凝固。然后把 5 mm disc 纸顺序放在培养基表面。 用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的 disc 上。把 disc 培养皿经 37，24h 分别培养。 把 KI-I2 液用喷雾器均匀分布在 disc 培养皿培养基的表面上，并挑出淀 粉水解圈大的 disc，用相对应的 1 ml 培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。 把各种斜面菌株经活化培养，接种于 1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较 实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。经菌种诱变选育 -淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经 NTG 反复多次处理，并经淀粉水解圈 初筛和摇瓶复筛，来选育 -淀粉酶高产菌株。 经 NTG 反复多次处理，-淀粉酶活力有较大幅度提高。在经 5 次 NTG 处 理之后，其变异株 -淀粉酶活达到 34 200 (U/ml)，较出发菌株提高了 4.2 倍以 上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。经 NTG 处理所得的变异菌株的 产酶稳定性较差,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定 性好的菌株。 此此上上所所诉诉由由李李艳艳梅梅所所做做 3 -淀粉酶分离纯化淀粉酶分离纯化： -淀粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离 纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法 3.1 -淀粉酶的分离和纯化淀粉酶的分离和纯化： 第 9 页 高纯度 淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机 理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化 淀粉酶的方法很多，一般都是依 据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质 建立的。要得到高纯度 淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。 盐析沉淀、 凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质 分离纯化的主要方法。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳， 对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯 级的超耐热耐酸 一淀粉酶，纯化倍数为 11.7，活力回收率为 29.8%。 但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。 反胶团 萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进行、分离与浓缩同步进行、操作简单 和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活。以 CTAB /正丁醇/异辛 烷构成反胶团系统，通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最佳反应条件为: 萃取温度 40 ， 水相组成为 NaCl 0.03 mol/L，pH 12.0，有机相：无机相= 1：2， 振荡时间 10min； 反萃取最佳条件为:温度 60， 水相组成为 KCl 3 mol/L，pH 4.0,有机相：无机相= 2：1， 反萃取振荡时间 10 min。在上述条件 下，经过一个萃取与反萃取循环后，淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。双水相 技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相 系统 PEG磷酸盐分离纯化 淀粉酶，增加 PEG 浓度有助于酶富集上相。同 样用 PEG磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温 一淀粉酶，分配 系数及回收率分别为 4.8 和 87。采用 PEG(聚乙二醇)硫酸铵双水相体系， 进行分离纯化 淀粉酶，结果表明，在室温下由 PEG 和硫酸铵所组成的双水 相体系，对 淀粉酶的回收率可达 94.84，分配系数可达 17.10。双水相技 术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很 多问题。为了获得高纯度的 一淀粉酶，开始人们利用软基质的离子交换色谱 和亲和色谱分离纯化了 -淀粉酶的粗酶提取液。但是，软基质色谱介质的机械 强度小，受压易变形，分析速度慢，分离效率低，柱寿命短，固定相对 PH、离 子强度和压力非常敏感，反复使用时配体碎片容易脱落。由于以上缺点，软基 质色谱有逐渐被硬基质色谱取代的趋势。在硬基质色谱应用方面，李华儒等首 次合成一种对 一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质，并成功地分离纯化了 第 10 页 工业粗酶，获得了高纯度产品，其活性回收率88%，Kato 等也用高效疏水色谱 纯化了 -淀粉酶粗品，回收率为 90%。之后其采用高效液相离子交换色谱纯化 一淀粉酶很好地分离了 一淀粉酶粗品， 其活性回收率高达 96%，比活性达 388/mg 蛋白质。此法的研究成功为大规模制备高纯度 一淀粉酶提供了一个 新工艺路线。 3.2 实验方法实验方法 （1）反胶团系统的配置 将适当比例的正丁醇和异辛烷加入比色管，摇 匀。再加入适量 CTAB，放入加热套中加热溶解，摇匀，使其均匀分布于有机 相，得到澄清透明稳定的反胶团系统。 （2）前萃取 将 -淀粉酶溶解于不同缓冲液中，稀释，并用 4 层洁净 纱布滤清。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH(pI)，构成初始水相。将反胶团相和 水相置于 50 mL 带塞三角烧瓶中，在振荡器上剧烈摇晃后(250 r/min, 10 min)， 倾入离心管，进行离心(3 500 r/min, 5 min)，用滴管小心地将两相分开取上层有 机相待用。 （3）反萃取 用去离子水配制适当 pH 值(pHpI)和离子强度的缓冲液 作为反萃取水相，与前萃取所得的有机相混合，放入恒温水浴锅加热片刻，在 振荡机上剧烈摇晃后(250 r/min，10 min)，倾入离心管，进行离心(3500 r/min，5 min)。用滴管小心地将两相分开，下层水相即为纯化的淀粉酶。 3.2.1 分析和测试方法分析和测试方法 （1）-淀粉酶活力的测定，采用国标 QB/180393，对萃取前的粗酶以及萃 取后的精制酶的酶活力