实验药理学-第四篇1体内过程研究.doc

50第四篇 药物体内过程研究第四篇 药物体内过程研究第二十章 药物体内过程研究方法许多体外研究认为很有前途的候选化合物，因在体内活性很低甚至无体内活性或体内具有较大毒性而夭折，造成极大的人力和财力浪费。缺乏体内活性可能是由于其药动学性质不理想：如首过效应较强或不易通过肠粘膜被吸收，生物利用度太低；或代谢太快，半衰期太短；或不易通过生物膜而进入靶器官。体内的毒性则可能是由于其在体内形成的毒性代谢物所致。据文献报道进入临床试验后约有40%的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的，这足以说明了解药物体内过程在创新药开发研究中的作用。一个候选化合物不仅要有较高的体外活性，还应具有理想的药动学性质，即较高的生物利用度和理想的半衰期。因此，在新药开发的早期阶段，可利用各种体内和体外模型对候选化合物药动学进行初筛，以便在研究开发早期就确定该候选化合物是否有继续开发的价值，并可根据筛选结果对先导化合物进行结构改造或修饰，以获得具有良好药动学特性的新候选化合物。最优的候选化合物是从一次次的优化循环中诞生的，每一次的优化循环都通过药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步合成或结构改造。这样循环往复最终产生具有良好的药理学、毒理学和药动学特性的最佳候选化合物，进入下一步的临床研究。第一节 药物体内吸收特征预测研究现代药物研发成功与否，与药物的体内过程密切相关。目前，人工合成和筛选有限数量的化合物已被大规模的化合物合成和高通量筛选所取代。无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。目前，被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。一、Caco-2细胞跨膜吸收转运模型（一）Caco-2细胞结构、功能特征Caco-2细胞模型最初是由Borchardt和Workem在1989年提出的。1与小肠有相似的酶表达：该细胞系源于人体结肠癌细胞，其结构和生化作用都类似于人小肠上皮细胞，含有与刷状缘上皮细胞相关的酶系，如-谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、谷肽甘肽-S-转移酶、磺基转移酶、细胞色素P-450酶系。与小肠主动转运相关的12种转运系统（如糖、氨基酸、二肽、胆酸、维生素B12）也都在Caco-2细胞内表达。2与小肠有相似的细胞结构特征：其来源于人的直肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，这些性质可以恒定维持约20天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。（二）用途1研究药物小肠吸收的标准工具利用人小肠上皮Caco-2细胞单层来进行药物小肠吸收的细胞水平实验，现在已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准筛选工具。评价新药的吸收，如新药为水溶性很差的化合物，则药物性质决定其不能制作成注射剂。为了改善其口服吸收生物利用度，国外研究人员使用了一些吸收增强剂，用Caco-2细胞来评价其吸收程度取得较好的结果。还有研究者使用Caco-2细胞模型评价了系列难溶性药物磷酸酯前药与其母药的吸收度，这些药物包括可的松、苯妥英等。结果发现，苯妥英等药物磷酯化后吸收大为增加，而可的松磷酯化后吸收程度有显著改变，这些结果在其他模型上也类似。在研究药物赋形剂对药物吸收的影响时，同时使用了Caco-2细胞模型和大鼠离体肠道进行评价，两模型的结果一致。这些都表明Caco-2细胞模型在新药吸收评价方面的重要价值。2预测吸收过程中的药物相互作用Caco-2细胞中存在有与小肠上皮相同的各种转运系统、代谢酶，因此可以用来作为研究与吸收相关的药物相互作用的体外模型。小肠上皮的代谢、受体介导的转运、P-gp对药物分子的泵出，是一个饱和过程。联合用药时，因为有可能存在药物竞争酶、载体或P-gp泵的作用，所以会与单独给药时的生物利用度存在差异。这种药物吸收过程中存在的相互作用可以应用Caco-2细胞模型进行研究。此外，与药物吸收有关的相互作用还可来源于代谢酶、载体、P-gp泵被特定药物重复给药引起的诱导。当药物经细胞转运途径被吸收时，P-gp泵成为药物吸收的一个重要生化屏障，它把进入细胞内的药物泵出，从而减少了药物的吸收，因此成为口服药物生物利用度低、波动大的一个重要影响因素。具有这种P-gp泵出性质的药物分子在与P-gp泵抑制剂共同口服给药时，其透过细胞膜吸收的程度增强。3研究吸收机制Caco-2细胞除了在吸收评价方面的大量应用外，也比较适合用于吸收机制的研究。有研究者分别利用Caco-2细胞作为钠和铁吸收的模型细胞，结果发现，脂筏(lipidraft)在决定PI3K/AKT2信号转导过程中起到重要作用，包括增加了肠道的Na吸收。4药物小肠代谢研究 人体小肠中存在着丰富的细胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到该组织中所有细胞色素P450同工酶的约50%，而其在Caco-2细胞单层中的表达已见报道。与人体小肠甚至空肠微粒体相比，Caco-2细胞中的细胞色素P450同工酶为低水平表达，这是限制其作为口服给药化合物的小肠一相代谢研究模型的一个因素。为了克服这一局限，国外研究人员等利用1，25-二羟基维生素D3处理过的Caco-2细胞单层作为研究小肠代谢动力学首过作用的体外模型。当将该系统应用于研究细胞色素P4503A4底物咪唑安定的代谢动力学时，显示出与体内研究相似的结果。尽管细胞色素P450同工酶在Caco-2细胞中的表达水平较低，但其他许多药物代谢酶的表达水平不经诱导就可以用于药物小肠代谢的研究。比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、磺基转移酶和儿茶酚-O-甲基转移酶等在Caco-2细胞中仍保持其功能特点。在这些酶中，二相磺基转移酶和葡萄糖醛酸转移酶对于口服给药化合物的生物利用度尤其重要，因为具有药理活性的化合物与它们发生结合反应后通常会导致活性降低或消失。例如，人们已经发现在Caco-2细胞中，类黄酮物质5，7-二羟黄酮产生硫酸盐和葡(萄)糖苷酸的变化，5，7-二羟黄酮硫酸盐的产生速度是其葡(萄)糖苷酸化的两倍。类似研究也表明，Caco-2细胞模型中酶的表达可以使其应用于药物的小肠代谢研究。（三）研究方法对Caco-2进行药物吸收研究采用transwell培养板，含有两个小池，在里面的小池底部有一层多孔渗水的半透膜，Caco-2细胞培养在半透膜上生长成单层汇合细胞。实验时，将化合物加入上面的小池内，然后定时检测下面小池内药物浓度。从而得出表现渗透参数。单细胞层的完整性可以通过测定跨细胞层电阻，或测定低渗透参照化合物如PEG4000的转运率来衡量。在P-gp抑制剂异搏定存在和缺乏时，通过测定P-gp的底物罗丹明123（Rhodamine123）123的转运率可以确定P-gp的表达水平。（四）注意事项但在应用这一模型时应注意，对于高通透性（即吸收良好）的候选化合物而言，其体内外的吸收往往具有良好的相关性，而对于中、低高通透性的候选化合物而言，其体内外的吸收的相关性不如前者。因为有些低分子量且水溶性好的候选化合物在体外表现出较低的通透性，而在体内却吸收良好，这是由于这类化合物可能存在细胞旁通道或某种主动转运机制。Caco-2细胞模型虽已被广泛用于体外吸收研究，但相对于高通量筛选的要求而言，其仍显得很费时，因此近年来一直在对其不断地加以改进，并建立了一些新的细胞模型，期望能够提高其筛选效率，以便其更适合于高通量筛选。如采用3天的Caco-2细胞模型，3天的MDCK细胞模型、HT29细胞模型。（五）存在的问题细胞培养时间过长（21天）：该模型本身为纯细胞系，缺乏在小肠上皮细胞中的黏液层；缺少细胞培养标准以及试验操作标准，使结果有时缺乏可比性；由于Caco-2细胞来源于人结肠，因而该细胞的转运特性、酶的表达以及跨膜电阻相对更能反映结肠细胞而非小肠细胞。二、基于P-gp药物吸收体外转运载体模型在肠上皮细胞上还存在一种特殊的转运分子P-gp，它定位于胃肠道细胞的膜表面。凡是能被P-gp识别作为底物的药物在通过其他途径进入细胞后，还会被P-gp通过一个耗能的过程挤压出细胞。因此，转运载体（如P-gp）在药物的吸收转运中扮演了重要的角色。由于分子生物学技术的迅速发展，使可以在体外进行转运载体分子的异种表达并在体外用于药物的转运的研究。目前已经建立的Caco-2和L-MDR1模型可以在体外表达P-gp，这些模型适合于体外转运的高通量筛选，如用于由P-gp导致的口服生物利用度降低或改变的药物高通量鉴别。此外，可采用稳定的细胞株在体外表达高水平的摄取转运载体，如有机阴离子转运蛋白（OATP），现已经可以使用克隆和细胞转染技术在体外表达制备并用于有机阴离子转运研究。膜囊泡和分离的肝实质细胞技术也可用于高通量筛选。第二节 药物体内分布特征预测研究药物被吸收进入血液循环后，会与血浆蛋白结合，而非结合的游离型则通过生物膜移行至各组织，而后与药物作用部位发生反应，显示其药效。药物与血浆蛋白和不同组织蛋白的结合能力以及各个组织细胞膜对药物的转运能力都影响分布过程。药物在某个组织中的富集可以被用来靶向给药，也可能会导致组织中毒。一、药物与血清蛋白结合模型药物在血流中转运时，一部分是以游离溶解于血液中，另一部分则与血液的多种成分（如血浆蛋白和血细胞）相结合。决定血浆中结合药物与非结合药物比率的主要因素是药物分子和蛋白质分子间的可逆性相互作用。多种血浆蛋白能与药物相结合，如白蛋白、1-酸性糖蛋白和脂蛋白是重要的蛋白质。酸性药物易与白蛋白结合，而碱性蛋白则易与1-酸性糖蛋白和脂蛋白结合。目前用于药物与血清蛋白研究的体外方法主要有：平衡透析、超滤、凝胶过滤、光谱法和光学生物传感器。平衡透析、超滤和凝胶过滤的特点是，将与蛋白结合的药物与未结合的药物分开，从而便于衡量药物与蛋白的结合率。通常药物是小分子，而蛋白是大分子，平衡透析法采用半透膜将药物和蛋白分在两个小室内，只有小分子可以透膜，达到平衡后测量两室内药物的浓度；超滤法采用超滤膜，将离心管隔开，药物与蛋白混合液加在上室内开始离心，蛋白分子不能透膜，与蛋白结合的药物分子也不会被离心到下室，只有游离的药物分子能进入下室；凝胶过滤是通过凝胶渗透层析将蛋白与小分子药物分离开。光谱法是通过蛋白与药物结合后的光吸收改变来测定与蛋白结合的药物的量，这种方法只在特殊的情况下才能使用。光学生物传感器使用表面等离子体共振技术，主要用于探测生物分子间的相互作用，因而可用于药物开发的许多过程中。该技术可筛选针对某一靶位点的先导化合物，也可检测药物与蛋白包括酶的结合能力。二、药物向各组织分布的模型目前在这方面没有有效的体外模型，比较类似的是考虑各组织的生物膜组分不同，建立相应的人造生物膜，用于分析药物在血液与人造生物膜的分布系数，从而衡量药物向组织分布的能力。但由于生物膜上的蛋白受体不可能很好的模拟，这样的结果可信度并不高。这主要用于建立数据分析药物的理化性质参数与分布之间的关系。三、透血-脑脊液屏障模型在所有组织中，脑组织比较特殊，脑循环毛细血管内皮细胞相互接触紧密，并有重叠，而且毛细血管还被神经胶质细胞所包裹，构成血-脑脊液屏障。药物要透过血-脑脊液屏障才能进入脑组织。模拟血-脑脊液屏障的模型，主要是采用脑血管内皮细胞和神经胶质细胞的共培养物。目前有采用来自于不同动物的细胞以及不同建系方法建立的多种共培养物。神经胶质细胞可以诱导血管内皮细胞维持体内的紧密连接。仍可采用transwell培养板的方法，先在下层小池底部接种神经胶质细胞，培养23天后，再在上层小池底部的膜上接种血管内皮细胞，经培养可形成紧密连接的单层细胞。也可将神细胶质细胞接种于上层小池的膜底部。研究药物的穿透能力也是在上层小池内加入药物，过一段时间再测外面大池内药物浓度。血管内皮细胞培养物的接触紧密性可通过跨膜电阻及参照化合物的转运率来确定。细胞共培养物可通过荧光和电镜的方法加以细胞形态鉴定，也可通过免疫检测，观察血管内皮细胞上表达的特有标记蛋白CD51、CD62P和CD71。通过比较可发现采用该模型得出的参数与体内实验结果有较大相关性，可以用于研究药物透过血-脑脊液屏障能力，对设计作用靶点位于脑部的药物提供帮助。目前该法已被一些制药公司使用。第三节 药物代谢特征预测研究一、药物代谢预测意义大部分药物进入体内后会被代谢，然后以代谢物的形式排出体外，不经代谢直接以原药形式排出体外的很少。药物在体内的代谢主要有两步，第一步为I相反应，其间药物被氧化、还原或水解为极性更大的代谢物，催化I相反应的关键酶即为P450酶；第二步为II相反应，在此反应中，药物及其代谢物与内源性物质结合。催化II相反应的酶较多，重要的有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶，N-乙酰基转移酶等。由P450酶所催化的I相反应是药物在体内代谢的关键一步，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，可影响药物的生物利用度；而药物在体内的药动学个体差异往往是由于参与代谢的P450酶活性存在较大个体差异所致。药物代谢与否决定了药物的代谢稳定性、药物的相互作用以及药物的毒性等。代谢过快则血药浓度难以维持在有效水平上，代谢偏慢会导致半衰期增加而容易达到中毒剂量。同时服用不同的药物会引起药物间的相互干扰，使代谢产物增多或减少，也可能使毒性增大或减弱。一个候选化合物是否存在肝脏或肠道的首过效应是影响其口服生物利用度的一个非常重要的因素，尤其是I相代谢反应中P450酶所介导的氧化代谢反应。许多候选化合物在体外具有很高的活性，但由于其具有非常明显的首过消除，在体内疗效较差甚至无效。因此在创新药物开发研究的早期阶段就必须了解候选化合物是否存在肝脏或肠道的首过消除。二、药物代谢研究常用方法肝脏是药物的主要代谢器官。在体外研究中，肝细胞及微粒体、细胞质部分、S9部分、肝碎片和分离的肝实质细胞均可用于药物代谢研究。微粒体（microsomes）含有光滑内质网，包含了大部分I相氧化酶，但不含胞溶酶。II相反应的酶除尿苷二磷酸葡糖苷酸基转移酶（UGT）外大都是胞溶的。在用肝微粒体进行研究时，需加入相应的辅助因子或底物，如研究I相反应要加入NADPH，研究UGT则需加入底物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）。目前可用于首过消除研究的体外代谢模型主要有：肝切片、培养的肝细胞、亚细胞部分如S9及肝微粒体，其中肝微粒体模型最为简便易行，也最适合于高通量筛选的体外代谢研究。目前带有自动装置的96孔微板技术，在体外代谢的高通量筛选中发挥了重要作用，这一技术利用氧生物传感荧光系统来测定肝微粒体中P450酶催化代谢反应时的耗氧速率，进而了解代谢情况。此外，还可用重组人肝P450酶进行体外代谢的高通量筛选。对于代谢产物的分离鉴定可使用超滤结合LC-MS系统，将肝微粒体温孵液经超滤后，直接采用LC-MS进行分析鉴定，采用这一系统每小时最多可以处理60个样品。肝微粒体模型在体外代谢筛选中发挥了重要的作用，同时也应注意到其存的缺陷，如缺乏某些酶，特别是一些II相代谢酶；酶的含量和活性常常会受到制备技术、肝脏来源及酶失活的影响，而出现较大差异。新鲜分离的肝细胞可以克服上述的问题，但由于其制备技术复杂且人肝来源也限制了其在高通量筛选中的应用。三、常见研究模型（一）药酶抑制模型药物间的抑制性相互作用有时可能导致严重的后果，有些药物甚至因此被撤出市场。因此研究药物间的抑制性相互作用已经成为新药药动学研究中的一个重要部分。许多酶促代谢反应均可被抑制，其中P450酶（CYP）介导的代谢相互作用最为重要，因为它是参与药物代谢的主要酶系。目前常用的药酶抑制模型主要有肝微粒体、重组人肝P450酶和肝细胞悬液。CYP抑制实验通常采用人或动物的肝微粒体进行，并运用HPLC法测定样品。肝微粒体模型较为适合于体外高通量筛选。采用这一方法可以同时研究P450酶系中的5个重要的P450酶：CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4的活性，还可同时研究一系列结构相异的候选化合物与上述5种P450酶间的相互作用，进而对候选化合物是否对上述5种P450酶存在潜在的抑制作用作出初步评价，但需进一步使用CYP同工酶的特异性抑制剂加以证实。（二）药酶诱导模型由于肝药酶具有可诱导性，因此肝药酶常常会被一些外源性的化学异物（包括许多临床常用药物）所诱导，从而产生药物间相互作用。虽然有许多药酶可以被诱导，但对P450酶的诱导更为重要，其原因是，P450酶是参与药物代谢的主要的酶系；某些P450酶在致癌物的产生中发挥了重要作用。传统的诱导实验是重复给予动物某种化合物来观察其是否具有肝药酶诱导作用，由于P450酶存在明显的种属差异，因而无法预测其在人体内的诱导情况。目前已经建立了许多体外模型来研究肝药酶诱导，常用的肝药酶诱导模型有原代培养肝细胞、HepG2细胞和肝切片模型。这其中人肝的原代培养肝细胞模型最为适合于常规筛选，同时可以直接反映出人肝药酶的诱导情况，因而更具有实际意义。目前这一模型远未达到高通量筛选的水平。近年来已建立了可用于肝药酶诱导筛选的新方法，它是一种基于细胞基因表达的方法，它采用TaqmanRT PCR技术，检测培养的肝细胞中某种P450酶的mRNA表达，从而了解肝药酶的诱导情况，该法可用于肝药酶诱导的高通量筛选。（三）代谢稳定性研究将微粒体或肝细胞与供试药物共同孵育，然后用LC-MS对药物进行定量分析，可得出药物的代谢率，还可对一系列结构相关的化合物进行测量，对代谢中间物进行研究。由于微粒体中缺乏很多胞溶酶，其数据可能偏向于I相氧化反应。而完整的肝实质细胞包含有参与药物代谢过程的所有成分，并有合适的浓度、环境及细胞器，故用完整细胞进行研究更接近于体内状况。用新鲜制备的肝实质细胞研究肝清除率和体内代谢路径被认为是标准方法。目前还发展了很多方法进行肝细胞的低温贮藏，经低温贮藏的肝细胞仍保持了大部分药物代谢能力，仍可用于代谢稳定性的研究和确定药物的代谢途径及速度。（四）基于药物代谢的药物相互作用模型进入人体内的药物有自身的代谢，也会影响其他药物的体内代谢。药物可能抑制代谢酶的活性，也可能诱导某些代谢酶的表达。酶诱导后会导致毒性代谢物的剧增，或使药物的消除加快而降低药效。例如，抗肺结核药利福平会诱导CYP3A4而降低一些口服避孕药的药效。很多中草药甚至食物都包含可与代谢酶相互作用的化学成分。这种诱导作用具有种属间的差异性，如地塞米松在兔子体内可诱导CYP3A1的表达，但在人体内基本不诱导。肝细胞悬液可用于研究药物对代谢酶的影响。了解一个药物对协同治疗药物的潜在代谢影响是必要的。可以在96孔板上进行肝细胞长期单层培养，研究药物对肝基因表达的影响，当代谢酶表达稳定后，加入药物然后检测代谢酶的量，就可用mRNA定量方法来衡量基因表达变化，也可通过测酶的活性来衡量。mRNA的量基本可以反映出诱导与否，因为许多诱导都是通过与特定的上游感应元件相互作用提高转录水平的。定量实时PCR (QRT-PCR)可在100ng的总RNA（50000个细胞）中检验出10个拷贝，还可实时测定mRNA。确定一个孔细胞多基因表达，使得同时研究一个药物对所有CYPs酶的影响成为可能。药物治疗同时也会导致其他酶，如醇醛脱氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶等的表达发生变化，使用QRT-PCR也可确定这些酶和催化I相和II相反应的酶及其他参与ADME的酶的变化。四、研究方法学进展用完整的肝器官研究生物转化，如肝灌流，可获得较完整的生物转化信息；具有因辅助因子补给较充足，有关酶系仍保持天然的定位关系等优点。但肝灌流等实验技术不适合高通量研究。经典肝切片和游离肝细胞具有部分上述优点，但酶活力保存时间较短，不适合酶诱导研究。（一）组织水平手工肝切片，若厚度不均匀会影响结果的可比性。近年发展了“精密肝切片技术”，可制备大量厚度适中（200250m）的均匀肝切片，并结合动态培养系统，组织标本可存活11h。利用患者手术切除的肝组织，可了解候选化合物在人组织内的生转过程。（二）细胞水平原代培养的肝细胞不适用于高通量筛选，因来源有限，变异较大，培养生命期较短。如用动物肝细胞，还存在对人体的种属差异。C3A细胞株来源于人肝胚细胞瘤，不存在动物种属差异；重现性较好，不存在个体差异；不受组织来源的限制，细胞株能在任何细胞培养基形式中获得，培养基含或不含血清，还可按实验要求定制供应。（三）亚细胞水平cDNA表达的酶蛋白载体和免疫抑制性抗体，市场已有产品，近年在交互反应，检测底物和抑制剂的专一性等研究中已较多采用。cDNA编码的CYP，一般用菌苗或杆状病毒媒介动物构建。例如：用HepG2细胞，经重组病毒感染后，可用来表达人CYP1A2，2B6，2C8，2C9，2E1和3A4。又如：用Sf9昆虫细胞，经重组杆状病毒感染后，可用来表达人CYP2A6和2D6。第四节 药物代谢研究在新药开发中的作用新药研究的过程一般可分为药物设计和新药开发两个阶段。药物设计包括：（1）针对某一特定治疗靶点设计先导化合物，（2）根据先导化合物的药理、毒理及代谢等特性进行结构改造以获得新的候选物；在药物开发阶段主要对候选物进行药效及毒性评估。药物代谢研究在这两个阶段都发挥着重要作用。在新药设计阶段，可针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的特性进行结构改造以获得安全稳定的候选物，使之有更大的开发价值，也可合成有效代谢物或模拟有效代谢物的结构以获得新的候选物；而在新药开发阶段，利用各种体外模型对候选物的代谢特性（如药酶诱导、抑制，参与代谢的药酶种类，活性代谢物的生成等）可进行高通量筛选，以便在研究开发早期确定药物是否有继续开发的价值，并可用实验动物进行体内代谢研究，以推断药物在人体内的生物转化模式。美国最近一项报告指出，药物研究过程中只有10%的新药候选物可进入市场，而大约40%的药物是由于无体内活性或药代动力学参数不佳而遭淘汰。因此，在药物设计及新药开发早期进行药物代谢研究将有助于获得安全、有效的治疗药物，降低候选药物的淘汰率。药物代谢过程是药物在体内产生药效及毒性的主要过程，因此，为更好地设计新药，保证临床用药的安全性及有效性，降低药物研究过程中的高淘汰率，需要加强药物代谢酶及代谢过程的基础研究。目前，关于药物代谢酶仍有一些问题尚未完全解决，如一些药物代谢酶的三维结构仍不完全清楚；P450酶系统如何产生活性中间体，其结构如何，怎样氧化底物等；此外，如何通过临床前的实验结果预测新药候选物是否对P450酶系统有诱导作用，如何预测活性代谢物介导的毒性，某些P450酶系统家族的定位及功能等问题仍未完全解决。这些问题的解决将对药物研究将具有指导性作用。在药物设计上，对酶分子结构的深入研究将指导新药的开发过程。如Szklarz等人在最近的研究中采用定点突变的方法对CYP3A4和CYP2B1底物特异性的分子机制进行了研究，将有助于了解酶诱导及抑制的分子机制，进而可指导靶向药物的分子结构设计。同时由于对化合物的生物学活性进行快速评估的高通量筛选方法的出现，使得大量候选药物进入开发阶段。一、药物代谢研究与新药设计合理的药物设计应考虑到药物代谢途径及相关代谢特征，找出先导化合物的代谢“hot-spot”,对其结构进行改造，降低毒性或增加代谢稳定性。（一）对先导药物进行化学改造，改善药理作用，降低毒性通过对先导化合物进行结构改造，可使获得的新候选物按照已知的代谢途径失活或不代谢而由原形排出体外，提高药物的安全性，也可防止药物失活，增加药效。1在体内不代谢或仅经水解酶代谢的药物设计对先导药物进行结构改造可得到在体内不代谢或仅经水解酶代谢的候选物。由于这类药物可不经P450酶系统进行生物转化，避免了活性代谢物的产生而降低了药物毒性。如目前临床使用的骨吸收抑制剂双磷酸盐(Bisphosphonates)是由焦磷酸盐经结构改造获得的。焦磷酸盐在体外可与磷酸钙牢固结合，抑制磷酸钙晶体的生成和溶解，但由于焦磷酸在体内到达病变位置前已被水解，因此体内无抑制骨吸收作用。对焦磷酸进行结构改造时发现当以P-C-P键代替焦磷酸的P-O-P键时可得到双磷酸盐，它与焦磷酸有相似的活性，但在动物或人体内都不经代谢，唯一的消除途径是肾排泄。又如Remifentanil(商品名Ultiva),一个新开发的短效-阿片受体激动剂，其结构是一种甲基酯。约90%以上的药物在体内经酯酶水解代谢为无活性的酸性代谢物经尿液排出。通常，这类药物都非常安全，无显著的系统毒性，在新药设计中很受欢迎。2对药物分子进行结构修饰，防止其失活大部分药物进入体内经转化后活力减弱甚至消失。若对药物分子进行化学修饰防止其快速失活，则可增加药物的作用。如临床常用的6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine）在体内易被氧化脱硫而失去药效，经结构改造保护巯基后，可得到巯唑嘌呤（Azathioprin）。（二）合成有效代谢物或模拟有效代谢物结构，以获得新的候选物某些药物通过生物转化形成的代谢物仍有药理活性，由于这些代谢物通常与II相酶结合排出体外，与原型药物相比可能安全性更高，因此可作为候选药物的一个来源。如扑热息痛（Paracetamol）是非那西丁（Phenacetin）的O-脱乙基代谢物，但扑热息痛较非那西丁镇痛作用更强，且不导致高铁血红蛋白血症及溶血性贫血。扑热息痛在体内主要发生葡糖醛酸化和硫酸化，在临床规定的用量范围内是很安全的。除I相酶的氧化-还原反应外，通过II相酶的共价结合反应也可产生有生物活性的代谢物。如吗啡-6-葡糖醛酸（Morphine 6-glucuronide）是比吗啡（Morphine）本身强的-阿片受体激动剂。此外米诺地尔（Minoxidil）也是通过硫酸结合物在体内产生治疗作用。由于需要进行代谢研究的新药一般都是已明确有一定生物活性的化合物，因此通过代谢研究发现的新药大多不是完全新类型的化合物，而多是通过对先导化合物进行结构改造以增加疗效或改善克服不良反应，这在新药开发工作中是一个不可忽视的途径。有时新药存在的某些缺点能否克服是决定该药是否有实用价值的重要因素。二、药物代谢的临床前研究新药开发阶段首先用各种体外模型对候选物的代谢特性进行筛选以确定药物是否有继续开发的价值，随后进行动物的体内代谢研究以及人体的体外代谢研究，以推断药物在人体内可能的代谢途径及是否安全有效。（一）药物代谢的体外研究在新药开发各阶段，体外模型由于简单可行而得到越来越广泛的应用。通过体外实验可以推断药物代谢途径及参与代谢的相关酶系，同时可以判断药物是否由于竞争P450酶系统而发生相互反应。1药物的体外高通量代谢筛选二十世纪90年代以来，基因组计划及组合化学技术越来越广泛用于药物的设计过程，为得到大量化合物提供新的途径，同时高通量筛选方法的出现加快了对化合物生物学活性评估的速度。因此，大量化合物作为候选物进入药物开发领域。为了加快新药开发的速度，药物的高通量代谢研究也日趋成熟。临床前药物代谢研究的体外模型见表20-4-1。表20-4-1.临床前药物代谢研究的体外模型可发现的代谢特征可用模型对药酶的诱导肝细胞原代培养HepG2细胞肝切片代谢不稳定肝细胞悬液肝切片亚细胞结构(如微粒体)c-DNA表达的代谢酶对药酶的抑制亚细胞结构(如微粒体)c-DNA表达的代谢酶肝细胞悬液药物吸收差Caco-2细胞HT29-18-C1细胞是否由具有多态性的酶代谢c-DNA表达的代谢酶亚细胞结构(如微粒体)活性代谢物的生成亚细胞结构(如微粒体)c-DNA表达的代谢酶肝切片肝细胞悬液/分离培养肝细胞2确定药物代谢途径及相关酶在药物代谢过程中，一种酶可催化药物的多种代谢反应，而多种同工酶或不同酶系统可能催化同一代谢反应。如抗组胺药特非那定(Terfenadine)在人体内的N-脱烷基化和C-羟化反应都由CYP3A4催化，而米帕明（Mipramine）在人肝微粒体中的脱甲基化反应则由CYP1A2和CYP3A4两种同工酶共同完成。药物代谢反应的这种复杂性是由药物代谢酶系统的多样性造成的。同样，多数手性药物的代谢有立体选择性，这也可能是由于不同的同工酶参与了不同对映体的代谢。如大鼠中R和S-美芬妥英（Mephenytoin）的4-羟基化反应是立体选择性的，S-和R-美芬妥英的4-羟基化分别由CYP2C11和CYP3A1/2催化。药物由体外模型得到的代谢特征通常可一定程度地反映体内的代谢特性，因此，可在新药开发的早期阶段用人体体外实验进行药物代谢的有关研究以确定药物在人体内可能的代谢特征。如体外实验常用肝切片系统，既保留了生理状态下药物进行生物转化时I相和II相反应所需的酶和辅助因子，而且与体内的代谢环境较为相似。除肝切片外，分离培养的肝细胞及高表达的代谢酶也经常用来进行体外药物代谢研究。3确定药物间相互反应生物转化过程是许多药物消除的主要途径，因此当两种或多种药物经同一代谢酶代谢时，药物间则可能由于对药酶的竞争而发生相互作用。如当奥美拉唑(Omeprazole)与地西泮(Diazepam)合用时，由于二药皆由CYP2C19代谢且与酶的亲和力不同，因此在高代谢(Extensive Metabolizers, EM)人群中可见地西泮的血药浓度显著增加，导致严重的不良反应。近年来由于分子生物学技术的进步，药物代谢的体外研究在技术上已取得巨大进步，如今可利用体外系统协助进行药物间相互作用的研究。（二）动物的体内试验在临床前研究过程中，不仅要对药物的体外代谢、药效及机制等方面进行研究，同时要选定合适的动物种类进行体内实验。在新药报批时，药政管理机构需要生产厂家提供在动物体药物及代谢物的药理、毒理及代谢等研究数据，并要确定人体应用的安全范围。因此，体内实验一定要选择与人有相似代谢特征的动物。1体内代谢产物的收集代谢产物的收集与研究是药物代谢研究中最经典、同时也是十分有效的方法之一。由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。近年来，HPLC及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR等高速、高效、高灵敏度的分析方法已用于代谢产物的分析，可在检测出极微量代谢产物的同时鉴定代谢产物的结构。2体内生化研究近年来在分子水平对药物代谢酶进行了越来越深入的研究，促使药物的体内代谢研究不仅局限于对代谢产物的分离鉴定，也涉及参与药物代谢的酶学特征及相关基因分子生物学特征。在体内药物代谢研究的过程中可观察到，同一药物在不同种属、个体或性别动物体内其代谢、药效及毒性可能存在很大差别，这是由于其药物代谢酶水平和组成的差异所致。以P450酶系统为例，目前，在哺乳动物中已鉴别出14个批P450基因家族。除P450酶系统外，尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UDPGTs)和羧酸酯酶也都是由不同的同工酶构成的大家族，各同工酶的代谢活性有明显的种属差异。同工酶学说可解释药物代谢过程中的种属差异及立体选择性代谢等现象。如洛沙坦(losartan)在大鼠和猴子体内分别经氧化及葡糖醛酸化反应进行代谢，而在人体内则产生几乎相等的氧化和葡糖醛酸化代谢物。同样，多数手性药物的立体选择性代谢也属此例。如口服抗凝药华法林(Warfarin)，临床以消旋体用药，但其代谢是立体选择性的。S-华法林在体内主要由CYP2C9催化代谢为S-7-OH华法林及一小部分S-6-OH华法林；而R-华法林在体内则由CYP1A2和CYP2C19催化，主要代谢为R-6-OH华法林及一小部分R-7-OH华法林。药物代谢过程中的性别多态性现象也可由同工酶学说来解释。三、预测人体内的代谢特征在进入临床实验前，根据药物代谢的体外及动物体内特性可初步推断出药物在人体的代谢途径，并可定量(或半定量)估计药物各代谢途径的清除率。这时还应注意由于种族及环境等因素,不同人群中药物代谢酶的基因构成可能有很大差异，即药物代谢酶的基因多态性。当药物主要由这类酶代谢时，不同患者对同一药物的代谢速率可能有显著差异。关于人药物代谢酶的基因多态性研究较为广泛的两个酶是CYP2D6和CYP2C19。按照CYP2D6的基因多态性可将人群分为超快代谢型(Ultra-rapid Metabolizers,UM)、高代谢型(Extensive Mmetabolizers,EM)和低代谢型(Poor Metabolizers,PM) 3个表现型。在高加索人群中，约有5%10%的人为PM表现型，而在亚洲人群中，只有1%2%的人为PM表现型。迄今已发现包括抗抑郁药、抗精神病药以及心血管系统药物等至少50种药物主要是通过CYP2D6代谢的。同样，按照CYP2C19的基因多态性也可将人群分为EM和PM两个表现型。在高加索人群中，大约有2%6%的人为PM表现型，而在亚洲人群中，约有14%22%的人为PM表现型。四、为临床研究提供指导新药准备进入临床研究前一定要了解药物的代谢图谱，只有这样才能确定药物在人体内不会产生未知物，避免人体由于暴露于未知化合物而可能产生的毒性；通常适当的人体体外实验可以避免这种意外的发生。可是如果进入临床后在人体内发现有大量未知代谢物的生成，通常要暂停开发，直到合成出该未知代谢物并通过动物实验确定无毒后才能继续。此外，清楚药物的代谢途径还可以确定药物是否通过P450酶系统介导的氧化-结合反应进行消除，如否，则可简化药物间相互作用的研究。通过一系列研究，在临床药理研究的最后阶段，关于药物的代谢途径、活性代谢物的存在、代谢的种属差异以及药物对代谢酶的诱导及抑制等特征都已清楚，这些数据在临床针对不同情况、不同特异质及特殊人群的用药有很重要的理论意义和实用价值。五、药物代谢与药物不良反应为保证药物临床应用的安全性，在开发过程中一定要对新药进行全面细致的安全评价，并要充分预测在人体内可能产生的毒性。药物代谢过程中的氧化结合反应、对药酶的诱导和抑制以及药物的立体选择性代谢、参与药物代谢酶的基因多态性等都与药物毒性的产生相关。虽然药物代谢有种属特异性，药物诱导产生的毒性也有种属依赖性，但一般仍可用动物实验预测药物的安全性。（一）氧化和结合反应与药物毒性药物通过氧化反应产生的活性代谢物可能是药物产生毒性的重要因素，如临床常用的扑热息痛大剂量时产生的肝毒性即是由于被P450酶系统氧化生成大量的N-乙酰-对-苯醌亚胺(NAPQI)致肝内GSH被耗竭，而后NAPQI与肝细胞蛋白质进行共价结合所导致。除氧化反应外，葡糖醛酸化、硫酸化及GSH结合等II相反应也与药物产生的毒性有关，如某些杂环芳胺类化合物可在肝脏中转化为N-羟基-N-葡糖醛酸代谢物，随胆汁进入肠道后在细菌-葡糖醛酸酶的作用下释放出致癌的羟胺类化合物而导致结肠癌的发生。（二）药酶的诱导和抑制与药物毒性对药酶的诱导与抑制除了改变药物解毒的速率外，对活性代谢物的生成亦有重要影响。对药酶的诱导可通过加速活性代谢物的生成而增加药物的毒性，如CYP1A可催化苯并芘生成具有强致癌性的中间物，而有CYP1A诱导作用的药物可加速这种活性代谢物的生成。由于药酶的抑制引发的药物间相互作用也可导致非常严重的不良反应。如特非那定(terfenadine)主要由CYP3A代谢，而酮康唑(ketoconazole)是CYP3A的强抑制剂，因此当特非那定和酮康唑同时应用时，可导致特非那定的血药浓度升高，引起严重的心脏毒性，甚至危及生命。（三）立体选择性毒性从药效学的角度分析，药物产生药效及毒性多是由药物分子与特殊的酶或受体的相互作用决定的，因此手性药物的对映体之间在药效及毒性上可能有很大差别。如在世界范围内引起巨大反响的镇静催眠药反应停(Thalidomide)在60年代是以消旋体的形式上市的。后来的研究者在对大鼠及小鼠的研究中发现，反应停的S-对映体有致畸性，而R-对映体则无致畸性。而当S-和R-反应停分别给予兔时，却都有致畸性，而且消旋体似有更大的致畸性。很明显，反应停的毒性有立体选择性,且这种立体选择性毒性是有种属特异性的。如果在反应停进入临床前仔细对其种属特异的立体选择性毒性进行实验，则反应停造成的悲剧就可能避免。（四）药物代谢酶的基因多态性与药物毒性某些药物代谢酶具有基因多态性并可依此将人群分为EM及PM等表现型，对于主要由这类酶代谢且治疗范围比较窄的药物来说，在不同表现型人群中产生的药理作用可能有很大差别，因而更易产生毒性的差别。临床已证实经CYP2D6代谢的药物在PM表现型的患者身上更易产生不良反应。如普罗帕酮(propafenone)是主要由CYP2D6代谢的药物，Siddoway等人在28位慢性室性心律不齐病人（22EM和6PM）中的研究表明，普罗帕酮在PM病人体内的血浆稳态血药浓度要高于EM病人。这使PMs发生中枢神经系统副作用的比率（67%）要明显高于EMs病人（14%）。参考文献1（瑞士）特斯塔. 药物的吸收、分布、代谢、排泄及毒性的研究方法。北京：科学出版社，20072高坤，孙进，何仲贵. Caco-2细胞模型在口服药物吸收研究中的应用。沈阳药科大学学报，2005；22(6):469-474（胡霞敏）第二十一章 药代动力学与新药研究药代动力学是研究药物在体内处置的药理学分支学科，重点是研究药物的吸收、分布、代谢、排泄四个主要环节。临床前药代动力学研究的目的，是揭示新药在动物体内的动态变化规律，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点，并根据数学模型提供重要的药代动力学参数。临床前药代动力学研究在新药研发和评价过程中起着重要的桥梁作用，为药效学和毒理学评价提供了药物或活性代谢物浓度，是决定或阐明药效或毒性大小的物质基础，是提供药效或毒性靶器官的依据，也是药物制剂学研究的主要依据和工具，并为设计和优化临床研究给药方案提供依据。尽管目前已经建立了许多研究选化合物吸收、分布和代谢的体外筛选模型，但体内的药动学研究仍占据重要的地位。因为候选化合物在体内的过程极为复杂，受到诸多因素的影响。如很多原因都可能造成候选化合物口服生物利用度低，这其中包括候选化合物难以通过肠粘膜而被吸收、存在肝脏或肠道的首过效应、存在P-糖蛋白（P-gp）参与外排机制或可通过胆汗迅速排泄，因此很难用一个体外筛选模型来分析其生物利用度低的原因。此外，可以通过口服或注射给药后的体内药动学研究获得一些非常重要的药动学参数如生物利用度、半衰期、清除率、分布容积等。药动学的体内研究和体外筛选是相辅相成的，有时运用体外模型预测体内参数不理想时，就必须借助于体内研究。第一节 新药临床前药代动力学研究一、临床前药代动力学研究的基本原则进行临床前药代动力学研究，要遵循以下基本原则：试验目的明确；分析方法可靠；试验设计合理（包括试验药品、试验动物的选择、试验方案、给药途径和给药剂量等）；所得参数全面，满足评价要求；对试验结果进行综合分析与评价；具体问题具体分析。二、试验设计（一）总体要求1试验药品应提供受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。使用的受试药物应与药效学或毒理学研究使用的一致。2试验动物：一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。一般来说，小动物如小鼠、大鼠、兔应5只，大动物如狗、猴应3只。选择动物的原则如下:（1）首选动物：尽可能与药效学和毒理学研究一致。（2）尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。（3）创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或猴等）。（4）口服用药不宜选用兔等食草类动物。3剂量选择动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，其高剂量最好接近最大耐受剂量，中、小剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取。主要是要考察药物在体内的动力学过程是否属于线性，同时所得结果更有利于解释药效学和毒理学研究中的发现。4给药途径所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致。（二）生物样本的药物测定方法生物样品的药物测定方法包括色谱法、放射性核素标记法、免疫学和微生物学方法。应根据待测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法（如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS方法）。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。对于代谢型药物或有活性代谢产物（有药效学或毒理学作用）的药物，建立方法时必须考虑是否能同时测定原型药和代谢物，在这方面，放射性核素标记法和色谱-质谱联用法具有明显优势。应用放射性核素标记法测定血药浓度应配合色谱法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。生物学方法（如微生物法）常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。生物样品分析方法的一般性标准（见本章附录），研究时可根据分析方法的具体类型进行调整。（三）具体研究项目1血药浓度-时间曲线（1）受试动物数：以药时曲线的每个时间点有不少于5个数据为限计算所需动物数。最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。建议受