保健食品中大豆异黄酮的检验方法.doc

保健食品中大豆异黄酮的检验方法 -高效液相色谱（HPLC）法中华人民共和国食品工业标准编制说明1 任务来源国家标准保健食品中大豆异黄酮的检验方法制修订是根据全国食品工业标准化委员会的要求，由朝阳区产品质量监督检验所负责，与红牛维他命饮料有限公司协作，进行制订工作（项目编号：20079432-T-469），根据项目内容确定了该项工作的具体方案和工作计划，按照项目要求开展工作。2 意义大豆异黄酮是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素。目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种,分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类，游离型的甙元约占总量的2%3%，包括染料木素(Genistein),大豆黄素(Daizein)和黄豆黄素(Glycitein), 结合型的糖甙约占总量的97%98%。已发现大豆异黄酮是一种优良的天然抗氧化剂，具有多种生物活性，如对肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗作用。因此，当前国际上特别是美国和日本对大豆异黄酮开展了大量的应用研究工作，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为一种新型畅销食品。据统计，国内外市场上含有大豆异黄酮的保健食品达数十种之多。主要有片剂、胶囊、口服液、饮料等。例如，威海清华紫光科技生产的金奥力大豆异黄酮胶囊，成都中科生物技术开发有限公司生产的天雌大豆异黄酮营养片( 胶囊)、红牛维他命饮料有限公司开发的大豆异黄酮保健饮料、广东九极日用保健品有限公司生产的九极牌丽延口服液等。美国C1ifbar公司开发出添加了大豆异黄酮的运动饮料，美国加州Imagine食品公司开发含大豆异黄酮、蛋白质、碳水化合物、23种维生素和矿物质的能量饮料。不同的产品，大豆异黄酮的含量也不同，目前保健品市场上片剂一般每片（500mg）约含大豆异黄酮几十毫克，胶囊每粒含大豆异黄酮几十毫克，口服液饮料每一百毫升含大豆异黄酮几十到上百毫克，大豆异黄酮粉末含大豆异黄酮为每克一百到几百毫克。国内生产含大豆异黄酮的保健食品厂家很多，有的产品标示的大豆异黄酮含量与实际含量差别很大，实际含量远小于标示含量，保健品市场有待于进一步规范。为了保障消费者的利益，也为企业提供更好的技术支持，因此建立一种相对统一、简便适用、经济的测定保健食品中大豆异黄酮含量的检测方法是很必要的。3 国内外检测方法研究进展作为一种天然有效的抗氧化剂，大豆异黄酮越来越受到重视，对其功能性研究，生物活性研究以及产品开发也是越来越广泛。但是纯净的大豆异黄酮难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、等有机溶剂。大豆异黄酮的性质限制了它在饮料等食品体系中的应用，但是随着保健品市场的逐渐升温，各种声称含有大豆异黄酮成分的保健品和食品越来越多，但是国家并未制定统一的检测标准，国内仅有农业部于2007年2月1日开始实施的行业标准 NY/T1252-2006大豆异黄酮，它主要针对大豆异黄酮产品。卫生部出版的保健食品检验与评价技术规范(2003版)中有用HPLC法测定染料木素和大豆黄素的方法。虽然许多学者建立了基于不同系统分析大豆异黄酮含量的方法，如紫外分光光度法，该方法简便，但特异性较差；薄层扫描法(TLCS)操作简便。分离效果较好，但显色剂用量难于控制，人为误差较大；气相色谱法(GC)进样量少、高敏感性、高选择性、但在测定大豆黄素和染料木素时需要制备衍生物，样品制备步骤较多，耗时长；毛细管电泳法(CE)速度快，选择性高，仪器价格昂贵，难以普及；高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)具有无可比拟的优越性，易于定性和定量但因仪器价格昂贵，普及困难；高效液相色谱法(HPLC)测定样品范围广，样品制备步骤少，成本低，分离效率高，灵敏度好，测定结果准确，而且可有多种检测器供选择。所以本课题组通过查询资料和调研，选择高效液相色谱（HPLC）法测定保健食品中大豆异黄酮的含量。4 实验部分4.1 色谱条件的选择4.1.1流动相的选择：参照国内外文献资料，选择了乙睛-水作为流动相，比较了在相同的进样量情况下，不同pH值（pH=5.0，4.0，3.5，3.0）的流动相对大豆异黄酮分离效果的影响。在pH较高时，大豆黄素、黄豆黄素和染料木素的峰有拖尾现象，在pH值3.0时峰型较好，拖尾现象得到改善。通过上述试验的比较，最终确定色谱流动相为：乙腈-水（pH3.0）；梯度洗脱：12%18%乙腈，010min；18%24%乙腈,1023min；24%30%乙腈,2330min；30%乙腈,3050min，80%乙腈，5055min。此条件下，保留时间和峰面积比较，有较好的稳定性和重现性。一次开机，连续运转5天，以下六个分别为第21，38，49，107，123，124针所进标样的保留时间，见表1。表格 1 六次进样保留时间比较 单位：min名称 次数123456平均值RSD（%）大豆苷13.37713.35013.33213.37413.37313.30013.350.23黄豆苷14.27114.24214.23714.27514.27714.20114.250.21染料木苷19.90119.82319.80119.89019.90119.79619.850.26大豆黄素32.02131.95131.93232.07232.08231.02231.851.28黄豆黄素33.33633.30333.29233.36233.38233.27533.330.13染料木素43.73943.52443.50743.81543.82243.49743.650.364.1.2检测波长的选择：对以大豆苷、黄豆苷、染料木苷、大豆黄素、黄豆黄素和染料木素进行波长扫描，波长范围：220nm450nm，光谱图见附页1。 通过光谱图比较，这六种物质在260nm有最大吸收，因此选定260nm作为检测波长。4.1.3 标准工作曲线和线性范围 配制不同浓度的标准使用液在上述色谱条件下进行HPLC测定。线性方程和相关系数见表2和附页2。 表格 2 标准曲线数据列表样品名称浓度(g/mL)峰面积线性方程相关系数大豆苷0.20958.6Y=38.20869X+4.010240.999992.095082.910.4750408.041.90001619.783.80003192.0125.70004810.9黄豆苷0.19907.5Y=34.74200X+2.313090.999991.990072.99.9500350.939.80001391.879.60002754.0119.40004157.2染料木苷0.207512.2Y=55.50528X+5.775940.999992.0750121.010.3750589.441.50002323.683.00004595.3124.50006922.3大豆黄素0.201512.8Y=59.71839X+6.173330.999992.0150123.410.0750619.640.30002428.580.60004799.7120.90007233.2黄豆黄素0.199510.8Y=43.30426X+8.176450.999991.9950110.49.9750441.539.90001736.379.80003455.3119.70005196.9染料木素0.202016.6Y=78.92797X+6.069000.999992.0200167.010.1000812.540.40003212.780.80006352.1121.20009586.3由表2可知，本方法的标准工作曲线线性范围较宽，0120g/mL线性良好。4.2 样品处理4.2.1 提取溶剂的选择大豆异黄酮难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，参照国内外相关资料，选择了80%甲醇提取保健食品中的大豆异黄酮成分，80%的甲醇提取的样品色谱图见附页3。保健食品片剂和粉末一般以淀粉和糊精作为填充剂，80%的甲醇能够使淀粉和糊精沉淀，另外能够有效提取大豆异黄酮成分；软胶囊含油脂，用80%的甲醇作为萃取剂，一方面大大降低了油脂的溶解度，延长色谱柱的使用寿命，也可以有效提取大豆异黄酮。保健饮料中的大豆异黄酮可溶于水，可以直接用80%甲醇提取。 4.2.2 超声时间的选择 保健食品中组分复杂，含有淀粉、糊精、油脂、蛋白等各种成分，能够包容大豆异黄酮有效成分，通过超声萃取能够快速有效的提取。本实验选择0min，10min ，20min，30min，40min进行超声处理。结果见图1。图1 超声时间对提取效果的影响从上图可以看出，超声时间对软胶囊提取影响较明显，超声波能够使软胶囊中油状物破乳，大豆异黄酮成分能够更加快速被甲醇萃取出来，但是随着超声时间的延长，提取量没有明显增加，选定超声时间为20min。硬胶囊（粉剂），粉剂为粉末状物质，它能够较好的分散于80%的甲醇中，使得其中的大豆异黄酮组分比较容易被提取，所以超声20min已能够完全提取。4.3 本方法的检出限本方法的检出限：进样量为10L时，大豆苷(daidzin)、黄豆苷(glycitin) 和染料木苷(genistin)、大豆黄素(daidein)、黄豆黄素(glycitein)和染料木素(genistein)的最低检出浓度均为：0.02g/mL，最低检出量如下: 以大豆异黄酮为主要功能性成分的片剂、胶囊及大豆异黄酮粉末0.005mg/g, 口服液的最低检出量为:0.0002mg/mL，保健饮料最低检出量为:0.0002mg/mL。4.4 本方法的重复性和精密度按照本方法，选择五种代表性的大豆异黄酮保健食品进行日内重复性测定，结果表明本方法精密度好，准确度高，操作简便，适合推广应用。部分结果见下表。表中，以大豆异黄酮总量计mg/g ，饮料的单位为g/ mL 。表格 3 日内重复性单位：mg/g次数 名称123456平均值RSD(%)胶囊56.2860.3558.9059.2258.6859.7858.872.4粉末104.71105.37105.79107.72103.43106.64105.611.4片剂35.1734.7633.9533.7433.0434.2734.162.2饮料107.58107.31107.90106.38104.92105.91106.671.1表格 4 样品中六种大豆异黄酮成分的重复性单位：mg/g 次数名称 123456平均值RSD(%)大豆苷32.9932.3833.3433.8933.1432.9233.111.5黄豆苷13.7213.4614.0013.4913.7813.7013.701.5染料木苷7.837.737.918.037.927.817.871.4大豆黄素1.781.711.771.791.771.761.761.8黄豆黄素0.840.820.840.860.840.840.841.6染料木素1.831.781.831.841.841.831.820.3通过表4可以看出，六种大豆异黄酮日内重复性较好，精密度较高。按照本检验方法对样品进行日间重复性测定：间隔两天，共测定三次，部分实验结果见表5表格 5 日间重复性 单位：mg/g名称123平均值RSD(%)大豆苷33.6932.1833.3633.082.4黄豆苷14.0013.2313.8913.713.1染料木苷8.017.707.927.882.0大豆黄素1.791.701.781.762.8黄豆黄素0.850.820.840.841.9染料木素1.831.781.851.821.94.5 本方法的准确度按照本检验方法对样品饮料、片剂、胶囊、口服液的加标回收实验，回收率见表6。表格 6 饮料（空白）加标回收名称实际测定均值(g/mL)加标量(g/mL)平均回收率（%）大豆苷1.942.049510.1010.209919.7020.4097黄豆苷2.122.169810.6010.809821.1021.6098染料木苷1.601.551037.967.7510315.6015.50101大豆黄素2.592.5910012.7012.959825.7025.9099黄豆黄素1.791.87969.599.3510318.9018.70101染料木素2.072.001049.8010.009820.7020.00104表格 7片剂（空白）加标名称实际测定均值(mg/g)加标量(mg/g)平均回收率（%）大豆苷0.2500.255980.9701.02095黄豆苷0.2500.270951.0601.08098染料木苷0.2000.1931040.7950.772103大豆黄素0.3330.3131061.3401.295103黄豆黄素0.2280.235970.9300.94099染料木素0.2500.2501001.0301.000103表格 8 胶囊加标回收名称实际测定值(mg/g)样品本底值(mg/g)加标量(mg/g)回收率（%）大豆苷43.2535.657.659948.9335.6512.7510466.8835.6530.6102黄豆苷22.4314.238.1010128.4814.2313.510647.5314.2332.4103染料木苷14.158.305.7810118.208.309.6310332.438.3023.3104大豆黄素2.871.880.971024.121.882.27996.351.884.5498黄豆黄素1.560.880.7972.470.881.64974