《血清分析论》word版.doc

生物化学实验指导试用版 21血清成分分析（家鸡、乌鸡血清）作者：王志豪 李东 导师：吴明江（温州大学生命与环境科学学院 浙江温州 325027）摘 要 ：本次血清成分分析总共分三个试验进行操作。血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法），血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定，血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定。通过试验了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇，盐析法分离提纯蛋白质，并对蛋白质进行透析与浓缩，采用凝胶层析法分离重铬酸钾和蓝葡聚糖混合液，利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白与-球蛋白，凝胶过滤层析及透析法脱盐与蛋白质浓缩的原理和方法。并以肝脏为原料，进行了谷丙转氨酶活力的鉴定。利用对鸡的血清分析来了解血清成分的区别，我们主要采用乌鸡与家鸡对照来进行试验。关键词： 血清、肝脏、成分分析、蛋白质、谷丙转氨酶Serum component analysis ( chicken, chicken serum )Author: Wang Zhihao Lidong Tutor: Wu Mingjiang(College of Life and Environment Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325027 )Abstract: The analysis of serum components in a total of three test operation. Quantitative determination of serum cholesterol ( adjacent benzene two formaldehyde), serum albumin and gamma globulin separation and identification, serum alanine aminotransferase activity identification and activity determination of. Through the experiment to understand and master the adjacent benzene two formaldehyde determination of total cholesterol in serum by salting out method, separation and purification of proteins, and proteins for dialysis and concentration by gel chromatography, potassium dichromate and blue dextran solution, using cellulose acetate membrane electrophoresis separation and identification of serum albumin and gamma globulin, gel filtration chromatography and dialysis desalination with the principle and method of protein concentration. And to the liver as raw material, the alanine aminotransferase activity determination of. Utilization of chicken serum analysis to understand the difference between serum components, we mainly use the chicken and chicken controls to test.Key words: Serum；liver；component analysis、protein、alanine aminotransferase前言：血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目, 测定方法很多, 目前国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷酸一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一醋酐煮沸显色法及邻苯二甲醛一硫酸显色法。本次实验用邻苯二甲醛酸法进行测定。1 而通过血清清蛋白与-球蛋白的分离可以了解蛋白质等生物大分子的一些特性。 血清谷丙转氨酶以下简称谷丙酶，谷丙酶活力测定对于病毒性肝炎的诊断价值已被一致肯定以,。它肝病早期诊断, 疗效观察, 以及流行病学调查等方面均有一定意义。2通过本次实验将让我们了解到基本的血清成分测定方法。一、血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）1.1目的了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的原理和方法。1.2原理胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。本法优点是操作简便（无须将样品中的胆固醇抽提出来或去除样品中的蛋白质），灵敏，稳定。1.3器材1、血清2、试管 1.5cm15cm（7）3、吸管 0.1mL（3）、0.5mL（4）、5mL（1）、10mL（1）4、容量瓶 50mL（1）、100mL（1）5、烧杯 100mL（2）6、电子分析天平7、分光光度计1.4试剂与材料1、邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛（A.R.）50mg，以无水乙醇（A.R.）溶解并稀释到50mL，冷藏，有效期1个半月。2、90%醋酸：取冰醋酸90mL加入10mL蒸馏水中混匀即成。3、混合酸：取试剂2加等体积浓硫酸混匀即成。4、标准胆固醇贮液（1mg/mL）：准确称取胆固醇（A.R.）100mg以醋酸定容至100mL。5、标准胆固醇应用液（0.1mg/mL）：将上述标准胆固醇贮液准确稀释10倍。1.5操作1、标准曲线的绘制取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线的绘制编号试剂编号编号编号编号编号01234标准胆固醇应用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10邻苯二甲醛试剂/mL0.20.20.20.20.2蒸馏水/mL0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中总胆固醇含量/mg0100200300400A550nm加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。2、样品的测定取3支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。表3 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇样品的测定试管试剂对照样品1样品2醋酸/mL0.40.40.4血清/mL0.010.010.01邻苯二甲醛试剂/mL00.20.2无水乙醇/mL0.200混合酸/mL*4.04.04.0*硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在432时，颜色能稳定2h。加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。1.6实验结果1.61 实验标准曲线的制作邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线的绘制100mL血清中总胆固醇含量/mg0100200300400OD值00.1650.3030.4770.642邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇样品的测定试管对照乌鸡家鸡OD值00.0780.081由标准曲线可知 100mL乌鸡血清中总胆固醇含量为 55mg。100mL家鸡血清中总胆固醇含量为 61mg。二、血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定2.1实验目的1. 掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；2. 掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法；3. 掌握凝胶过滤层析的技术方法；4. 掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。2.2血清清蛋白与-球蛋白的盐析、透析与浓缩2.2.1 实验试剂和仪器1. 试剂（1）血清 （2）PBS（3）（NH4）2SO4溶液 （4）双缩脲试剂（5）酪蛋白 （6）蔗糖（7）BaCl2溶液2. 用品与仪器（1）离心机 （2）烧杯（3）移液管 （4）透析袋2.2.2 血清清蛋白与-球蛋白的盐析2.2.2.1 蛋白质盐析的实验原理1. 蛋白质分子是生物大分子，其大小恰好在胶体的范围，且分子中亲水基团多位于分子的表面，疏水基团多在分子结构内部。因此，蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素：（1）胶粒上的电荷；（2）水化膜。3. 蛋白质在水溶液中呈现两性电离。在环境的pHpI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。4. 高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。5. 由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。例如：球蛋白不溶于半饱和的（NH4）2SO4溶液，-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的（NH4）2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的（NH4）2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。2.2.2.2 血清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤血清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤取离心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀释血清），摇匀逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，边加边摇静止30min，离心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉 淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和加1mLPBS溶解静止30min逐滴加入饱和（NH4）2SO4溶液0.5mL（相当于33%饱和（NH4）2SO4溶液）离心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋离心20min（v=3000rpm）*放弃离心后的上清液（主要是、球蛋白），沉淀即为初步纯化的-球蛋白2.2.3血清清蛋白的透析与浓缩2.2.3.1 蛋白质透析与浓缩的实验原理1. 透析（1） 透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。（2） 由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。透析达到平衡状态透析达到平衡状态缓冲液透析袋饱和溶液液2. 浓缩利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。2.2.3.2 蛋白质透析与浓缩的实验步骤1. 取玻璃纸（15cm15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。2. 用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器上振荡1h（中间换水12次）。实际操作：流水透析1h。3. 将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管取袋内液体放入干净试管中。4. 用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。再用BaCl2溶液检查烧杯中液体的NH4+和SO42-。5. 将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。2.3凝胶层析2.3.1 凝胶层析的实验原理1. 凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。2. 当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。大分子物质凝胶颗粒小分子物质下降方向3. 当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。本实验用的是重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液通过Sephandex G-200凝胶柱。2.3.2 实验试剂和用品1. 试剂（1）Sephandex 4B 凝胶 （2）生理盐水（3）5%重铬酸钾 （4）5%蓝葡聚糖2. 主要实验用品（1）铁架台 （2）凝胶柱（101.0cm）（3）玻璃棒 （4）烧杯（5）试管 （6）胶头吸管2.3.3 凝胶层析的实验步骤凝胶层析的实验步骤过程名称实验步骤凝胶预处理8g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中100mL蒸馏水小火煮沸1h静止、冷却、倾弃蒸馏水加入PBS10mL轻轻搅拌至凝胶悬起倾入10cm1.0cm层析柱装柱 将全部凝胶都倾入柱内，且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。加样 用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。洗脱 用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到67dpm（实际1015 dpm）。收集混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。2.3.4 实验结果从3号试管开始出现淡紫色颜色，并且4号试管紫色最深，从5号试管开始颜色变淡，到6号试管颜色消失从7号试管开始出现黄色，到9号试管时颜色最深，以后又逐渐变淡，到13号试管颜色消失。大致趋势如下图所示。2.4血清清蛋白与-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）2.4.1 醋酸纤维素薄膜电泳的原理1. 醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。2. 醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点。2.4.2 醋酸纤维素薄膜电泳的实验步骤醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和粗糙面。点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜粗糙面一端2cm处画一细线，利用盖玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳 将薄膜粗糙面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；使U=160V，电泳45min。染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。漂洗及透明 将薄膜取出，移至漂洗液中漂洗若干次，至背景无色后置于玻板上，用滤纸去除多余液体后滴加透明液透明，烘干。2.4.3 醋酸纤维素薄膜电泳的实验结果三、 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定3.1实验目的1、用纸层折法观察肝脏谷丙转氨酶（ALT）的转氨基作用；2、用分光光度法测定血清谷丙转氨酶的活力。3.2实验材料与试剂3.2.1实验材料动物肝脏3.2.2实验试剂1、0.9% NaCl溶液 2、海砂3、1% 谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）4、1% 丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）5、0.1% KHCO3溶液6、0.025% 溴乙酸溶液（用1%KOH中和）7、2% 乙酸溶液8、苯酚的饱和水溶液将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24h后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。9、0.1% 水合茚三酮的正丁醇溶液 10、0.1% 标准谷氨酸溶液11、0.1% 标准丙氨酸溶液 12、1% KOH溶液3.3谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）3.3.1实验原理观察肝糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肝糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。3.3.2实验操作3.3.2.1谷丙转氨酶提取液制备谷丙转氨酶提取液制备方法2g肝脏 + 0.9% NaCl 6mL + 海砂200mg在低温下，研磨成浆用脱脂棉（或双层纱布）过滤，得提取液（滤液不清）3.3.2.2转氨作用试 剂对照管测试管 1测试管 20.1moL/L谷氨酸0.500.500.500.1moL/L丙酮酸钠0.500.500.500.1% KHCO30.500.500.500.025% 溴乙酸0.250.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.500.50加脱脂棉塞，45水浴，1.5h，时时振荡内容物2% 乙酸6滴6滴6滴沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.3.3纸层析1、方法纸层析方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆通过中心将滤纸绘成五等分扇形，用毛细管点样24次（直径不超过2mm）在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约12mm取一小滤纸条，将下端剪成刷状，再卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）80100烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80100显色2、实验结果标准Glu标准Ala测试管1测试管2对照管3.4血清谷丙转氨酶活力单位测定3.4.1实验原理本实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。 谷氨酸 丙酮酸 -酮戊二酸 丙氨酸3.4.2实验操作3.4.2.1标准曲线的绘制1、试剂（1）1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO412H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。（2）GPT基质液（谷丙转氨酶底物）取分析纯-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g置于小烧杯内，加入1mol/LNaOH溶液约10mL，使其完全溶解，并用1mol/LNaOH溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4，加磷酸缓冲液定容至100mL。可加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含-酮戊二酸2.0微摩尔，丙氨酸200微摩尔。在冰箱内可保存一周。（3）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼在200mL锥形瓶内放入分析纯2，4-二硝基苯肼19.8mg，加100mL 1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色瓶中，置冰箱内保存。（4）2.0mol/mL丙酮酸钠标准液精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。（5）0.4mol/LNaOH溶液2、方法试 剂试管号012345丙酮酸钠标准液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分摇匀，室温静置10min后，以0号管为空白，520nm波长下比色A520nm值各管所含丙酮酸量（mol）0.100.200.300.400.50各管相当于酶的单位数100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。注：（1）丙酮酸钠标准液mL数摩尔浓度（2mol/mL）（2） GPT活力单位为：每mL血清在37与pH=7.4的基质液作用60min，生成1mol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果1000即可。3.4.2.2酶活力的测定试 剂测定管测定管对照管120GPT基质液（mL）0.500.500.5037水浴，预温10min血清（mL）0.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温30min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.505.00血清（mL）0.100.4mol/L NaOH（mL）5.005.005.00摇匀后，室温静置10分钟，520nm波长下比色A520nm值查标准曲线的对应值，得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数3.4.3实验结果标准曲线的制作酶的活力单位标准曲线制作OD值00.1030.1970.2770.3540.483相当于酶的活力单位数0100200300400500样品的活力单位测定试管对照乌鸡家鸡吸光度00.0540.050由标准曲线可知0.1mL乌鸡血清中GPT活力单位为53。0.1mL家鸡血清中GPT活力单位为49。即 100mL乌鸡GPT活力单位为53000,100mL家鸡GPT活力单位为49000。3.4.4注意事项1、所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2，4-二硝基苯肼等均需冷藏；2、为防止溶血及其他因素对酶活性影响，实验所用器皿应干净、干燥；3、丙酮酸钠极易变质，配试剂时应选择外观洁白干燥者，否则应重结晶；4、转氨酶只能作用于-L-Ala，对D-Ala无催化作用。实验室多用DL-Ala，是因为便宜，如果采用-L-Aa，则用量需减半；5、如活性高于500U/100mL，应将血清稀释一定倍数重新测定，结果应稀释倍数；6、为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定pH、保温时间；7、选用固定分光光度计及比色杯减少误差。四、实验结果分析实验中得到，血清主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分就包括白蛋白、1 、2 、- 球蛋白,总胆固醇,谷丙转氨酶。4.1血清胆固醇的定量测定1 由实验结果可知家鸡的血清胆固醇含量比乌鸡的要高。2 误差分析：（1）血清总胆固醇的测定受水分的影响较大，因此是使用比色皿试管时，可能会由于内部含有少量的水而照成浓度误差较大。比色皿要清洗干净后晾干。 （2）绘制标准曲线时，对于较大误差点的取舍每个人有所不同，使得直线的斜率不一样，继而在定点时出现较大的偏差。 （3）比色之前，一定要将溶液摇匀，严格的按照实验步骤来操作，在未完全混匀的情况下，由于浓度的不均会影响吸光度。4.2凝胶层析 通过凝胶层析，先