混饲：恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响.doc

混饲：恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响2008级动物医学（2）班 王亚 指导老师 孙素玲（教授）摘要 目的：研究恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响。方法：40只小鼠随机分为5组，公母各半；组，为试验组。每天分别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组为对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食4h，后6h开始给食，持续饲喂四周，各组自由饮水。采用钙沉淀法制备小鼠肝微粒体，用测定代谢生成的对-氨基酚量的方法来测定苯胺羟化酶的活力。 结果 四个试验组的苯胺羟化酶的活力分别为190.45947.406 nmol/（mg.min）、131.82753.320 nmol/（mg.min）、32.19610.705 nmol /（mg.min），对照组为419.404198.971 nmol/（mg.min）。与对照组相比，4个试验组苯胺羟化酶的活力都显著下降（P0.01），且随着剂量的增大而活力下降。结论： 恩诺沙星在50mg/kg200mg/kg范围内能降低苯胺羟化酶的活性。关键词 氧氟沙星 ；肝微粒体；苯胺羟化酶恩诺沙星 ( C19H22FN3O3) 又名乙基环丙沙星,是第一个动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物, 1987年由德国拜耳公司首创投放市场, 我国在 1992 年由广东海康兽药厂研制成功, 其具有杀菌活性强、抗菌谱广、生物利用度高、毒副作用小等优点1。研究恩诺沙星的稳定性, 对于保证药物的安全有效、提高药剂疗效、减少给药次数、延长贮存期以及实际生产和药剂用量有重要作用2。陆英杰等研究出恩诺沙星在短期内对实验小鼠免疫细胞有影响,尤其是T淋巴细胞3。孙素玲、程玲玲等研究钼酸胺口服剂量在8.325 mg/kg66.6 mg/kg范围内能使大鼠苯胺羟化酶的活力增强4。曾五和(2002)等5、罗雅劲(2010)等6对恩诺沙星不同剂型在猪体内的药动学及生物利用度进行研究，结果显示，恩诺沙星剂型不同，在体内吸收、达峰时间及消除半衰期时间存在差异。余建娣等按磺胺间甲氧嘧啶 - 恩诺沙星 2m l(含磺胺间甲氧嘧啶 0. 1 g, 恩诺沙星 0. 05 g)试验剂量对 20只大白鼠进行腹腔注射, 常规饲养8d未见任何动物死亡, 故大白鼠对磺胺间甲氧嘧啶- 恩诺沙星的最大耐受剂量 ( MTD ) 0. 5 g / kgBW( 以磺胺间甲氧嘧啶计 ) 。即 M TD 大于规定使用剂量 25倍以上, 休药期应考虑在 28d以上7。关于恩诺沙星的研究目前国内只限于对微生态方法,关于恩诺沙星对机体的毒性作用，肝脏苯胺羟化酶活性的影响报道甚少,为此本试验通过对实验小鼠肝脏苯胺羟化酶活性影响的动态观察，为评价不同剂量的恩诺沙星对人和动物生物酶活性的影响，钒的安全评价等提供参考。1材料1.1动物的选择和处理小白鼠40只，体重2023g，安徽科技学院实验动物中心提供。观察饲养两周。1.2 主要试剂恩诺沙星：分析纯，合肥工业大学试剂厂，批号为030516；0.9%氯化钠溶液：安徽环球药业股份有限公司，批号为0410252；蔗糖：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为H20041215；三羟甲基氨基甲烷：分析纯，北京化学试剂公司，批号为031009；氯化钾：化学纯，中国上海试剂一厂，批号为040657；氯化钙：分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040628；氯化氢溶液：分析纯，上海东懿化学试剂公司，批号为20030910；过氧化羟基异丙苯：化学纯CP，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为T20040110；盐酸苯胺：分析纯AR，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为W20031020；三氯乙酸：分析纯，上海化学试剂采购供应站经销，批号为030114；无水碳酸钠：化学纯，山东博山试剂厂，批号为030508；氢氧化钠：分析纯，宜兴市第二化学试剂厂，批号为030401；苯酚溶液：分析纯AR，上海兴达试剂厂出品，批号为040301；对-氨基酚：化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040816；硫酸铜：化学纯，合肥工业大学化工厂，批号为040214。1.3 主要仪器FA1004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YP600型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；TDL802B型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；TGL16C型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；DY89I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所；THZC恒温震荡器，太仓市光明分析仪器厂；HHS恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；BCD502F型冰箱，青岛海尔冰箱股份有限公司；721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；1.4 药液的配制蔗糖TrisHcl缓冲液（PH7.4） 称取蔗糖85.6g，三羟甲基氨基甲烷1.2g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至1000ml，放置于冰箱中保存备用。Kcl-Tris-Hcl缓冲液（PH7.4） 称取氯化钾11.2 g，三羟甲基氨基甲烷1.21 g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再，用蒸馏水定容至l00ml，放置于冰箱中保存备用。氯化钙（Cacl2）溶液 称取氯化钙5.0 g，用蒸馏水定容至100ml。0.1mol/L的TrisHcl缓冲液（PH7.4） 称取三羟甲基氨基甲烷1.21 g，加约80ml蒸馏水溶液，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至100ml，放置于冰箱中保存备用。过氧化羟基异丙苯溶液 称取过氧化羟基异丙苯0.65g，用蒸馏水定容至l00ml。盐酸苯胺溶液 称取1029g盐酸苯胺，用蒸馏水定容至l00ml。70%三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸70g，用蒸馏水稀释至100ml。碳酸钠溶液（Na2CO3）溶液 称取10.6g，无水碳酸钠用蒸馏水溶解并稀释100ml。氢氧化钠（NaOH）溶液 称取氢氧化钠4g，用蒸馏水溶解并稀释200ml。酚试剂 量取苯酚溶液2ml，加NaOH溶液至100ml。0.25mol.L-1对-氨基酚标准溶液 精确称取27.28mg对-氨基酚，用少量的蒸馏溶解后转移入1000ml容量瓶中加水定容至1000ml。2 方法2.1 实验动物的分组和染毒方式 40只小鼠随机分为5组，公母各半；组，为试验组。每天分别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组为对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食4h，后6h开始给食，持续饲喂四周，各组自由饮水。各组的饲养管理条件相同。实验期间细心观察各组小鼠的情况。2.2样本的采集和处理2.2.1小鼠肝微粒体的制备（钙沉淀法）将小鼠停食24h后，颈椎脱臼处死，迅速剖开腹腔取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，并用滤纸吸干表面的水分。将肝脏称重后置于烧杯中，用手术直剪剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入蔗糖TrisHcl缓冲液，用电动玻璃匀浆机匀浆，转速600 r/min分，研磨上下移动8次。将匀浆倒入量筒，用缓冲液洗涤匀浆管并将其倒入量筒中，最后缓冲液的体积加至约5ml/g组织。将肝匀浆转移到离心管中，以600r/min平衡离心5min，弃取沉淀部分（细胞碎片和细胞核），上清液以12000r/min离心10min，弃取沉淀部分（线粒体）。量取去除线粒体的上清液的总体积，加入Cacl2溶液2ml，以14000r/min离心15min，弃取上清液，沉淀部分即为粉红色，半透明的微粒体。将微粒体沉淀，混悬于Kcl-Tris-Hcl缓冲液中，并用玻璃匀浆器充分混均匀，再经14000r/min离心15min，其沉淀即为经清洗的微粒体。最后将制备所获得微粒体悬混于Kcl-Tris-Hcl缓冲液（缓冲液用量约为1ml/g组织）中，用玻璃匀浆器充分混均匀，并分装后放置于冰箱中保存。使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白的含量。2.2.2 微粒体蛋白含量的测定（双缩脲法）8取6只试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准酪蛋白质溶液，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0毫升蒸馏水，然后加入1.0毫升双缩脲试剂在室温放置30min，于540毫微米波长下比色，最后光密度以Y表示，酪蛋白的含量以X表示，计算出曲线的回归方程一。吸取1毫升微粒体混悬液，加入1.0毫升的蒸馏水和4.0毫升双缩脲试剂，与前同样比色，根据吸光度和回归方程一求出微粒体混悬液蛋白的含量。2.2.3 苯胺羟化酶的活力的测定9.10取清洁干燥的试管按表1加入试剂,将上述各试管置于37水浴预温3min后，按顺序每管加入过氧化羟基异丙苯0.1ml，继续水浴震荡3min，按顺序每管加入三氯乙酸溶液0.3ml，微粒体悬混液0.5ml。经2000r/min离心10min后，分别将各管的全部上清液取于另一试管中，加入1ml酚试剂，室温下反应30min。以1号试管作参比，在630nm处比色测定，以吸光度为Y，对-氨基酚的含量为X，算出回归方程二。表1 标准液的配制试管编号缓冲液（ml）对-氨基酚标准液（ml）相当于对-氨基酚（nmol）1234567891.51.41.31.21.11.00.90.70.500.10.20.30.40.50.60.81.00255075100125150200250取清洁干燥的试管按表2加入试剂：表2： 样品测定液的配制空白对照管（ml）样品测定管（ml）微粒体缓冲液苯胺溶液蒸馏水0.51.40.10.51.40.1以下的操作除不再加微粒体外，其余步骤与标准曲线操作相同。以空白管作为参比，测样品管测的光密度值，依据回归方程二求出对应的对-氨基酚含量（nmol），并按下式计算苯胺羟化酶的活力。苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）= 生成的对-氨基酚含量（nmol）/微粒体蛋白浓度（mg/ml）0.532.3 统计方法用SPSS 11.0 for windows软件对试验数据的进行统计分析, 试验数据以()表示, 确定差异显著性作t检验,以P005为差异具有统计学意义。3 结果与分析3.1回归方程一根据表3所测的数据计算出回归方程一为Y= 0.065+1.76X ,r=0.9908 根据回归方程一计算出的蛋白质的含量,见附录。根据表4的数据14求出的回归方程二: Y= 0.021+2.858103 X , r =0.9802 根据回归方程二计算出对-氨基酚的含量，见附录。根据公式：苯胺羟化酶活力（nmol/mg.min）=生成对氨基酚的含量/微粒体蛋白浓度，计算出苯胺羟化酶活力见表5。表3：标准蛋白质溶液的吸光度试管编号相当于蛋白质（mg/ml）吸光度123456024681000.0570.1950.2660.4700.5573.2 回归方程二表4：标准液的吸光度试管编号相当于对-氨基酚（nmol）吸光度123456789025507510012515020025000.0690.1590.1980.3020.4240.5300.5940.681表5 恩诺沙星对苯胺羟化酶活力影响(，n=5)组别染毒剂量苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）050mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg419.404198.971190.45947.406131.82753.32082.26019.25932.19610.705注：与对照组比较，* p 0.01 * p 0.05对照组苯胺羟化酶的活力419.404198.97nmol/（mg.min），实验组苯胺羌化酶的活力为190.45947.406nmol/（mg.min），实验组苯胺羌化酶的活力为131.82753.320nmol/（mg.min），实验组苯胺羌化酶的活力为82.26019.259 nmol/（mg.min），实验组苯胺羌化酶的活力为32.19610.705 nmol/（mg.min），与对照组相比，四个实验组差异都极显著（P0.01），并且随着偏钒酸铵剂量的增加苯胺羟化酶的活力逐渐下降,而实验组之间相对比实验组与实验组差异极显著, 实验组与实验组差异显著，实验组与之间差异显著（P0.05），与，与，与之间不显著（P0.05）。4讨论在微粒体苯胺羟化酶的催化下，苯胺可以被代谢生成对-氨基酚，在碱性条件下，对-氨基酚可与苯酚形成蓝色靛酚复合物，并在630nm波长处显示最大吸收峰值。因此，本实验采用代谢产生的对-氨基酚量来间接判定苯胺羟化酶的活力9。外源性化合物在机体内代谢，需要许多酶的参与，代谢外源性化合物的酶系主要是肝微粒体酶，其中最主要的为混合功能氧化酶系。混合功能氧化酶系中有一种肝微粒体酶羟基化系统，这种酶系统催化一些外来化合物发生羟基化，从而发生代谢活化，使其作用增强，或者羟基化后其水溶性提高，易于排除体外，作用降低。而苯胺羟化酶是肝微粒体羟基化系统的一种酶，它催化苯胺发生羟基化生成对-氨基酚11。1 应翔宇,杨永胜.兽用新型抗菌药物恩诺沙星J.中国兽药杂志,1995,29(3):53- 56.2 黄一帆,俞道进.透皮吸收制剂恩诺沙星涂剂稳定性J.福建农业大学报,1999,28(2):196- 199.3陆英杰,潘锦初,钟海明,何胜培等.恩诺沙星对实验小鼠细胞免疫的动态影响J.佛山科学技术学院学报(自然科学版).2009年11月第27卷第6期:6-74 孙素玲等：钼对大鼠肝微粒体苯胺羟化酶活力的影响J.动物医学进展,2007,28(7):29-315 曾五和，陈杖榴，曾振灵等.恩诺沙星混悬液在猪体内的药动学及生物利用度J.畜牧兽医学报，2002,33(1):63-676 罗雅劲，孙永学，曾东平，等.恩诺沙星微囊在猪体内的药动学及生物利用度研究J.动物医学进展，2010,31(10):76-797 余建娣, 赵灵燕, 倪柏锋等.磺胺间甲氧嘧啶-恩诺沙星注射液急性毒性试验J.浙江畜牧兽医,2006年第五期:7-88陈钧辉，陶力，李俊，等. 生物化学实验M. 北京: 科学出版社， 2003：197199.9张桥，石年，朱心强，等. 卫生毒理学基础M. 北京: 人民卫生出版社， 2000：27827910Odutayo O. Odunuga, Gbolahan W. Okunade, Olufunso O. Olorunsogo. Reversal of Sodium Arsenite Inhibition of Rat LiverMicrosomal Ca Pumping ATPase by Vitamin C J. Bioscience Reports, 1999, 19 (1): 1115.11史志诚， 谢占武，朱蓓蕾，等. 动物毒理学M. 北京：中国农业出版社，2000：115，290295.表6 ： 样本吸光度和蛋白质的含量样本号吸光度蛋白质含量（mg/ml）-1-2-3-4-5-6-7-80.2520.2610.2870.3080.2670.3230.3000.3360.1060.1110.1260.1380.1150.1470.1340.154-1-2-3-4-5-6-7-80.3440.3600.2940.3270.3550.3240.3510.3110.1590.1680.1300.1490.1650.1570.1630.140-1-2-3-4-5-6-7-80.3700.3840.3970.3530.4160.4800.4660.4340.1730.1810.1890.1640.1990.2360.2280.210 IV-1IV-2IV-3IV-4IV-5IV-6IV-7IV-80.4670.4330.4000.4360.4590.4420.4090.4240.4990.4400.4610.4920.6380.4910.4530.5520.2280.2300.1900.2110.2240.2140.1950.2040.2470.2130.2250.2430.3260.2420.2200.277-1-2-3-4-5-6-7-8表7： 样本的吸光度和对-氨基酚的含量样本号对照组吸光度样品检测组吸光度对-氨基酚含量（nmol）-1-2-3-4-5-6-7-80.0470.1050.0620.0890.0380.0290.1260.0760.1060.1760.1150.1210.0870.0640.1890.11429.74154.23432.89034.9902