瑞利光散射光谱法研究牛血红蛋白与镝Ⅲ的相互作用.doc

瑞利光散射光谱法研究牛血红蛋白与镝（）的相互作用 常希俊 张莉作者简介：常希俊（1945-），男，教授，博士研究生导师。通讯联系人，09318912422(办) 09313730483(手机)，E-mail: 王邃 杨芳(兰州大学 化学化工学院，甘肃 兰州 730000)摘 要 在近生理条件pH=7.40时，牛血红蛋白和Dy（）的光散射强度均十分微弱，当两者相互作用后，光散射强度急剧增强，最大散射峰分别位于380nm和470nm处，并研究了此反应的影响因素和适宜的反应条件；在此条件下结合紫外可见吸收光谱，发现牛血红蛋白与Dy（）在不同浓度条件下相互作用，均是定量作用，并有很好的线性关系，但其光散射光谱和紫外光谱的峰值变化均有不同，我们可以推断出稀土离子浓度不同，血红蛋白与Dy（）的作用机理不同，并探讨了其作用机理。关键词 牛血红蛋白，Dy（），瑞利光散射，紫外可见吸收光谱0引言蛋白质是生命体所必不可少的生命基础物质，是生命机体进行各种生理活动的主要承担者。蛋白质的功能与其结构构象密切相关，有什么样的结构就有什么样的功能，反之亦然。蛋白质某种功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关，而这些元素大多是金属元素。研究金属元素同蛋白质的相互作用，特别是金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质的构象变化，阐明某种金属元素的作用机理，从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响，预防中毒及环境污染治理等有重要意义。目前，研究蛋白质与金属离子作用的方法，常见于荧光法1，紫外差光谱法2，微透析取样法3等。本文运用瑞利光散射这一新技术4研究了稀土元素镝（）与牛血红蛋白相互作用的光谱特征、适宜的反应条件和影响因素，并在此反应条件下结合紫外可见吸收光谱研究了稀土元素镝（）与牛血红蛋白的相互作用，初步探讨了其相互作用的机理。1 实验部分1.1 仪器与试剂RF-540型荧光分光光度计（日本岛津公司）；UV-240型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；SHZ-88-1台式水浴恒温振荡器（中国江苏）；pHS-10C型酸度计（中国萧山）。 牛血红蛋白（Hb）,上海生物化学研究所, 配成1mgml-1的溶液，置于4的冰箱保存。氧化镝，用浓盐酸加热小心溶解，待蒸发近干，配制成1 mgml-1的储备液，实验时稀释成1.010-3 molL-1的溶液。缓冲溶液为硼酸-硼砂-NaCl、乙酸-乙酸钠，常法配置，并在pHS-10C型酸度计上校正其准确的pH值。配制1 molL-1和0.1 molL-1的NaCl溶液。1.2 实验方法于10ml的比色管中依次加入1.010-3 molL-1的Dy（）溶液、pH=7.40的硼酸-硼砂-NaCl的缓冲溶液和一定量的牛血红蛋白溶液，并用缓冲溶液稀释至刻度，置于水浴振荡器中恒温反应一定时间，然后用RF-540荧光仪在300600nmex=em时扫描得瑞利光散射光谱。2 实验结果 2.1 光谱特征Hb、Dy（）溶液及Hb和Dy（）混合后的RLS光谱见图1。由图可见，Hb和Dy（）的RLS信号很弱，但在Hb溶液中加入一定量的Dy（）后能引起RLS信号急剧增强，并在380nm和470nm处产生较强的RLS信号（图1）。故出现的增强RLS现象自于Hb和Dy（）的相互作用。在弱碱性条件下，带正电荷的Dy（）与蛋白质中的带负电荷的部分氨基酸残基5通过静电作用，使Dy（）聚集在蛋白质分子表面，从而形成大的颗粒，导致剧烈RLS增强。图1 Hb与Dy（）相互作用的RLS光谱Fig.1 The Rayleigh light scattering (RLS) spectraof Hemoglobin and Dysprosium（） Hb 0.1 mgml-1 ; Dy（） 3.010-5 molL-1; pH=7.40 1. Hb; 2. Dy（）; 3. Hb-Dy（）. 2.2 反应条件的优化2.2.1 反应时间与稳定性室温下，Hb和Dy（）混合在震荡器中反应两个小时后，RLS在380nm和470nm的峰值基本不变，反应趋于稳定，且在30mins 稳定，随后稍有下降。实验控制在2小时为最佳反应时间。2.2.2 反应温度的影响 随着温度的升高，IRLS降低。这是因为离子缔合物之间的静电引力和疏水作用均是弱结合力，温度上升增加了分子的热运动，从而降低了离子缔合的作用力，所以IRLS随温度的增加而降低。实验控制在25下进行。2.2.3 酸度的影响酸度对Hb-Dy（）体系的RLS强度的影响结果见图2。由图2可见，当溶液的pH改变时，Hb-Dy（）体系的RLS强度有所不同。当pH=6.08.0时，Hb-Dy（）体系的RLS强度稳定且灵敏度很高。这是因为在pH=6.08.0时血红蛋白带有较多的负离子可以与Dy（）很好的结合，RLS强度较强；而在酸性条件下血红蛋白带有正电荷不能与带有正电荷的Dy（）发生静电结合，RLS强度很小；当pH8.0时，RLS强度同样很小，这是因为碱性太大不利于蛋白质与Dy（）很好的结合。本文选择pH=7.4的硼酸-硼砂-NaCl的缓冲溶液控制体系酸度。图2 酸度对RLS强度的影响Fig.2 Dependence of the RLS intensity on the pH2.2.4 Dy（）浓度的选择Hb浓度固定在0.1 mgml-1，当Dy（）浓度较小时，方法的灵敏度较低，这是由于Hb不能与Dy（）充分结合。当其浓度在2.010-5 6.010-5 molL-1范围内变化时，灵敏度最大且稳定，并且在其范围内Hb与Dy（）结合的RLS强度随Dy（）浓度的增大而增强。继续增大Dy（）浓度，散射光强度减弱，从而导致灵敏度降低。实验选择Dy（）浓度在2.010-5 6.010-5 molL-1 。2.2.5 强电解质的影响加入氯化钠进行离子强度实验。表明在NaCl浓度低于0.5 molL-1时，RLS强度随离子强度的增加而略有增大，这是由于在蛋白质溶液中加入NaCl的浓度很小时，盐的离子与蛋白质分子中的离子和极性基团作用，降低了蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加，牛血红蛋白分子的四个侧链更好的伸展，从而有利于Dy（）在与蛋白质侧链上的堆积与结合，导致RLS强度随离子强度的增加而略有增大；当NaCl浓度大于0.5 molL-1时，RLS强度随离子强度的增加而略有减小，这时由于过高的盐离子浓度与水这种偶极子作用，破坏了蛋白质分子表面的水化层，反而使蛋白质的溶解度降低，这样就降低了Dy（）与蛋白质作用的机会6, 7。2.2.6 试剂加入顺序的影响因为Dy（）与蛋白质作用所形成的缔合物的RLS强度与pH有很大关系。因此，实际的加入顺序对缔合物的RLS强度也有很大影响。其原因是如果Dy（）先与蛋白质在酸性条件下作用，这时Dy（）与蛋白质都带正电荷不能有效结合，必将导致缔合物的RLS强度降低。因此，应先用缓冲溶液调节酸度，再加蛋白质。按照这种顺序进行实验，结果表明有以下好处：（1）RLS强度最大；（2）反应达到平衡的速度快，并且RLS强度稳定的时间长。2.2.7 共存物质的影响干扰试验表明，该方法对金属离子、氨基酸、糖类允许浓度较高，达10-3 mol/L数量级。2.3 Dy（）与Hb相互作用的光谱图2.3.1 随Dy（）浓度变化的Hb-Dy（）体系光谱图不同浓度的Dy()与Hb在25反应两小时的RLS光谱如图3（上述实验表明，此条件为反应最佳条件）。由图3可见，RLS强度（470nm处）随离子浓度的增大而增强。将散射强度I470nm(I470nm= I I0，I0为Hb的散射强度)对离子浓度作图（图4），发现有很好的线性关系，说明Dy()与Hb的结合反应是定量进行的。同时，不同浓度的Dy()与Hb在25反应两小时的紫外可见吸收光谱如图5。由图5可见，紫外可见吸收光谱在210nm附近和410nm附近有吸收，通常蛋白质的紫外吸收光谱8在210-250nm有吸收，这由于多种因素引起的,如蛋白质中芳香族和其它残基的吸收及由于某些氢键的吸收或者与其它构象和螺旋有关的相互作用；在400nm附近处有一个soret带，这是血红素的-*跃迁带9。在210nm附近处的吸收峰随着Dy()浓度的增加而增强，并且略有红移现象，说明Dy()与Hb的部分氨基酸残基发生结合；但是410nm附近处的吸收峰几乎没有变化。 图3 Hb-Dy（）体系的RLS光谱 图4 RLS强度与Dy（）的线性关系Fig.3 The Rayleigh light-scattering (RLS) spectra Fig4.The relation between RLS of HemoglobinDysprosium（） spectra intensity and Dy（）Hb. 0.1 mgml-1; pH=7.40; Dy（）的浓度：1. 0.0；2. 2.510-5 molL-1；3. 3.010-5 molL-1；4. 3.510-5 molL-1； 5. 4.510-5 molL-1；6. 5.510-5 molL-1 .图5 Hb-Dy（）体系的紫外可见吸收光谱 Fig.5 Absorption spectrum of Hb-Dy（） Hb 0.1 mgml-1; pH=7.40; Dy（）的浓度：1. 0.0；2. 2.010-5 molL-1；3. 4.010-5 molL-1；4. 6.010-5 molL- 随Hb浓度变化的Hb-Dy（）体系光谱图不同浓度的Hb与Dy()在25反应两小时的RLS光谱如图6（上述实验表明，此条件为反应最佳条件）。由图6可见，在410nm处有一个峰谷，并且其峰谷随着Hb浓度的增大而降低。将散射强度I410nm(I410nm= I I0 ，I0为Hb的散射强度)对Hb的浓度作图（图7），发现有很好的线性关系，说明Dy()与Hb的结合反应是定量进行的。同时，不同浓度的Hb与Dy()在25反应两小时的紫外可见吸收光谱如图8。由图8可见，紫外可见吸收光谱在210nm附近和410nm附近有吸收，在210nm附近处的吸收峰随着Hb的浓度的增大而增强，并且出现红移现象；与上述反应不同的是在410nm附近处的吸收也发生了相应的变化，此处的吸收峰随着Hb浓度的增大而增强。 图6 Hb-Dy（）体系的RLS光谱 图7 RLS强度与Hb的线性关系Fig.6 The Rayleigh light-scattering (RLS) spectra Fig4.The relation between RLS of HemoglobinDysprosium（） spectra intensity and HbDy（）3.010-5 molL-1 ; pH=7.40; Hb的浓度：1. 0.06 mgml-1；2. 0.75 mgml-1；3. 0.09 mgml-1；4. 0.12 mgml-1； 图8 Hb-Dy（）体系的紫外可见吸收光谱 Fig.8 Absorption spectrum of Hb-Dy（） Dy（）3.010-5 molL-1 ; pH=7.40; Hb的浓度：1. 0.0；2. 0.03 mgml-1；3. 0.06 mgml-1；4. 0.09 mgml-1； 5. 0.12 mgml-1； 6. 0.15 mgml-1.3讨论3.1 RLS光谱与吸收光谱图9为Hb-Dy（）体系的瑞利光散射光谱和紫外吸收光谱。从图中可以看出，RLS的峰在380nm和470nm处，吸收峰在210nm和410nm处，RLS的两个峰都位于吸收光谱的峰谷。不像共振光散射光谱，共振光散射光谱的峰位于吸收带附近，而光散射光谱的峰位于吸收光谱的峰谷，光散射光谱的峰谷位于吸收光谱的吸收峰。这种不同现象可以这样解释10：根据共振光散射理论，强度的增加由于在可见吸收区溶液散射指数的增加，所以通常这种增加位于吸收带附近。在Hb-Dy（）体系中，吸收带没有散射强度的增加，吸收峰对应于光散射的峰谷，所以不是共振散射现象。光散射光谱的峰和峰谷是由于Hb-Dy（）体系对RLS 强度的吸收。这种吸收不但引起光散射光谱的峰和峰谷，还引起RLS 光谱和吸收光谱的这种对称关系。图9 RLS光谱和吸收光谱Fig.9 RLS spectra and absorption spectra1. RLS spectra of Hb-Dy（） 2. RLS spectra of Hb-Dy（） 3. Absorption spectra of Hb-Dy（）3.2 Dy（）浓度和Hb浓度不同对Hb-Dy（）体系影响的比较 依照上述实验结果，列出表一以便比较滴加Dy（）和Hb浓度不同时对瑞利散射光谱和紫外吸收光谱的不同影响。从图中我们可以清楚地看到两种情况对光谱的不同影响，可以推测是由于它们作用的机理不同，结合部位不同导致的。（1）、Dy（）浓度增大，Hb浓度不变时：由于Dy（）浓度增大，促进更多的Dy（）通过静电作用与蛋白质中的带负电荷的部分氨基酸残基作用，聚集在蛋白质表面，而使微粒尺度增大，表现为散射强度在470nm处的峰随着Dy（）浓度的不断增大而成线性关系增强。（2）Hb浓度增大，Dy（）浓度不变时：由于此时Hb浓度较大，浓度不变的Dy（）要与不断增加浓度蛋白质更好更有效的结合，就会使蛋白质结构发生变化，有可能使其部分氨基酸残基发生破坏，暴露出能与Dy（）结合的部位，与浓度不变的Dy（）发生作用，从而导致微粒尺度变小，表现为散射强度在410nm处的峰谷随着Hb浓度增大而降低；同时，与前面相比紫外吸收在410nm处的峰也有明显变化，在400nm附近处是一个soret带，这是血红素的-*跃迁带，此处峰随着Hb浓度增大而增强，更加说明了两种情况的结合部位不同，作用机理不同。由此可见，稀土离子与蛋白质结合，通过改变蛋白质微构象或干扰蛋白质对其他离子结合两种程度的不同而发挥其剂量效应11，影响蛋白质的功能；也就是说，稀土离子与蛋白质结合的位点与稀土离子的浓度有关，浓度不同，直接影响稀土离子与蛋白质的作用结合位点，同时也一定会表现出对生理活性的不同影响，这还有待于进一步的研究。表一、Hb-Dy（）体系的光谱比较浓度变化 散射强度变化 紫外吸收变化Dy（）浓度 470nm处的峰强度随浓 210nm处的吸收峰随浓度增大，Hb浓度 度增大而增强，并有很 增大而增强，410nm处的不变。 好的线性关系。 吸收峰随浓度增大不变。Hb浓度增大 ， 410nm处的峰谷强度随浓 210nm处的吸收峰随浓度Dy（）浓度 度增大而降低，并有很 增大而增强，410nm处的不变。 好的线性关系。 吸收峰随浓度增大而增强。 参 考 文 献1 梁宏，邢本刚，吴庆轩，等. 铜（），铁（）与人血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究. 化学学报，1999，57（2）:161165.2 杨斌盛. 铕（）离子与人血清脱铁转铁蛋白结合的紫外差光谱研究. 化学学报，1999，57：503509.3 郭明，孔亮，毛希琴，等. 微透析取样法研究金属离子与蛋白质的竞争结合作用. 中国科学（B辑），2000，31（6）：499503.4 Pasternack R F,Bustamante C,Collong P J.et al. 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