中性粒细胞碱性磷酸酶.doc

中性粒细胞碱性磷酸酶 （ N-ALP NAP） 碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。一正常分布： 人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性，主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中，其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞，血小板，浆细胞等均为阴性反应，网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。二生理变化： 1 年龄变化：新生儿ALP极高，随后下降，成人较儿童期减低，老年期（6）最低。2 性别差异：无差别，但也有报道女男。3 季节变化：夏季为高。4 应激状态下的变化：紧张、恐惧、休克、激烈运动等。5 妊娠期的变化：妊娠23个月时。NAP轻度高。以后逐月趋于显著。6 与激素的关系：肾上腺皮质激素，雌激素和ACTH都有使NAP活性升高，有人认为ACTH的作用是通过肾上腺皮质而发生的。三临床意义：1 重度增高： 类白血病反应：NAP活性极度增高与CML鉴别。 感染：细菌感染的NAP改变比较明显，其中，NAP活性高度增高者见于各种急性化 脓性感染（如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等）。2 中度增高：感染：见于支气管肺炎、肾盂肾炎。贫血：AA。非AL性骨髓增生性疾患：PV、骨髓纤维化、CML合并骨髓硬化症、持发性ITP、AL：ALL。恶性淋巴瘤：何杰金氏淋巴瘤。3 轻度增高：感染：上呼吸道感染、肺结核等。网状细胞增高，遗传性低NAP症。AL：MM、神经母细胞瘤。贫血：溶血性贫血。4 降低：贫血：镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。AL：CML显著减低感染：病毒性感染、特别是病毒性肺炎。5 正常或无规律：急粒的NAP活性可减低也可正常。并发感染时可有中度升高。当治疗 后充分缓解时，有些NAP活性可恢复正常。单核细胞改变缺乏的规律性，绿色瘤和 M6与急粒相似。 网状细胞肉瘤多数病例增高，少数在正常范围内。 淋巴肉瘤可增高，可正常。MDS可增高、正常和减低。 主要鉴别：1CML类白 2PNHAA 3ALLANLL4PV反应性PV 5细菌升高病毒（特别是肺炎）四染色方法： 碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶，方法不同，原理不同。国际标准化委员会提出。推荐的方法应该是快速，简便，容易重复，并有很宽的技术范围。方法：（1）钙钴法 （2）未取代萘酚法：底物磷酸萘酚钠。 （3）取代萘酚法：国际标准委员会推荐两种方法:A 1963年Kaplow 等：萘AS-BI磷酸盐B 1963年Tomonaga等：萘AS-MX磷酸盐 国际标准化委员会认为萘磷酸盐产生的反应产物。生色团不好，并且是水溶性的，因此使用这种基质的方法是不满意的，只有考虑应用那些萘磷酸的代用品。适当耦联物的选择是基于从技术观点看耦联物的特性，及它们是否容易获得，这两个方面。萘AS-BI磷酸盐，结果快。萘AS-MX磷酸盐，因为它耗费时间，除日本外其它国家很少了解，但它对白细胞中酶染色的质量是比较好的。其它细胞化学反应的技术因素，如固定pH范围，温浴时间，温浴介质的缓冲作用等也应予以考虑。国外大都应用萘酚AS-BI磷酸。上海儿研所对三种白细胞碱性磷酸酶染色方法的评价，认为（1）钙钴法平均阳性指数最低仅2.12。虽有人主张延长孵育时间以提高阳性率和阳性指数，但由于孵育时间长，易使阳性产物扩散；且钙钴法的基质液的配制较麻烦，影响其结果的因素很多。（2）未取代萘酚法虽然反应时间缩短，阳性指数正常值相对较为稳定，但基质液不能长期保存，每次需临时配制孵育液。（3）取代萘酚法较其它方法有以下特点，酶活性显示较充分，正常值68%以上可以显示LAP活性，阳性指数均值较其它方法高，反应酶的钝化与丢失较少，阳性产物色泽鲜明，溶解度低，不扩散，因而定位精确，有利于评定ALP活性强度的分级，例三者平均值。表一 NAP三种试验方法比较 组 别 钙钴法 未取代萘酚法 取代萘酚法 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数范围X（平均）范围X（平均）+SD范围X（平均）范围X（平均）SD范围X（平均）范围X（平均）SD高阳性指数组 （N=24）35-81 6866-25421013.540-76 7045.8-1541011785-100 93347-540450.35正常阳性指数组 （N=60）20-39 3441-82621817-40.5 2618-69.849.52068-99 84.1164-380240.256.2低阳性指数组 （N=22）10-40 2912-845720 6-55 40 6-70 402840-80 6124-39618638 染色方法介绍：一 钙-钴法：（一） 原理：磷酸酶能水解各种磷酸有机盐，并释放出磷酸，组化方法是利用被释放出来 磷酸与Ca2+结合，成为磷酸钙而沉淀下来，再与硝酸钴与硫化铵作用。生成黑色的 硫化钴。（二）试剂 1孵育液：3% -甘油磷酸钠 10ml 2% 巴比妥钠 30ml 2% Ca(NO3)2 20ml 2% mgsO4 2ml 混匀，以0.5NaoH调pH至9.3-9.4置5后即可。 22%巴比妥钠 31%硫化铵 40.5%伊红 50.5%美兰（三）步骤： DW1g DW冲 干 干 冲B 95%乙醇 孵育液 2%硝酸钴 1%硫化铵5 0.5%伊红 0.5%美兰 镜检 固定10 376h 干 5 干 冲 冲 干（四）正常值： 阳性率 阳性指数 B 53.7% 81.96.4 BM 49.2% 84.79.8 此方法阳性率低，时间长，稳定性差，影响因素多，现基本不在采用。二 偶氮染料法：萘AS-MX磷酸盐（一）原理：底物在pH 9.5被WBC中酶水解产生磷酸和芳基萘胺，芳香萘胺再与偶氮偶联， 形成不溶性染料。（二）试剂： 萘酚AS-MX磷酸钠盐（sigma） 固兰RR 冰醋酸 -氨基-2-甲基1,3丙二醇 N,N-二甲基甲酰胺 甲醛 甲醇 藏红花红Oa固定剂：取10ml甲醛和0.01ml冰醋酸，加入到90ml甲醇中充分混匀，保存在冰箱、 冰盒中备用。 b贮存缓冲液（0.2M PH 8.6丙二醇） 取2.1g-氨基-2-甲基1,3丙二醇溶于4ml N,N-二甲基甲酰胺中，再向此溶液中， 加入76ml贮存缓冲液和120ml DW，混匀放4冰箱，备用。 C作用液：贮存底物溶液 20ml 固兰RR 20mg 充分混匀，用前迅速过滤。 d复染液：0.5% 藏红花红O。（三）步骤： 水冲 水冲 B 固定剂 作用液 复染液 5 干 2h 干（四）结果：酶活性呈现为不连续的分散的兰色颗粒，在人中性粒细胞胞浆中，细胞浆染 成浅红色，很少的淋巴细胞可呈现很弱的反应，其它细胞无反应。（五）分级标准： （-）无燃料颗粒。 （+）5个燃料颗粒以内。 （+）5个以上到30个可以清楚计数的颗粒。 （+）30个以上呈不同均匀分布的颗粒。 （+）30个颗粒以上分布不均匀，颗粒之间可以清楚辨别。 （+）中性粒细胞胞浆内充满于颗粒，且颗粒之间不可清楚辨别。（六）正常值：阳性率68% 阳性指数164-380 上海儿研所80年进行观察：（一） 不同重氮盐的显示效果。从分解速度，产物色泽和无解来说以坚牢兰RR所得结果最 好。重氮盐名称 抑 制 分 解 色 泽 沉淀类型坚牢紫B + + 综 红 颗 粒坚牢兰BS + -+ 综 黑 明显扩散坚牢兰B + 蓝 黑 清度扩散坚牢兰RR + -+ 浓 蓝 颗 粒 （二）不同孵育时间对LAP活性的影响从表3中可见孵育2-4h反应最充分，所以选用2h。（三）不同浓度坚牢兰盐RR对显示结果的影响。表4坚牢兰盐RR浓度 （mg/ml）例 数 阳 性 指 数 范 围 均 值 3 8 53-87 71.4 2 8160-180172.1 1 8181-246205.4 0.5 8161-270221.0 0.25 8141-189170.1 浓度在0.5-1mg/ml时，LAP活性显示最充分，沉淀物也不扩散。（四）不同浓度萘酚AS-MX对结果的影响。表5例号 阳 性 指 数10mg7mg5mg4mg2mg 1154222210220 54 2 52 62 60 50 19 3333438466443 72 4380455442450140 5 58 44 60 52 33 6162180197193102 7206200221166104 8170174216222 74 9114136145166 9010188177172 92 7611 86 79100 94 30 随底物不断增高，阳性率在4mg以上并无明显变化。七注意事项1 重氮盐和底物保存4冰箱，避免与皮肤接触或吸入。2 一般用B比BM片好，在细胞分布比较均匀的部位进行计数，三日内