树突状细胞瘤苗的制备与临床应用进展.doc

南京大学硕士研究生毕业论文树突状细胞瘤苗的制备与临床应用进展邹征云 刘宝瑞南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科,江苏 南京 210008摘要 树突状细胞瘤苗可诱导荷瘤动物的保护性抗肿瘤免疫应答反应，这一发现使肿瘤治疗领域倍受鼓舞。本文综述肿瘤免疫治疗中树突状细胞瘤苗的基础研究与临床应用进展。关键词 树突状细胞/免疫学;癌症疫苗;综述文献中图分类号 R730.51Advances in the Preparation and the Clinic Application of Dendritic Cell-Based Tumor Vaccines Zou Zheng-yun,Liu Bao-rui. Department of Oncology, Nanjing Drum Tower Hospital, Faculty of Medicine, Nanjing University, Nanjing210008,China.Abstract:Dendritic cell-based tumor vaccines can induce tumor models protectitive antitumor immunity,and these inspire us.This paper reviews current advances in the preparation and the clinic application of dendritic cell-based tumor vaccines for tumor immunotherapy. Key Words: dendritic cells/immunology;cancer vaccines;review literature树突状细胞（dendritic cell）简称DC，是体内最有效的专职抗原递呈细胞（APC），通过MHC、类途径将外源性抗原呈递给CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞，诱导机体产生抗原特异性CTL，识别和杀伤肿瘤细胞；通过IFN-等细胞因子的分泌而抑制肿瘤血管生成；同时激发免疫记忆保护，在宿主再次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用。有关DC的研究国内已有多篇文献综述发表，但集中阐述DC制备过程优化及临床应用进展的文献却较缺乏。本文将近年来有关树突状细胞瘤苗制备中的基础研究与临床应用最新进展作一综述。1 DC的基础研究1.1 DC的来源、分类及制备技术体内大多数DC来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到脑以外的全身各个脏器；数量极少，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的1%以第一作者简介邹征云(1972-),女,江苏姜堰人,主治医生,硕士研究生,主要研究方向是恶性肿瘤的免疫治疗。下。目前，DC可以从外周血或淋巴组织（如淋巴结、淋巴液、脾脏）中直接分离获得；亦可从骨髓、脐血或外周血中CD34+前体细胞、PBMC中CD14+或CD14-前体细胞经培养获得。其中，CD34+前体细胞培养过程中需加入GM-CSF及TNF-；CD14+前体细胞培养过程中需加入GM-CSF及IL-4；CD14-前体细胞培养过程中必须加入GM-CSF、IL-4及TGF-。直接分离或从前体细胞经培养获得的DC绝大多数是不成熟DC（imDC）,其表型为CD3-，CD11-，CD14-，CD16-/CD56-，CD19-，CD33-，CD40-orlow，MHC+,MHC+,CD80low,CD83-,CD86low,CD45RA+;imDC体外激发混合淋巴细胞反应(MLR)的能力较弱,但具有极强的抗原内吞、加工处理能力。当imDC在摄取抗原或接受到某些刺激（主要是炎性信号如LPS、IL-1、IL-6、CD40L、TNF-等）或在单核细胞条件培养基（如AIMV）中培养可分化成熟；成熟DC(mDC),其MHC、类分子、辅助刺激分子、粘附分子的表达均显著提高，如B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD58、ICAM（CD54）、CD40、与溶酶体相连的膜糖蛋白（LAMP）等；其中，CD1a+,CD11c+,CD83+是DC成熟的标志。DC在成熟的同时发生迁移，由外周组织进入次级淋巴器官，在此激发同种混合T淋巴细胞反应；mDC抗原摄取、加工能力大大降低。1.2 DC与细胞因子及细胞表面分子之间的相互作用1.2.1 DC与IL-4/GM-CSF:IL-4/GM-CSF是从小鼠骨髓途径制备DC所必须的重要的细胞因子。动物实验证实采用rGM-CSF/IL-4持续注射，每天10g，共注射7天。结果：小鼠脾脏中DC的总量增加了5.7倍，CD11+DC增加了2.7倍；髓系CD11c+/CD11b+DC及淋巴结中CD11c+/CD8+DC的量亦有所增加；产生的DC主要集中在T细胞富集的白髓区。IL-4/GM-CSF联合体内注射是诱导产生大量功能性DC的有效方法1。 1.2.2 DC与IL-13:Goxe等2比较了有血清培养基RPMI1640及无血清培养基X VIVO 及AIMV这三种培养基对DC的影响，发现AIMV培养基联合GM-CSF及IL-13是最佳的培养基，较AIMV培养基联合GM-CSF及IL-4或其他培养方式能够获得更多、更成熟、表型更稳定、更能有效刺激自体及异体T 细胞应答反应的DC。原因可能是IL-4可促使Th0向Th2分化，而Th2对DC 的形成有抑制作用。IL-13却不同于IL-4，它只作用于DC表面的IL-4R，对T淋巴细胞无影响。 1.2.3 DC与CD40L:早期文献报道CD40L可促使DC成熟。Chen等3对小鼠B细胞淋巴瘤38C13 进行研究发现采用38C13分离出的肿瘤独特型Id连接CD40L脉冲DC后能够使DC所表达的CD40、CD80、CD86、MHC表达上调，IL-12的分泌量增加，抗Id抗体应答水平提高，抗38C13肿瘤的活性明显增强；而单独采用Id负载DC却无此种现象发生。说明CD40L连接自体肿瘤抗原脉冲DC能够诱导产生更强的抗肿瘤免疫应答反应。1.2.4 DC与Flt3L:DC培养过程中加入Flt3L，能够使DC的扩增倍数提高20倍4。1.2.5 DC与HSPgp96 :gp96是热休克蛋白（HSP）的原形物质，当它与DC表面的CD91结合后可诱导DC的成熟，促使DC分泌IL-1、IL-12及单核细胞趋化因子-1，并上调DC 表面的MHC、MHC、CD80、CD86、CD40的表达，从而诱导机体产生特异性CTL，对表达gp96的肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫应答反应5。1.3 DC与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）DC与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）之间具有协同作用，DC能通过Th1细胞而解除TIL所处的免疫抑制状态，使TIL的抗瘤效应大大增强，依据如下：负载肿瘤抗原的DC与TIL共同孵育后可使1)TIL的扩增倍数在第21天时增加9.4-14.3倍,2)CD3+CD56-TCR+（CD4+及CD8+）细胞量明显上调,3)使T细胞限制性杀瘤效应增强,4)TIL表达的IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-6 mRNA增加6。奥地利学者Friedl等7及国内学者刘剑勇等8研究均发现采用肝癌全细胞冻融抗原致敏的DC激活TIL后，能显著增强TIL对自体肿瘤细胞的杀伤力；Terheyden等9研究亦证实CD40L-CD154能促使DC成熟，从而促使恶性黑色素瘤TIL中特异性CD8+及产生IFN-的CD4+T细胞大量增殖，特异性抗肿瘤效应大大增强。这些研究为DC与TIL的联合应用走向临床奠定了理论基础。1.4 DC与细胞因子所诱导的杀伤细胞（CIK）Martin等10报道CIK细胞培养的过程中加入自体DC后CIK细胞的杀瘤活性显著增强，但当封闭IL-12后CIK的杀瘤效应明显降低，推测DC对CIK杀瘤的增强效应可能与DC分泌IL-12及DC与效应细胞的表面分子之间的相互作用产生的。国内学者研究亦发现慢性粒细胞性白血病患者的自体DC-CIK与患者骨髓中的单个核细胞共同培养后ph染色体转阴率明显高于LAK细胞组11。这些均说明了DC与CIK之间有协同作用。1.5 DC与各种肿瘤抗原DC必须负载肿瘤抗原才能建立抗肿瘤免疫应答，不同性质的肿瘤抗原负载DC所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，有的甚至无效。所以，寻找合适的肿瘤抗原负载DC尤为重要。1.5.1 全细胞性肿瘤抗原:由于目前大多数肿瘤细胞抗原类型尚未明确鉴定，因而给予全细胞性肿瘤抗原由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、呈递可谓方便有效。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。Schnurr等12研究发现采用200Gray照射或43水浴2h，所得到的凋亡的胰腺肿瘤细胞作为肿瘤抗原负载DC较冻融抗原更易激发抗肿瘤免疫应答反应。1.5.2 抗原基因作为肿瘤抗原:大多数MHC限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原多肽的DC。人们将肿瘤抗原基因以裸DNA或RNA的形式导入DC，使DC持续以合适的方式将肿瘤抗原的多个表位与MHC结合，表达于DC的表面，从而更有效的激活T细胞产生抗肿瘤免疫应答反应。DF3/MUC1抗原在人类乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等上皮性肿瘤中过度表达，将MUC1RNA转染DC后DC 将表达MUC1及共刺激分子。将1106转染后的DC经MUC1+/MC38移植瘤鼠的尾部皮下注射，每周1次，共2次后，可在小鼠腹股沟淋巴结中检测到MUC1+DC，荷瘤鼠产生了抗MUC1+/MC38癌的免疫应答反应，使肿瘤消退；此外，从小鼠体内分离得到的CTL体外对MUC1+/MC38肿瘤细胞亦产生了很强的特异性杀伤作用13。Heiser等14采用自体肾癌细胞RNA转染DC体外诱导T细胞进行杀瘤效应研究，具体过程如下：常规方法从肾癌患者PBMC中制备imDC，在培养的第8天加入自体细胞RNA，制成肾癌细胞RNA转染的DC瘤苗，再以1：10的比例每周1次共2次将DC加入到T淋巴细胞中，从而诱导产生了大量多克隆的效应T细胞，其中，CD8+T细胞至少占45%；将效应细胞以40：1的比例与靶细胞混合培养，靶细胞包括原发灶、淋巴结及骨髓中的转移的肿瘤细胞、正常肾组织细胞及同种异体肾癌细胞；结果所产生的多克隆的效应T细胞对原发及转移肿瘤、异体肿瘤均有较强的杀伤作用，而对正常的肾组织细胞却无杀伤作用。结果提示：1)肿瘤细胞的表面抗原在正常组织中不表达或表达很低,2)肾癌间有共同抗原,3)临床若采用此方法是否会诱发产生自身免疫病仍有待进一步研究。Boczkowski等15研究证实，从黑色素瘤B16/F10.9细胞株中分离的mRNA扩增后转染DC，鼠体内注射亦能诱导出多克隆CTL应答，对B16/F10.9具有特异性杀伤作用。具体过程是将B16/F10.9肿瘤细胞植入鼠脚掌，当原发肿瘤长至直径5.5-7.5mm时切除肿瘤，2天后采用上述瘤苗，每周1次，共3次；结果，观察25-30天，对照组鼠均发生了肿瘤的肺转移，肺重量增加的4倍，且发生了其他器官转移；而治疗组未发生肺转移。Boczkowski等还证实了术后肿瘤组织冰冻切片中分离的RNA扩增后转染DC仍能在体内诱导产生抗肿瘤免疫应答反应。由于术后大部分患者缺乏肿瘤细胞来源，因而从肿瘤组织冰冻切片中分离的RNA不失为肿瘤抗原来源的较好途径。2 DC瘤苗的临床应用2.1 DC与预后Inoshima等16分析132例非小细胞肺癌患者切除标本时发现，血管内皮细胞生长因子（VEGF）、微血管密度（WVD）、浸润的DC这三个因素均对预后有独立的影响作用；其中，VEGF水平与WVD水平成正相关，而与DC量成负相关；VEGF会抑制DC的成熟；VEGF含量增高及DC量降低提示预后不良，反之较好。2.2 临床应用时DC的回输途径及回输量DC回输途径已报道的有5种：静脉回输，淋巴管注射，真皮内注射，瘤体内多点注射，恶性胸腹水时胸腹腔注射。其中淋巴管途径可使DC直接到达淋巴细胞富集的淋巴结，引起混合性T淋巴细胞应答；瘤体内注射可避免体外抗原的不足，均是较好的思路。大量临床报道DC回输的细胞数一般每次106-108，低剂量的DC回输可增强抗肿瘤免疫，过量DC回输会导致T细胞耗竭而下调免疫功能，引发自身免疫病，抑制抗肿瘤免疫。 2.3 DC与前列腺癌西雅图Northwest Hospital等 17应用前列腺癌膜相关抗原（PSMA）的PSM-P1及PSM-P2负载DC对晚期前列腺癌进行期临床试验，结果，95例患者中有3例患者完全缓解（CR），25例患者部分缓解（PR），20例患者病情无变化（NC），47例患者疾病进展（PD），总有效率50%；其中19例激素抵抗性患者中有12例（63%）生存期长达600天，显著高于不治者（平均仅6个月）。Heiser等18采用自体前列腺癌特异性抗原（PSA）RNA转染DC诱导CTL治疗晚期前列腺癌，其期临床试验证实PSA-mRNA 转染DC治疗晚期前列腺癌安全、有效；期临床研究结果显示治疗的13例患者中6例PSA直线下降，3例在分子水平上证实循环中的肿瘤细胞被清除。这两篇报道均说明DC瘤苗用于临床治疗前列腺癌是合理、可行的。2.4 DC与恶性黑色素瘤Lau等19采用tyrosinase 368-376 及gp100作为抗原肽负载DC进行期临床试验治疗晚期恶黑，以1107，3107或1108静脉注射，2周1次，共1-2次；结果，治疗的16例患者中，1例CR，2例SD，2例产生混合反应（MR），无任何毒性反应发生。2.5 DC与肾癌Marten等20采用自体肿瘤细胞冻融抗原脉冲DC制备DC瘤苗的、期临床试验治疗了15例晚期肾癌患者，结果1例PR，7例SD，7例PD；3例DTH反应阳性，未见不良反应发生。Kugler等21采用电融合技术将自身肿瘤细胞与同种异体DC融合，产生融合细胞表达肿瘤抗原并具有DC的共刺激能力，采用这种瘤苗对17例晚期肾癌患者进行治疗；结果4例CR，2例PR，1例MR，2例SD。4例CR中3例患者在注射2次后病灶消退，直至第21个月仍未检测到肿瘤的复发或转移。杂交瘤苗注射后典型的表现为第一次注射后的第一个星期内肿瘤开始缩小，转移灶消失；但对大面积病灶患者效果略差。提示肿瘤细胞与DC融合制成的杂交瘤苗极具应用价值及治疗前景。2.6 DC与胃肠道肿瘤黑色素瘤抗原编码基因（MAGE）在恶性黑色素瘤及胃肠道肿瘤中选择性高表达。常规方法体外培养获得DC经MAGE-3抗原肽致敏DC后体内注射治疗12例患者，其中6例胃癌，3例食道癌，3例肠癌；结果检测的8例患者中有4例体内产生MAGE特异性CTL；7例患者肿瘤标记物下降；3例病灶缩小22。绝大多数胃肠道肿瘤及肺癌患者血浆CEA水平增高，因而CEA亦可作为靶点而用于免疫治疗。Itoh23等采用CEA652负载DC制成瘤苗治疗了10例消化道晚期肿瘤患者,结果未见任何毒副作用,2例DTH反应阳性，并持时长达6-9个月；说明CEA652致敏DC制成DC瘤苗可用于CEA阳性的肿瘤患者。2.7 DC 与妇科肿瘤手术及放疗难以控制的晚期宫颈癌患者，化疗亦未见明显疗效，一年存活率仅10-15%。Santin等24采用HPV-18E7负载DC治疗1例晚期宫颈癌伴肺转移患者，结果患者病灶稳定长达21个月，生活质量明显提高。2.8 DC与乳腺癌Brossart等25用自体来源的DC经HER-2/neu或MUC1来源的多肽脉冲DC制成瘤苗，治疗了10例晚期乳腺癌及卵巢癌患者；结果，5例患者诱导出明显的特异性CTL反应，且持时长达6个月；其中经MAGE-1致敏的DC 几次注射后可诱导出对CEA、MAGE-3特异的CTL反应。说明在乳腺癌及卵巢癌患者体内，用单一抗原致敏的DC体内注射后可诱导产生针对多种肿瘤抗原的免疫应答反应。2.9 DC与血液肿瘤Timmerman等26采用肿瘤特异性免疫球蛋白（Id）-KLH脉冲DC治疗了35例恶性淋巴瘤患者,结果:10例初治患者中8例产生了抗Id的T细胞应答反应,2例CR，这2例无病生存时间长达44月及57月；1例PR，持时12月；1例分子水平缓解，持时达75+月。25例化疗无效患者经DC瘤苗治疗后4例PR，16例SD，6例PD。说明DC瘤苗可用于血液肿瘤。2.10 DC与中枢神经系统肿瘤Ashley等27采用B16肿瘤细胞提取物或B16总RNA转染小鼠源性DC治疗B16/F10鼠颅内肿瘤时发现这两种瘤苗均可使小鼠产生保护性免疫应答反应，中位生存期明显延长，达到30天甚至80天以上；而采用其它肿瘤细胞提取物制备的DC瘤苗对照组的生存期仅16天。治疗组治疗后病理证实颅内肿瘤发生了大面积的坏死、出血、炎症细胞的浸润，而对照组却无此现象发生。这一资料说明临床上DC瘤苗可以用于治疗中枢神经系统肿瘤。3 结语DC在诱导机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用,DC瘤苗安全无毒，是近10年来肿瘤免疫治疗研究领域的一大热点。然而采用何种肿瘤抗原形式、采取何种方式负载DC以诱导出最佳抗肿瘤免疫应答效应仍有待进一步基础及临床研究证实；DC瘤苗与其他效应细胞如CIK细胞、TIL细胞间的相互关系也是非常值得研究的课题。总之，DC瘤苗在抗肿瘤免疫治疗中极具研究前景及应用价值。参考文献: 1 Basak SK, Harui A, Stolina M,et al. 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